Министерство здравоохранения и социального развития 22 страница

│Bacillus cereus, │Среда N 2, │Шероховатые │МПБ, │Морщинистая │Палочки с │

│var. mycoides 537 │T град. (36 +/- 1)│колонии с краем, │pH 7,8-8,0, │пленка; вся среда│закругленными │

│ │град. C, │сформированным из │18-20 ч │прозрачная, без │концами, │

│ │18-20 ч │переплетающихся │ │осадков │располагающиеся │

│ │ │волокон │ │ │отдельно или │

│ │ │ │ │ │цепочками, с хорошо│

│ │ │ │ │ │выраженной │

│ │ │ │ │ │грамположительной │

│ │ │ │ │ │окраской │

├──────────────────┼──────────────────┼──────────────────┼────────────┼─────────────────┼───────────────────┤

│Bacillus cereus, │Среда N 1, │Гладкие колонии с │МПБ, │Равномерное │Тонкие с │

│var. mycoides HB │T град. (36 +/- 1)│ровными краями и │pH 6,8-7,0, │помутнение │закругленными │

│ │град. C, │сферической │18-20 ч │бульона без │концами палочки, │

│ │18-20 ч │поверхностью │ │образования │располагающиеся │

│ │ │ │ │пленки и осадка │отдельно или │

│ │ │ │ │ │короткими │

│ │ │ │ │ │цепочками, с хорошо│

│ │ │ │ │ │выраженной │

│ │ │ │ │ │грамположительной │

│ │ │ │ │ │окраской │

├──────────────────┼──────────────────┼──────────────────┼────────────┼─────────────────┼───────────────────┤

│Bacillus pumilus │Среда N 1, │Мелкие серовато- │МПБ, │Равномерное │Тонкие, мелкие │

│NCTC 8241 │T град. (36 +/- 1)│голубого цвета │pH 7,2-7,4, │помутнение │палочки с │

│ │град. C, │колонии с │18-20 ч │бульона без │закругленными │

│ │18-20 ч │зазубренными │ │образования │концами, │

│ │ │краями и │ │пленки и осадка │располагающиеся │

│ │ │приподнятым │ │ │отдельно или │

│ │ │центром │ │ │короткими │

│ │ │ │ │ │цепочками, с хорошо│

│ │ │ │ │ │выраженной │

│ │ │ │ │ │грамположительной │

│ │ │ │ │ │окраской │

├──────────────────┼──────────────────┼──────────────────┼────────────┼─────────────────┼───────────────────┤

│Bordetella │МПА, │Мелкие, мутные, │МПБ, │Заметное │Одиночные, │

│bronchiseptica │pH 7,2-7,4 │белые, слегка │pH 7,2-7,4 │помутнение, серая│короткие, тонкие │

│ATCC 4617 │T град. (36 +/- 1)│выпуклые, │ │пленка, тягучий │палочки с хорошо │

│ │град. C, │фарфоровидные │ │осадок │выраженной │

│ │18-20 ч │колонии │ │ │грамотрицательной │

│ │ │ │ │ │окраской │

├──────────────────┼──────────────────┼──────────────────┼────────────┼─────────────────┼───────────────────┤

│Pseudomonas │МПА, │Широкие, │МПБ, │Заметное │Одиночные палочки │

│aeruginosa NCTC │pH 7,2-7,4, │расплывчатые, │pH 7,2-7,4 │помутнение, │либо короткие │

│2134 │T град. (36 +/- 1)│прозрачные с │ │толстая пленка, │цепочки с хорошо │

│ │град. C, │неровным краем │ │среда может │выраженной │

│ │18-20 ч │колонии │ │приобретать │грамотрицательной │

│ │ │ │ │желтовато-зеленую│окраской │

│ │ │ │ │окраску │ │

└──────────────────┴──────────────────┴──────────────────┴────────────┴─────────────────┴───────────────────┘

Шесть стерильных цилиндров единого размера и массы, высотой (10,0 +/- 0,1) мм и внутренним диаметром (6,0 +/- 0,1) мм, из нержавеющей стали или алюминия расставляют на поверхности засеянной среды на равном расстоянии друг от друга и от края чашки. Вместо цилиндров могут быть использованы лунки диаметром от 6 до 8 мм, сделанные в толще агара с помощью стерильного сверла, либо другого соответствующего приспособления.

В цилиндры или лунки каждой чашки вносят равные объемы рабочих растворов стандартного и испытуемого образцов. Основные растворы стандартных и испытуемых образцов готовят в стерильных растворителях с концентрацией 1 мг/мл. Затем из основных растворов в зависимости от применяемого варианта метода диффузии в агар (трехдозного или с построением стандартной кривой) готовят рабочие растворы трех или одной концентраций испытуемого образца и растворы трех или пяти концентраций стандартного образца.

