Для многих органических растворителей интенсивность флуоресценции возрастает при удалении растворенного кислорода, являющегося сильным гасителем флуоресценции. Кислород может быть удален пропусканием инертного газа (азот или гелий) через испытуемый образец.
Применение флуориметрии в фармацевтическом анализе
Идентификация. Характер спектра флуоресценции, а также цвет излучаемого света специфичны для флуоресцирующих веществ. Поэтому флуоресценция может быть применена для идентификации веществ.
Количественный анализ. При количественных определениях интенсивность флуоресценции испытуемого образца сравнивают с интенсивностью флуоресценции стандартного образца флуоресцирующего вещества известной концентрации, измеренной в идентичных условиях на одном и том же приборе.
Методика. Растворяют испытуемый образец в растворителе или в смеси растворителей, указанных в частной фармакопейной статье. Переносят раствор в кювету флуориметра и освещают лучом возбуждающего света с длиной волны, указанной в частной фармакопейной статье.
Вначале в прибор помещают растворитель или смесь растворителей, используемых для растворения вещества, и устанавливают прибор на "ноль". Затем вводят стандартный раствор и устанавливают чувствительность прибора таким образом, чтобы замер был больше 50. Если повторное доведение чувствительности производится при изменении ширины щели, должна быть произведена переустановка "нуля" и интенсивность флуоресценции стандартного образца должна быть измерена вновь. Последним вводят раствор испытуемого образца неизвестной концентрации и замеряют показания прибора.
Рассчитывают концентрацию вещества в испытуемом растворе (C) по
формуле: x
I x C
x ст.
C = -----------,
x I
ст.
где:
C - концентрация вещества в стандартном растворе;
ст.
I - интенсивность света, испускаемого испытуемым раствором;
x
I - интенсивность света, испускаемого стандартным раствором.
ст.
Если интенсивность флуоресценции не прямо пропорциональна концентрации, измерение может быть произведено с использованием калибровочной кривой.
В некоторых случаях измерение может быть сделано относительно фиксированного стандарта (например, флуоресцентного стекла или раствора другого флуоресцентного вещества). В качестве стандартов могут быть использованы: раствор известной концентрации хинина в 0,05 М растворе серной кислоты или раствор флуоресцеина в 0,1 М растворе натрия гидроксида. В таких случаях концентрацию испытуемого образца следует определять с использованием предварительно полученной в тех же условиях калибровочной кривой.
12.5. СПЕКТРОСКОПИЯ ЯДЕРНОГО МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА
(ОФС 42-0046-07)
Вещества, ядра атомов которых имеют магнитные моменты, в постоянном магнитном поле поглощают энергию электромагнитных волн (радиочастотный диапазон) при определенном соотношении между величинами постоянного магнитного поля и частотой переменного поля (ядерный магнитный резонанс, ЯМР). Частота ню0 = омега0/2пи, при которой выполняется условие резонанса омега0 = гамма x B0 (гамма - постоянная, носит название "гиромагнитное отношение") называется резонансной частотой.
Магнитные моменты имеют изотопы ядер элементов с нечетным атомным весом (1H, 13C, 15N, 31P, 19F). Не имеют магнитных моментов ядра атомов с четным зарядом и четным атомным весом (12C, 16O).
Спектр ЯМР может быть получен двумя способами: или при непрерывном облучении образца слабым электромагнитным полем с изменяющейся частотой, в результате чего получается непосредственно спектр ЯМР (спектроскопия с непрерывным облучением), или при воздействии на образец короткого радиочастотного импульса с последующим Фурье-преобразованием отклика, представляющего собой сигнал свободной индукции, в спектр (импульсная спектроскопия).
В молекулах положение энергетических уровней, переходы между которыми
образуют спектр ЯМР, определяется величиной взаимодействия магнитных
моментов ядер с постоянным магнитным полем B и с магнитными моментами
лок
других ядер через посредство электронов молекулы (спин-спиновое
взаимодействие).