Рабочие растворы испытуемых образцов готовят из основных растворов таким образом, чтобы их концентрации не имели существенных отличий от концентраций раствора стандартного образца.

Для уменьшения влияния колебаний во времени между закапыванием растворов, используемых в опыте, рекомендуется после их внесения выдерживать чашки при комнатной температуре в течение 1-2 ч. Затем чашки инкубируют при температуре (36 +/- 1) град. C в течение 16-18 ч.

Диаметры зон угнетения роста тест-микроба при помощи соответствующих приборов измеряют с точностью до 0,1 мм.

Определение антимикробной активности антибиотиков с использованием трехдозного варианта метода диффузии в агар. Для проведения испытания готовят три раствора стандартного образца (С1, С2, С3) и три раствора испытуемого образца (И1, И2, И3). Концентрации растворов, содержащих малую, среднюю и большую дозы, должны находиться между собой в кратном соотношении (1:2:4). При необходимости это соотношение может быть изменено. Концентрация раствора С2 должна быть близка к контрольной концентрации раствора стандартного образца, указанной в табл. 33.2.

Все растворы стандартного и испытуемого образцов вносят в цилиндры или лунки одной чашки Петри таким образом, чтобы растворы с большими концентрациями не соприкасались между собой. Предлагаемый вариант закапывания - С1И3С2И1С3И2.

Число чашек, используемых в каждом опыте, должно быть достаточным для обеспечения статистической достоверности результатов, но не менее 6 чашек.

Последовательность внесения растворов стандартного и испытуемого образцов в цилиндры или лунки каждой чашки должна быть следующей: первым вносят раствор с малой концентрацией стандартного образца (С1) и соответствующий раствор испытуемого образца (И1). Затем растворы со средней концентрацией (С2 и И2), последними вносят растворы с большими концентрациями (С3 и И3).

Расчет активности и дисперсионный анализ при использовании трехдозного

варианта метода диффузии в агар осуществляется в соответствии со статьей

"Статистическая обработка результатов химического эксперимента и

биологических испытаний". Растворы определенных концентраций стандартного

s u

(С) и испытуемого (И) образцов обозначены D и D соответственно.

Определение антимикробной активности антибиотиков с использованием стандартной кривой. Постановка опыта. В день постановки анализа из основного раствора готовят пять рабочих растворов стандартного образца С1, С2, С3, С4, С5 с концентрациями, увеличивающимися в геометрической прогрессии (Z), обычно в соотношении 1:1,25. Средняя концентрация (С3) является контрольной и должна быть близка к концентрации, указанной в табл. 33.2: концентрация С1 - наименьшая, С5 - наибольшая. Для исследования растворов каждой концентрации (кроме контрольной) используют по три чашки. Раствор контрольной концентрации С3 закапывают в три цилиндра (или лунки) каждой из взятых в опыт чашек, в три другие цилиндра (лунки) закапывают раствор одной из концентраций стандартного образца, чередуя его с раствором контрольной концентрации. Таким образом, для построения стандартной кривой используют 12 чашек.

Таблица 33.2

Тест-микроорганизмы и условия для биологического

определения активности антибиотиков

Антибиотик <1>	Тест- микроорганизмы <2>	Среда для определения активности <3, 4>	Количество среды на каждую чашку, мл <5>	Посевная доза <6>	Стандартный образец	Растворитель для приготовления растворов стандартного и испытуемого образцов	Срок годности основного раствора стандарт- ного образца при темпе- ратуре от 4 до 10 град. C, сут.	Контроль- ная концен- трация раствора стандарт- ного образца <7, 8> в мкг/мл акт. вещества или ЕД/мл
нижний слой	верхний слой	нижний слой	верхний слой	основной раствор	рабочий раствор
Ампициллин	Staphylococcus aureus 209 Р	N 11	N 7 + 0,1% глюкозы			40 млн. микробных клеток на 1 мл среды	Ампициллина тригидрат	Буфер N 1	Буфер N 1		1 мкг/мл
Амфотерицин B	Candida utilis ЛИА-01		N 16 + 0,1% глюкозы			3 мл рабочей взвеси на 100 мл среды	Амфотерицин B	Диметил- сульфоксид	Буфер N 1 <11>		0,5 мкг/мл
Бензилпенициллин	Staphylococcus aureus 209 P	N 11	N 7 + 0,1% глюкозы			40 млн. микробных клеток на 1 мл среды	Бензилпени- циллина натриевая соль	Буфер N 1	Буфер N 1		1 ЕД/мл
Гелиомицин	Bac. subtilis ATCC 6633	N 17	N 17			100 млн. спор на 1 мл среды	Гелиомицин	0,1 н. раствор натрия гидроксида <13>	0,1 н. раствор натрия гидроксида		4 мкг/мл
Гентамицин	Bac. pumilus NCTC 8241		N 9			50 млн. спор на 1 мл среды	Гентамицина сульфат	Буфер N 4	Буфер N 4		2 мкг/мл
Грамицидин C	Bac. cereus var. mycoides 537		N 13			8 млн. спор на 1 мл среды	Грамицидин C	Этиловый спирт 96%	Дистилли- рованная вода		100 мкг/мл
Дактиномицин	Bac. cereus, var. mycoides HB		N 14			20 млн. спор на 1 мл среды	Дактиномицин	Дистиллиро- ванная вода <9>	Буфер N 4		4 мкг/мл
Дигидрострепто- мицин	Bac. cereus, var. mycoides 537		N 9			20 млн. спор на 1 мл среды	Дигидро- стрептомици- на сульфат	Буфер N 3	Буфер N 4		2 мкг/мл
Диклоксациллин	Staphylcoccus aureus 209 P	N 11	N 7 + 0,1% глюкозы			40 млн. микробных клеток на 1 мл среды	Диклокса- циллина натриевая соль	Буфер N 1	Буфер N 1		8 мкг/мл
Доксициклин	Bac. sutilis, Var. Л2		N 6 +1% глюкозы			30 млн. спор на 1 мл среды	Доксициклина гидрохлорид	0,01 н. раствор хлористо- водородной кислоты	Буфер N 2		0,5 мкг/мл
Канамицин B <10>	Bac. subtilis ATCC 6633	N 12	N 8			100 млн. спор на 1 мл среды	Канамицина моносульфат	Дистиллиро- ванная вода	Буфер N 4		1 мкг/мл
Канамицин	Bac. pumilus NCTC 8241	N 8	N 8			40 млн. спор на 1 мл среды	Канамицина моносульфат	Дистиллиро- ванная вода	Буфер N 4		10 мкг/мл
Карбенициллин	Pseudomonas aeruginosa NCTC 2134		N 7			10 мл бульонной культуры на 100 мл среды	Карбеницил- лина динат- риевая соль	Буфер N 1	Буфер N 2		10 мкг/мл
Карминомицин	Bac. cereus, var. mycoides 537		N 5			100 млн. спор на 1 мл среды	Карминоми- цина гидрохлорид	Дистиллиро- ванная вода	Буфер N 4		15 мкг/мл
Леворин	Candida utilis ЛИА-01		N 16 +1% глюкозы			2-2,5 мл рабочей взвеси на 100 мл среды	Леворин	Диметил- сульфоксид	Диметил- сульфоксид до концен- трации 100 мкг/мл, а затем в буфере N 1 <11>	3(10)	0,5 мкг/мл
Линкомицин	Bac. subtilis ATCC 6633		N 8			100 млн. спор на 1 мл среды	Линкомицина гидрохлорид	Дистиллиро- ванная вода	Буфер N 4		100 мкг/мл
Метациклин	Bac. subtilis var. Л2		N 6 +1% глюкозы			30 млн. спор на 1 мл среды	Метациклина гидрохлорид	0,01 н. раствор хлористо- водородной кислоты	Буфер N 2		0,5 мкг/мл
Метициллин	Staphylo- coccus N 11 aureus 209 P		N 7 +0,1% глюкозы			40 млн. микробных клеток на 1 мл среды	Метициллина натриевая соль	Буфер N 1	Буфер N 1		20 мкг/мл