Электроны атомов уменьшают величину внешнего магнитного поля B0 в месте
нахождения ядра: B = B0 x (1 - сигма), сигма > 0, константа
лок
экранирования - безразмерная величина. Разница в резонансных частотах
сигналов, равная разнице в константах экранирования ядер, называется
химическим сдвигом сигналов (обозначается символом дельта, измеряется в
миллионных долях, м.д.). Спин-спиновое взаимодействие, характеризуемое
константой спин-спинового взаимодействия (обозначается символом J,
измеряется в герцах), приводит к образованию мультиплетов. Значения дельта
и J не зависят от величины постоянного магнитного поля. Количество
компонент в мультиплетах определяется спином ядра и количеством
взаимодействующих ядер.
Диапазон химических сдвигов сигналов ядер водорода не превосходит 20 м.д. Диапазон химических сдвигов сигналов других ядер измеряется сотнями м.д.
Ширина сигналов ЯМР (разница между частотами на полувысоте сигнала) веществ в растворах определяется временем поперечной релаксации T2, характеризующим время установления равновесия в системе спинов, а также неоднородностью магнитного поля. Определяемая этими величинами ширина сигналов ядер со спином 1/2 обычно не превосходит 1 Гц. Уширение сигналов происходит в результате обменных процессов или присутствием в молекуле ядер со спином большим 1/2.
Интенсивность сигнала ЯМР в спектре определяется избытком количества
ядер на нижнем энергетическом уровне. Отношение количества ядер N- и N+
соответственно на верхнем и нижнем энергетических уровнях определяется
фактором Больцмана: N-/N+ = exp(-мю B0/IkT), где: k - постоянная Больцмана,
n
мю - магнитный момент ядра, T - абсолютная температура, I - спин ядра (при
n
этом (мю B0/I << kT). Очень небольшая разница в энергиях между возбужденным
n
и основным состоянием ядер является основной причиной сравнительно низкой
чувствительности метода ЯМР. Уменьшение интенсивности сигналов также
связано со сравнительно большим временем нахождения системы ядер в
возбужденном состоянии и большим временем релаксации (постоянная,
характеризующая время релаксации обозначается символом T1).
Из ядер с естественным содержанием изотопов наиболее интенсивные сигналы дают ядра водорода. Частота, на которой выполняются условия резонанса для ядер водорода, называется рабочей частотой ЯМР спектрометра. Спектроскопия ЯМР на ядрах водорода и углерода 13C (естественное содержание 1,1%) наиболее часто используется в исследовании органических лекарственных веществ.
Широкополосные импульсные ЯМР-спектрометры позволяют получать спектры практически от всех элементов периодической системы.
Прибор. ЯМР-спектрометр для спектроскопии с непрерывным облучением состоит из магнита, генератора изменяющейся частоты, датчика, генератора радиочастоты и приемника, а также электронного интегратора и самопишущего потенциометра. Импульсные спектрометры, кроме того, имеют генератор импульсов и компьютер для преобразования интерферограммы отклика в спектр.
Рабочая частота спектрометра не должна быть меньше 60 МГц.
Если в частной фармакопейной статье не оговорено, то необходимо соблюдать следующие условия:
1) Разрешение должно быть 0,5 Гц или менее.
2) Амплитуда боковых сигналов, появляющихся при вращении образца, не должна превышать 2% от основного сигнала.
3) При количественных измерениях с использованием интегралов сигналов ни одно из пяти измерений не должно превосходить 2,5% от среднего значения.
4) Разрешение и отношение сигнал/шум следует измерять, используя соответствующие команды в пакете стандартных программ.
Метод. Растворенное вещество должно быть подписано и отфильтровано; раствор должен быть прозрачным. Перед регистрацией спектра фаза сигнала должна быть отрегулирована по возможности на поглощение.
Для растворов в органических растворителях химический сдвиг в спектрах 1H и 13C измеряется относительно сигнала тетраметилсилана (ТМС), положение которого принято за 0 м.д. Отсчет химических сдвигов ведется в сторону слабого поля (влево) от сигнала тетраметилсилана (дельта - шкала химических сдвигов). Для водных растворов в качестве эталона в спектрах ЯМР 1H используется 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфонат натрия (ДСС), химический сдвиг протонов метильной группы которого равен 0,015 м.д. Для спектров 13C водных растворов в качестве эталона используют диоксан (ДО), химический сдвиг которого равен 67,4 м.д.