Микогептин	Candida utilis ЛИА-01		N 16 +1% глюкозы			2,5-3 мл рабочей взвеси на 100 мл	Микогептин	Диметил- сульфоксид	Диметил- сульфоксид до концен- трации 50 мкг/мл, а затем буфер N 4 <11>	3 <12>	1 мкг/мл
Мономицин	Bac. cereus, var. mycoides 537		N 9			20 млн. спор на 1 мл среды	Мономицин	Дистиллиро- ванная вода	3% раствор хлорида калия		2 мкг/мл
Неомицин	Bac. cereus, var. mycoides 537		N 9			20 млн. спор на 1 мл среды	Неомицина сульфат	Буфер N 4	Буфер N 4		4 мкг/мл
Нистатин	Candida utilis ЛИА-01		N 16 +1% глюкозы			3-3,5 мл рабочей взвеси на 100 мл среды	Нистатин	Диметил- формамид	Буфер N 3		20 ЕД/мл
Оксациллин	Staphylo- coccus Aureus 209 P	N 11	N 7 + 0,1% глюкозы			40 млн. микробных клеток на 1 мл среды	Оксациллина натриевая соль	Буфер N 1	Буфер N 1		4 мкг/мл
Окситетрациклин	Bac. subtilis, var. Л2		N 6 +1% глюкозы			30 млн. спор на 1 мл среды	Окситетра- циклина гидрохлорид	0,01 н. раствор хлористовод ородной кислоты	Буфер N 2		1 мкг/мл
Олеандомицин	Bac. cereus, var. mycoides HB		N 9			20 млн. спор на 1 мл среды	Олеандомици- на фосфат	Буфер N 3	Буфер N 4		4 мкг/мл
Оливомицин	Bac. subtilis АТСС 6633	N 11	N 18			10 млн. спор на 1 мл среды	Оливомицин- кислота	Стандартный образец в этиловом спирте из расчета 5 мг в 1 мл, затем буфер N 1, испытуемый образец в дистиллиров анной воде	Буфер N 1		2 мкг/мл
Полимиксин B	Bordetella Bronchiseptica АТСС 4617		N 15			40-60 млн. микробных клеток на 1 мл реды	Полимиксин B сульфат	Буфер N 3	Буфер N 5		100 ЕД/мл
Полимиксин M	Bordetella Bronchiseptica АТСС 4617		N 15			40-60 млн. микробных клеток на 1 мл среды	Полимиксин M сульфат	Буфер N 3	Буфер N 5		100 ЕД/мл
Рифампицин	Bac. subtilis АТСС 6633		N 10 +0,1% глюкозы			40 млн. спор на 1 мл среды	Рифампицин	1 мл диметил- формамида на 10 мг навески, затем дистиллиро- ванная вода	Буфер N 3		5 мкг/мл
Рубомицин	Bac. cereus, var. mycoides 537		N 5			10 млн. спор на 1 мл среды	Рубомицина гидрохлорид	Дистиллиро- ванная вода	Буфер N 4		20 мкг/мл
Сизомицин	Bac. pumilus NCTC 8241	N 12	N 8			50 млн. спор на 1 мл среды	Сизомицина сульфат	Буфер N 4	Буфер N 4		2 мкг/мл
Стрептомицин	Bac. cereus, var. mycoides 537		N 9			20 млн. спор на 1 мл среды	Стрептомици- на сульфат	Буфер N 3	Буфер N 4		2 мкг/мл
Тетрациклин	Bac. subtilis var Л2		N 6 + 1% глюкозы			30 млн. спор на 1 мл среды	Тетраци- клина гидрохло-рид	0,01 н. раствор хлористо- водородной кислоты	Буфер N 2		2 мкг/мл
Феноксиметилпе- нициллин	Staphylococcus aureus 209 P	N 11	N 7 + 0,1% глюкозы			40 млн. микробных клеток на 1 мл среды	Феноксиме- тилпеницил- лин	Буфер N 1	Буфер N 1		1 ЕД/мл
Флоримицин	Bac. subtilis ATCC 6633		N 8			20 млн. спор на 1 мл среды	Флоримицина сульфат	Дистиллиро- ванная вода	Буфер N 4		10 мкг/мл
Фузидин	Bac. cereus, var. mycoides HB		N 10 + 1% глюкозы			50 млн. спор на 1 мл среды	Фузидиевая кислота	Стандартный образец - в этиловом спирте из расчета 10 мг/мл, затем буфер N 4; испытуемый образец - в буфере N 4	Буфер N 3		5 мкг/мл
Цефалексин	Bac. subtilis ATCC 6633	N 11	N 7 + 0,1% глюкозы			100 млн. спор на 1 мл среды	Цефалексин	Буфер N 1	Буфер N 1		5 мкг/мл
Цефалотин	Bac. subtilis АТСС 6633	N 11	N 7 + 0,1% глюкозы			40 млн. спор на 1 мл среды	Цефалотина натриевая соль	Буфер N 1	Буфер N 1		0,5 мкг/мл
Хлортетрациклин	Bac. subtilis, var. JI2		N 6 + 1% глюкозы			30 млн. спор на 1 мл среды	Хлортетра- циклина гидрохлорид	0,01 н. раствор хлористовод ородной кислоты	Буфер N 2		1 мкг/мл
Эритромицин	Bac. cereus, var. mycoides HB		N 9			20 млн. спор на 1 мл среды	Эритромицин	1 мл этилового спирта на 10 мг навески, затем буфер N 4 до 1000 ЕД/мл	Буфер N 4		2 мкг/мл

Дата добавления: 2015-09-29