В качестве растворителей используют легкоподвижные жидкости, в которых для уменьшения интенсивности сигналов растворителей атомы водорода заменены атомами дейтерия. При описании спектров необходимо указывать растворитель, в котором растворено вещество, и его концентрацию.
Химические сдвиги (м.д.) сигналов остаточных протонов растворителей имеют следующие значения: хлороформ - 7,26; бензол - 7,16; вода - 4,7; метанол - 3,35 и 4,8; диметилсульфоксид - 2,50; ацетон - 2,05; положение сигнала воды и протонов гидроксильных групп спиртов зависит от pH среды и температуры.
Для того чтобы избежать уширения сигналов при использовании смешанных растворителей, перед получением спектров необходимо выждать время для гомогенизации смеси растворителей, которое может составлять часы.
Для спектроскопии с непрерывным облучением амплитуда переменной частоты не должна быть большой, чтобы избежать насыщения сигнала. Наиболее интенсивный сигнал должен занимать почти всю ширину бланка. Кривая интеграла записывается поверх сигналов спектра.
В импульсных спектрометрах устанавливают следующие параметры: ширина спектра, время регистрации сигнала, длительность радиочастотного импульса, количество точек для Фурье-преобразования (спектральное разрешение) и количество накоплений сигнала свободной индукции.
Имеется ряд методик получения сигналов ЯМЕ, которые могут быть использованы при решении аналитических задач. В основе каждой из них используется определенная последовательность импульсов. Методики принято обозначать несколькими заглавными буквами латинского алфавита. Например, используемая часто методика COSY является сокращением словосочетания correlation spectroscopy. Обычные (одномерные) спектры получают воздействием на вещество одним радиочастотным импульсом, при завершении которого проводится считывание сигнала (свободная индукция) от ядер образца с последующим преобразованием сигнала свободной индукции в спектр (Фурье-преобразование).
Для слабых сигналов цикл возбуждение - считывание с накоплением сигнала повторяется многократно, чем достигается необходимое для анализа отношение сигнал/шум. Для количественных измерений цикл возбуждение - считывание повторяется через интервал времени, превышающим время релаксации T1 в несколько раз. Для измерения времени T1 следует использовать программу в пакете стандартных программ, прилагаемых к ЯМР-спектрометрам.
Наряду с одномерными в аналитических целях используются двумерные корреляционные спектры, получаемые методиками COSY (для ядер одного вида), HETCOR (для разных ядер) и др. В двумерных спектрах взаимодействие между ядрами проявляется в виде сигналов (перенос когерентности), называемых кросс-пиками. Положение кросс-пиков определяется значениями химических сдвигов двух взаимодействующих ядер.
Двумерные спектры предпочтительно использовать для определения состава сложных смесей и экстрактов, т.к. вероятность наложения сигналов (кросс-пиков) в двумерных спектрах существенно ниже, чем вероятность наложения сигналов в одномерных спектрах.
Для быстрого получения спектров гетероядер (13C, 15N и др.) применяются методики (HSQC, HMBC), которые позволяют получать на ядрах 1H спектры других ядер, используя механизмы гетероядерного взаимодействия.
Методика DOSY позволяет получать спектры индивидуальных соединений (спектральное разделение) в смеси без их физического разделения. Методика основана на различии в скоростях диффузии различных молекул.
Области применения. Многообразие структурной и аналитической информации, содержащейся в спектрах ЯМР, позволяет использовать метод ЯМР для установления подлинности и количественных определений.
1. Установление подлинности вещества. В спектрах ЯМР практически исключается совпадение даже нескольких сигналов от разных веществ. При заявлении спектра на подлинность желательно ограничиваться по возможности меньшим количеством сигналов. При описании спектров необходимо приводить значения химических сдвигов и мультиплетность сигналов, заявленных на подлинность. Следует указывать рабочую частоту спектрометра, т.к. от нее зависит вид спектра. По этой же причине не использовать формулировку "...такой же вид, как и на приведенном (в НД) спектре".
Для установления подлинности смеси веществ (экстрактов) эффективна двумерная ЯМР-спектроскопия. При описании двумерных спектров (фрагментов спектра), заявленных на подлинность, следует приводить значения кросс-пиков.
2. Определение количества посторонних примесей. При получении спектров ЯМР, как правило, легко достигается значение отношения сигнал/шум более 100, что позволяет использовать этот метод для определения в субстанции примеси в количествах, измеряемых процентами и долями процента.
3. Определение количества остаточных растворителей. Все растворители, содержащие атомы водорода и углерода, дают характерные сигналы в спектрах 1H и 13C ЯМР. Чувствительность метода ЯМР к сигналам растворителя весьма высокая.
4. Количественное определение относительного или абсолютного содержания лекарственного вещества (примеси). Содержание вещества (X%) определяется методом внутреннего стандарта, в качестве которого выбирается вещество, сигналы которого находятся вблизи сигналов анализируемого вещества, не перекрываясь с ними. Интенсивности сигналов анализируемого вещества и стандарта не должны существенно различаться. При выборе вещества-стандарта следует отдавать предпочтение не гигроскопичному, не образующему кристаллосольватов веществу.
К испытуемому образцу добавляют вещество-стандарт, проводят измерение площадей сигналов анализируемого вещества и вещества-стандарта. Вычисляют процентное содержание анализируемого вещества в испытуемом образце в пересчете на абсолютно сухое вещество (X%) по формуле:
X% = 100 x (S' /S') x (M x m /M x m) x (100/(100 - W)),
масс a ст a ст ст a
где:
S' - приведенное значение интегральной интенсивности сигнала,
равное измеренной интегральной интенсивности, деленной на количество
протонов в структурном фрагменте (для CH2 - измеренная площадь,
деленная на 2, для CH3 - деленная на 3 и т.д.);
M - молекулярная масса анализируемого вещества;
a
M - молекулярная масса стандарта;
ст
m - навеска испытуемого образца;
a
m - навеска вещества-стандарта;
ст
W - содержание влаги, в процентах.
В качестве веществ-стандартов можно использовать следующие вещества: малеиновая кислота (2H; 6,60 м.д., M = 116,07), бензилбензоат (2H; 5,30 м.д., M = 212,25), малоновая кислота (2H; 3,30 м.д., M = 104,03), сукцинимид (4H; 2,77 м.д., M = 99,09), ацетанилид (3H; 2,12 м.д., M = 135,16), трет-бутанол (9H; 1,30 м.д., M = 74,12).
При использовании в качестве стандартов веществ, молекулярная масса которых имеет небольшую величину, интервал времени между повторяющимися циклами импульсных последовательностей должен превосходить в несколько раз время релаксации T1 веществ-стандартов.
Мольная (X) и весовая (X) доля компонента i в смеси n веществ
моль масс
определяется по формулам:
S' M x S'
i X i i
X = ------------ i, масс = -----------------
i, моль j = n j = n S'
SUM S' SUM M x j
j = 1 j j = 1 j
X (%) = X x 100 и X (%) = X x 100.
i, моль моль i, масс масс
13. ОСМОЛЯРНОСТЬ (ОФС 42-0047-07)
Осмолярность характеризует создаваемое растворами осмотическое давление и является одной из важнейших характеристик инфузионных растворов. Растворы, равные по осмолярности 0,9% раствору натрия хлорида, называют изотоническими. Для изотонических растворов теоретически рассчитанные значения осмолярности находятся в пределах 239-376 мОсм/л.
На этикетках растворов для инфузий должно быть указано теоретическое значение их осмолярности. В случае, когда теоретическая осмолярность не может быть рассчитана, указывают среднее значение экспериментально определенной осмолярности для данного лекарственного средства. Полученные данные носят информационный характер и не являются показателем качества лекарственного средства.
Осмолярность - это характеристика растворов, выражающая их осмотическое давление через суммарную концентрацию кинетически активных частиц в единице объема раствора.
Кинетически активные частицы - это молекулы, ионы или ионные комплексы одного или нескольких растворенных веществ, свободно распределенные во всем объеме растворителя и обладающие способностью к хаотическому перемещению внутри раствора.
Теоретическая осмолярность может быть рассчитана по формуле:
m
C = ----- x n x 1000, (1)
осм. M
где:
C - осмолярность раствора, миллиосмоль на литр (мОсм/л);
осм.
m - содержание вещества в растворе, г/л;
M - молярная масса вещества;
n - суммарное число ионов, образующихся из одной молекулы растворенного
вещества в результате диссоциации (n = 1 для недиссоциирующих веществ;
n = 2, 3 для веществ, образующих при растворении соответствующее
количество ионов).
На практике количество частиц (n) несколько меньше теоретически рассчитанного и приближенно может быть описано формулой:
n = n x фи, (2)
o
где:
n - реальное количество частиц, образующихся при растворении
данного вещества;
n - теоретически рассчитанное количество частиц (п = 1, 2, 3...);
o
фи - молярный осмотический коэффициент, учитывающий взаимодействие
Между частицами в растворе и зависящий только от количества
растворенного вещества.
Коэффициент фи определяется экспериментально. Для многокомпонентных растворов его определение крайне затруднительно.
Осмолярность растворов, состоящих из нескольких компонентов, может быть определена как сумма осмолярностей всех компонентов.
Существующие инструментальные методы позволяют определить не осмолярность, а осмоляльность - концентрацию кинетически активных частиц на килограмм растворителя (мОсм/кг).
В отечественной практике принято выражать концентрацию инфузионных растворов как массо-объемную (в г/л), поэтому удобным представляется контролировать содержание кинетически активных частиц в миллиосмолях на литр (осмолярность), а не на килограмм (осмоляльность) раствора.
Различиями между значениями осмолярности и осмоляльности растворов с осмолярностью, близкой к осмолярности 0,7-1,1% раствора натрия хлорида или ниже, можно пренебречь (теоретическое значение осмотического давления 0,9% раствора натрия хлорида - 308 мОсм/л; экспериментальное значение -286 мОсм/л); для более концентрированных растворов (например, 10% раствора натрия хлорида) осмолярность может быть определена по формуле:
c(мОсм/л) = C(мОсм/кг) x ро, (3)
где ро - плотность раствора, кг/л.
Примечания
1. Расчет теоретических границ осмолярности проводится следующим образом: минимальное значение - осмолярность раствора, содержащего минимально допустимые по НД количества ингредиентов; максимальное значение - осмолярность раствора, содержащего максимально допустимые количества ингредиентов.
2. При наличии в растворе высокомолекулярного вещества за его молярную массу берется средняя молекулярная масса фракции.
3. Гидрокарбонаты при расчете осмолярности учитываются как соли одноосновной кислоты.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСМОЛЯРНОСТИ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ
(ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОСМОЛЯРНОСТЬ)
Для практического определения осмолярности могут быть использованы три метода: криоскопический, мембранная и паровая осмометрия.
1 осмоль на килограмм воды понижает точку замерзания на 1,86 град. C и понижает давление пара на 0,3 мм рт. ст. при температуре 25 град. C. Измерение этих изменений лежит в основе криоскопического метода и метода паровой осмометрии.
1. Криоскопический метод
Метод основан на понижении точки замерзания растворов по сравнению с точкой замерзания чистого растворителя. Данный метод нашел самое широкое практическое применение как достаточно универсальный и точный.
1. Определение осмолярности с использованием термометра Бекмана. Определение температуры замерзания проводят на установке, изображенной на рис. 13.1. (не приводится). Установка состоит из сосуда А диаметром 30-35 мм и длиной около 200 мм, куда помещается испытуемый раствор (или растворитель); верхняя часть сосуда расширена и закрывается пробкой с двумя отверстиями для погружения термометра Б и мешалки В; сосуд А вставлен в более широкую емкость (Г) так, что не касается ее стенок или дна; термометр также не должен касаться стенок или дна сосуда А; уровень охлаждающей смеси в емкости Г должен быть не ниже уровня испытуемого раствора в сосуде А. При проведении эксперимента раствор (или растворитель) должен прикрывать основной ртутный резервуар термометра. Температура охлаждающей смеси должна быть на 3-5 град. C ниже температуры замерзания растворителя (для бидистиллированной воды: от минус 3 до минус 5 град. C); контроль минусовой температуры осуществляется минусовым термометром Д с ценой деления 0,5 град. C. Состав охладительной смеси: лед + натрия хлорид кристаллический. Установку термометра Бекмана на криометрические исследования производят путем подбора количества ртути в основном резервуаре так, чтобы при замерзании чистого растворителя (бидистиллированной воды) мениск ртути в капилляре находился у верхней части шкалы измерения. При этом возможна регистрация ожидаемого понижения температуры замерзания водного раствора.
Рис. 13.1. Устройство прибора Бекмана
Рисунок не приводится.
Методика. Для определения температуры замерзания чистого растворителя пользуются следующим приемом: дают жидкости переохладиться (охлаждают без перемешивания), и когда термометр показывает температуру на 0,2-0,3 град. C ниже ожидаемой точки замерзания, перемешиванием вызывают выпадение кристаллов растворителя; при этом жидкость нагревается до точки замерзания. Максимальную температуру (средний результат трех измерений, отличающихся не более чем на 0,01 град. C), которую показывает термометр после начала выпадения кристаллов, регистрируют как температуру замерзания растворителя (T1).
В высушенный сосуд А наливают достаточное количество испытуемого водного раствора; определение точки замерзания проводят, как описано выше для чистого растворителя; средний результат трех опытов регистрируют как температуру замерзания испытуемого раствора лекарственного вещества (T2).
Осмолярность раствора рассчитывают по формуле:
(T2 - T1)
C = --------- x 1000 (мОсм/кг), (4)
осм. K
где: T2 - температура замерзания чистого растворителя, градусы Цельсия;
T1 - температура замерзания испытуемого раствора, градусы Цельсия (град. C);
K - криометрическая постоянная растворителя (для воды: 1,86).
2. Определение осмолярности растворов с использованием автоматического криоскопического осмометра. Данный вариант предусматривает применение автоматических осмометров, например, МТ-2, МТ-4 (производитель НПП "Буревестник", Санкт-Петербург). Испытуемый раствор (обычно 0,2 мл) помещают в стеклянный сосуд, погруженный в ванну с контролируемой температурой. Термопару и вибратор помещают под испытуемым раствором; температуру в ванной снижают до переохлаждения раствора. Включают вибратор и вызывают кристаллизацию воды в испытуемом растворе; выделившееся тепло поднимает температуру раствора до точки замерзания. По зафиксированной точке замерзания раствора рассчитывают осмолярность. Прибор калибруют с помощью стандартных растворов натрия или калия хлорида, которые перекрывают определяемый диапазон осмолярности (табл. 13.1).
Таблица 13.1
Стандартные справочные значения понижения
температуры замерзания и эффективности осмотической
концентрации водных растворов хлоридов натрия и калия
┌───────────────────────┬───────────────────────┬─────────────────────────┐
│ Аналитическая │ Понижение температуры │ Эффективная │
│ концентрация соли │ замерзания │ (осмотическая) │
│ ро, г/кг H2O │ дельта T, K │ концентрация m, │
│ │ зам │ эф │
│ │ │ ммоль/кг H2O │
├───────────────────────┴───────────────────────┴─────────────────────────┤
│ Растворы натрия хлорида │
├───────────────────────┬───────────────────────┬─────────────────────────┤
│ 5,649 │ 0,3348 │ 180 │
├───────────────────────┼───────────────────────┼─────────────────────────┤
│ 6,290 │ 0,3720 │ 200 │
├───────────────────────┼───────────────────────┼─────────────────────────┤
│ 9,188 │ 0,5394 │ 290 │
├───────────────────────┼───────────────────────┼─────────────────────────┤
│ 9,511 │ 0,5580 │ 300 │
├───────────────────────┼───────────────────────┼─────────────────────────┤
│ 11,13 │ 0,6510 │ 350 │
├───────────────────────┼───────────────────────┼─────────────────────────┤
Дата добавления: 2015-09-29; просмотров: 33 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |