Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 3.1. Характеристика больных.
Больные с МЭХД были распределены в четыре основные группы:
1. Больные МЭХД с семейной формой наследования заболевания. К этой группе были отнесены одиннадцать семей с МЭХД, всего 47 человек, из них 28 больных. На рис. 5 представлены родословные семей с обозначением пробандов, которые были протестированы на предмет выявления точковых мутаций в ходе ЗБСР-анализа и анализа гетеродуплексов. Помимо ДНК из периферической крови, у пробандов 3 и 4 из семьи 3, а также у пробанда 12 из семьи 11 в исследование были взяты образцы операционного материала.
2. Больные МЭХД со спорадической формой заболевания. Вторая группа наиболее многочисленная и объединяет 22 больных, которые в тексте обозначены как пробанды с 13 по 34. У восьми пробандов (18, 19, 21, 22,23, 26, 31, 34), помимо ДНК из лимфоцитов, исследовалась ДНК из операционного материала.
3. Больные МЭХД с экзостозами, претерпевшими злокачественную трансформацию (в хондросаркому или остеогенную саркому). Эта группа представлена тремя больными МЭХД, у двоих произошла трансформация экзостоза в хондросаркому (проб. 36, проб. 37), у одного - в остеобластому (проб. 35).
4. В четвертой группе исследовали ДНК из крови и операционного материала 9 больных со спорадическими злокачественными новообразованиями. Из них у четырех определена остеогенная саркома (проб. 38, 40, 41, 42), у двоих - остеогенная саркома с выраженным хондрокомпонентом (проб. 39, 44), у троих - хондросаркома (проб. 43,45, 46).
Такая классификация основана на различиях в подходах при детекции мутаций у больных. Подробно эти различия будут рассмотрены ниже.
Таким образом, в работе было обследовано 46 больных, у 25 из них помимо ДНК из периферической крови, исследовали ДНК из операционного материала.
Семья 1.
|
Семья 2. Семья 3. |
Семья 4. |
|
Семья 5. Семья 6. |
Семья 7. Семья 8. |
|
Семья 9. |
Семья 10. |
Семья 11. |
Рис. 5. Родословные семей с МЭХД.
3.2. Стратегия поиска мутаций в генах ЕХТ1 и ЕХТ2 в различных группах больных.
При исследовании первой группы больных, а именно семей с наследственной формой заболевания, на первом этапе проводили анализ высокополиморфных маркеров в семьях в целях определения гаплотипа для выявления сцепления заболевания с хромосомой 8 либо 11, на которых картированы гены ЕХТ1 и ЕХТ2 соответственно. После установления сцепления проводилось тестирование экзонов выявленного гена с использованием БЗСР- анализа и анализа гетеродуплексов. Если сцепление выявить не удавалось, тестировали оба гена. Для исключения или подтверждения больших перестроек в районах локализации генов ЕХТ1 и ЕХТ2 проводили блот-гибридизацию гидролизованной геномной ДНК (использовали ферменты рестрикции Нтсй11, Тад\ и ЕсоШ) с рядом ДНК-зондов. Один из ДНК-зондов представлен смесью очищенных в полиакриламидном геле амплифицированных экзонов гена ЕХТ1 для выявления перестроек затрагивающих этот ген. Для исследования области локализации гена ЕХГ2 использовался клон кДНК Ш4096, содержащий значительную кодирующую часть гена и фрагмент З'нетранслируемого района. Для анализа предположительно регуляторного района транскрипции гена ЕХТ1 был использован ранее клонированный нами ДНК-зонд 49С2Н14.
Наиболее трудоемкой для исследования является вторая группа больных со спорадической формой заболевания. В этой группе тестировали оба гена с использованием БЗСР-анализа и анализа гетеродуплексов, а также проводили блот-гибридизацию с указанными ранее ДНК-зондами. Для больных, у которых был в наличие операционный материал, проводили анализ состояния зиготности локусов 8q24.1 и 11р12. При выявлении потери гетерозиготности (ПГ) в материале экзостоза в определенном районе тестировали ген, локализованный в этом же районе.
При исследовании третьей и четвертой группы больных - больные МЭХД с экзостозами, претерпевшими злокачественную трансформацию и больные со спорадическими формами злокачественных новообразований - в первую очередь проводили анализ состояния зиготности локусов 8q24.1 и lip 12 с использованием высокополиморфных ДНК-маркеров D8S67, D8S522, D8S592, D11S903, D11S1319. Такой подход основывается на накопленных к настоящему моменту знаниях о функции и возможной роли генов ЕХТ1 и ЕХГ2 как генов- супрессоров опухолевого роста. Согласно 2-х ударной модели канцерогенеза, предложенной Knudson в 1971 году, предполагается, что для перехода нормальной клетки в опухолевую необходимо два последовательных мутационных события. Первым событием является мутация, приводящая к образованию клетки, которая обладает повышенным риском возникновения опухоли. Такие мутации могут возникать как в соматических, так и в половых клетках. Вторым событием, происходящим в соматической клетке, является мутация в неповрежденном аллеле гена и превращение клетки в злокачественную. В связи с этим можно предположить, что у больных 3 группы с экзостозами, претерпевшими злокачественную трансформацию, процесс озлокачествления начался в клетках экзостоза, то есть в клетках с уже поврежденным одним аллелем одного из генов ЕХТ в результате соматической мутации в нормальном аллеле. Соматическая мутация может быть точковой, однако чаще происходит потеря всей хромосомы, что, как правило, выявляется при исследовании злокачественных новообразований. Аналогичный подход был осуществлен и для больных со спорадическими формами злокачественных образований. После выявления потери гетерозиготности по тому или иному локусу, проводилось тестирование экзонов соответствующего гена методом SSCP-анализа для выявления терминальной или соматической мутации, являющейся первым событием в 2-х ударной модели Knudson, в результате которого в последствие началось развитие злокачественной опухоли. Помимо этого, также как и в других группах, для обнаружения структурных перестроек в районах локализации генов ЕХТ1 и ЕХТ2, проводили блот-гибридизацию с указанными ранее зондами.
Поиск точковых мутаций в генах ЕХТ1 и ЕХТ2 проводился с помощью методов: SSCP-анализа и анализа гетеродуплексов. SSCP-анализ наиболее
чувствителен при размере фрагментов, не превышающих 300 п.н. В связи с этим были сконструированы синтетические олигонуклеотидные праймеры для кодирующей части генов ЕХТ1 и ЕХТ2, а также для их промоторной области (рис. 6). Ген ЕХТ1 состоит из 11 экзонов, причем первый экзон составляет 1735 п.н., поэтому для него были сконструированы 7 пар праймеров для семи перекрывающихся между собой фрагментов. Ген ЕХТ2 состоит из 15 экзонов, первые два экзона 1а и 1Ь принимают участие в альтернативном сплайсинге и представляют собой 5'нетранслируемый район, поэтому они исключены из общего скрининга. Второй экзон достаточно велик, составляет 566 п.н., поэтому для этого района были сконструированы две пары праймеров. В случае, если продукты амплификации превышали 300 п.н. для проведения БЗСР-анализа амплификаты подвергались обработке ферментами рестрикции для увеличения чувствительности метода. Последовательности праймеров, условия проведения ПЦР и ферменты рестрикции приведены в таблице 1.
|
Рис. 6. Экзон-интронная структура А. Гена ЕХТ1 и В. Гена ЕХТ2. Кодирующая область генов обозначена черным.
Таблица 1. Праймеры для скрининга мутаций в генах ЕХТ1 и ЕХТ2.
|
E1-5F: TGATTCAGCATCATCCTTTCC E1-5R: TCAGGGTAAACAAGGGCAAC | 58/1.5 |
| |
E1-6F: CTTTCCAGCGCTTCATTAGG E1-6R: GTAAGGAGGGCGGAGTCTCT | 58/1.5 |
| |
21-7F: GGCGTACATAAATACATCCTACCCC E1-7R: CCAAGGCTCCACAGTGGTTCC | 64/6.0 |
| |
31-8F: GGGAGAATTGTCCTGAAAAC E1-8R: ACCTGCTGCTCCTCAGG | 54/2.0 |
| |
E1-9F: CACTGTTGATTGCTTGTTTGGC Ï1-9R: GTAAAGTCTGTAAGAGACATGTCC | 58/5.0 |
| |
Î1-10F: GATAATGGCCCCCTGTGA il-lOR: CCAGTGAGTGAAGCAAGGAA | 58/1.5 |
| |
31-1 IF: TTCTGCAATGTTTCCATCT il-llR: AAGCCGGATTCCTCAA | 50/1.5 |
| |
ГЕН EXT2 | |||
ïXT2-prF: GCCCCTCGCTCGCTGCTCGCC ïXT2-prR: GCGGAGGGCGGAGGGCGGGTC | 70/7.0 |
| |
Î2-2(1)F: AAGTGTCATTTGCCATCCTA < 2-2(1)R: TCCACGTACTTTTTCAGAGC | 54/1.5 | TaqI | |
•2-2(2)F: TGACTGGAATGTAGAGAAGC Í2-2(2)R: TTCCCTTTAGTTCCCTGAGG | 53/1.5 | Taq I | |
Í2-3F: GTTGACACATTAATTCTCCCA Í2-3R: GAACAAAATGATCTTGAACCC | 55/2.5 |
| |
Í2-4F: GTAATTCCTGTTCCTCTCCAC Î2-4R: TTGCTTTGATGCCCACCAC | 57/1.5 |
| |
Í2-5F: GCAATTTTCCAATCACCTG)2-5R: CCTGAGCCTTTGCGAGAGG | 54/1.5 |
| |
2-6F: CTAGTTTGTAATCTCTTGCCTCT;2-6R: TACGCAGAACCACTAATGTAGAG | 55/5.0 |
|
Е2-7Р: ОАТОТТСТТТСТССТТСте Е2-711: САТТААТТТССТТТСОТТТ | 50/2.5 | НрЫ | |
Е2-8Б: ТСТАСТТТТСССАСТСТСТСТС Е2-8Е: ТТССТТССАСССАСССТСАС | 59/2.5 |
| |
Е2-9Р: СТСАОССАТАТТетТАСАОС Е2-9Я: ТСАОАААТСОТАТТССТАТТСА | 54/2.5 | Нра II | |
В2-10Р: ТСАТССТТТТАСТАСТТТАТСТС В2-1011: САССТТТТСОАСТСТАСТСОА | 56/2.5 | Тщ\ | |
32-1 И7: ОААТОСТТОСТСТСТСААТТСОО 32-11 Я: ТСТСТСАОТТТТСТСАССТТССС | 55/4.0 |
| |
22-12Р: СТАААОООААСТССТАТТТТТС 32-1211: ААТСТСАССОСАТСААТСАТА | 54/1.5 | БаиЗА1 | |
32-1ЗБ: СТССТТОАСАСШАСАОССАОО 12-13Я: ТАОАОАТСАОАСОСТААООСОС | 58/4.5 |
| |
}2-14Б: ТТССТОТТАТСТСТСААССТС £2-14К: САСССТТААССТАСТАСТСТС | 56/1.5 | Бёе! |
При выявлении аномальных сигналов в ходе проведения Б8СР-анализа и анализа гетеродуплексов, образец фрагмента ДНК подвергали очистке в полиакриламидном геле и проводили прямое секвенирование для выяснения изменений в последовательности ДНК, лишь после этого делалось заключение либо о наличие мутации в данном образце, либо о выявлении полиморфного аллеля. В случае выявления миссенс-мутации для исключения полиморфизма тестировали 30 неродственных индивидов. Для подтверждения выявленного изменения проводили рестриктный анализ, если в результате мутации появлялся или исчезал сайт узнавания какого-либо фермента рестрикции.
3.3. Исследование больных с наследственной формой
МЭХД.
3.3.1. Анализ полиморфных ДНК-маркеров в семьях с МЭХД.
Поскольку МЭХД является генетически гетерогенным заболеванием, было целесообразным провести определение гаплотипа в семьях с наследственной формой заболевания. В настоящее время известно три основных локуса, связанных с развитием МЭХД: 8q24.1, lip 11.2 и 19р 13.1. Поскольку целью данной работы было определеление мутаций в генах ЕХТ1 и ЕХТ2, расположенных в районах 8q24.1 и lip 11.2, соответственно, был использован ряд высокополиморфных ДНК-маркеров, картированных в этих районах. При выборе ДНК-маркеров предпочтение отдавалось маркерам, фланкирующим область локализации генов ЕХТ, учитывался также показатель гетерозиготности и количество описанных для каждого маркера аллелей. Таким образом, для исследования были выбраны следующие ДНК-маркеры: высокополиморфный СА-повтор D8S522, картированный на расстоянии 600 т.п.н. дистальнее гена ЕХТ1, тетрануклеотидный (GATA)n повтор D8S592, расположенный на расстоянии 650 т.п.н. проксимальнее гена ЕХТ1, тетрануклеотидный (СТТТ)п/(ССТТ)п повтор D8S67, картированный на расстоянии в 60 т.п.н. от 3' конца гена ЕХТ1 и два локализованные на хромосоме 11 СА-повтора: D11S903 и D11S1319. Последовательность праймеров, условия амплификации и длина ПЦР- продукта приведены в таблице 2.
Таблица 2.
|
088522Р: ОААААСААААСАООСТСС 08852211: ТОАССАААСААСТАОАСАСС | 203-217 | 55/2.0 |
Б88592Б: Т АОАТАОАТв АТОТГСТТОТГОАТО Б88592К: ОАСТОААТАТАТОТССТОТТООС | 149-156 | 55/1.5 |
Б118903Р: ААСАСТТСОАТОТТССТТСС 011890311: АОСТОАОАОСОСАТОТАТАА | 99-109 | 55/2.0 |
Б1181319Р: ОАААТГСССТАСТООАААСА Б1181319К: АААТСТСАСАТТТОСАТТСА | 182-200 | 52/2.0 |
При составлении гаплотипов для простоты маркеры 08867, Б88522, 088592, Б118903 и Б1181319 были обозначены А, В, С, О и Е соответственно. В каждой семье самый тяжелый аллель обозначался как первый и т.д.
Проведенный анализ позволил установить сцепление! заболевания с хромосомой 8 в семьях 3, 6 и 9 (Рис. 7, 8, 9.). В остальных семьях этот анализ оказался неинформативным.
Таким образом, было установлено, что поиск мутаций в семьях 3, 6 и 9 целесообразно проводить в гене ЕХТ1. Образцы ДНК больных из семей 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 и 11 тестировались по обоим генам.
А1 А2 А1 А2 В2В1 В2В1 С1 С2 С1 С2 БЮ1 Б2 Б1 Е1 Е2 Е1 Е2 |
Семья 6.
|
Семья 3.
|
а2 а2 в1 в1 сз с2 Б1 В2 е1 е2 |
а1 аз в1 в2 с2 сз 01 е1 е1 |
А1 а2 В1 в1 С1 с2 Б1 т е1 е2 |
А1 а2 В1 вз С1 СЗ т т е2е2 |
А1 а1 В1В1 С1С2 ОЮ1 е1 е1 |
|
Семья 9.
|
|
аз аз АЗА5 в2 в2 В1 в2 с2с1 с1с2
т т б1 бз
АЗ а6 В1 в4 С1 с2 б1бз е1 е1 |
АЗ аз В1 в2 С1 с1 Б1 Б2 е1 е2 |
АЗ аз В1 в2 С1 с2 т бз е2 е1 |
Рис. 7. Гаплотипы трех семей с МЭХД. |
е2е2 е1е1
А) |
г\
|
|
|
285 п.н.
.щ—260 п.н. >. — 254 п.н.
|
В) |
/ "V
п.н.
|
А 286
.254 <«250
-4 236
Рис. 8. Анализ семей с МЭХД с использованием маркера Б8867: А) семья 6, В) семья 9. Электрофорез в 6% ПААГ, радиоактивная детекция.
1Пр.З
|
Пр.4
|
|
|
|
|
2.
|
Пр.4( |
Пр.З |
|
Рис. 9. Анализ полиморфных маркеров в семье 3. 1)маркер Б8867, 2)маркер Б88592. Электрофорез в 10% ПААГ, нерадиоактивная детекция.
3.3.2. Поиск мутаций в генах ЕХТ1 и ЕХТ2 у больных с наследственной формой заболевания.
В скрининг по выявлению мутаций в генах при помощи ББСР-анализа и анализа гетеродуплексов был взят образец ДНК одного пробанда из каждой семьи. После выявления аномального сигнала анализировали ДНК других больных и здоровых членов семьи. Окончательный вывод о природе аномального сигнала делался после секвенирования интересующего образца.
В результате проведенного анализа мутации в гене ЕХТ1 выявлены в восьми семьях, все мутации установлены при помощи ББСР-анализа, в гене ЕХТ2 выявлены две мутации - одна в результате ЗБСР-анализа в семье 4, другая - в семье 1 в результате блот-гибридизации с ДНК-зондом 1114096. Все мутации описаны впервые. Точковые мутации приведены в таблице. Далее представлено подробное описание мутаций.
Семья 1.
В семье 1 больны отец и ребенок. В ходе проведения БЗСР-анализа и анализа гетеродуплексов кодирующей части генов ЕХТ1 и ЕХТ2 каких-либо изменений подвижности однонитевой ДНК либо образования гетеродуплексов выявлено не было. Однако, при проведении блот-гибридизации зонда кДНК Ш4094, который несет значительную часть кодирующей области гена ЕХТ2, с ДНК пробанда 1, гидролизованной по Нтсй11, выявлен атипичный тяжелый сигнал 5.5 т.п.н. наряду с нормальной гибридизационной картиной (сигналы 5.0 т.п.н., 3.8 т.п.н., З.б.т.п.н., З.О.т.п.н.) что может свидетельствовать о делеции около 10 т.п.н., затрагивающей один аллель гена ЕХТ2 (Рис. 30). Именно поэтому не удавалось выявить мутацию на уровне тестирования экзонов, очевидно, что выявленная перестройка и является причиной заболевания в семье 1.
Семья 2.
Была обследована семья 2, состоящая из трех человек. Больна мать и ребенок. При анализе ДНК больного ребенка методом ББСР был обнаружен фрагмент однонитевой ДНК с аномальной подвижностью в первом экзоне гена ЕХТ1. При тестировании соответствующего фрагмента ДНК из периферической
крови больной матери выявлен аналогичный аномальный сигнал, в то время как у здорового отца он отсутствовал. В результате секвенирования определена инсерция двух нуклеотидов ТТ в позиции 742 нуклеотидной последовательности, что приводит к сдвигу рамки считывания и преждевременной терминации синтеза белка - образованию стоп-кодона в 252
позиции белковой последовательности (Рис. 10).
|
Нормальная последовательность: AGG АСА GGA GGG GAG AGG GGG ITT TTG AAG
1 экзона гена |
R T G G E R G F L К Мутантная последовательность: AGG АСА GGA GGG GAG ATT GGG GGT TTT TGA R T G G E / G G T *
Рис. 10. Результат SSCP-анализа и прямого ЕХТ1 в семье 2.
Семья 3.
В семье 3 больны два ребенка и мать, причем наблюдается нарастание симптомов заболевания у детей. Мать не испытывает больших неудобств в связи с заболеванием, экзостозы у нее были выявлены при рентгенологическом исследовании по причинам, не связанным с МЭХД, в то время, как у детей экзостозы активно растущие, особенно тяжелое течение заболевания наблюдается у пробанда 3. В исследование взяты образцы операционного материала пробанда 3 и пробанда 4, причем у пробанда 3 анализировали ДНК из двух различных экзостозов, удаленных с разных конечностей в разное время.
При анализе полиморфных ДНК-маркеров Б88522, Б88592 и Б8867 установлено, что причина заболевания связана с изменениями в гене ЕХТ1 (Рис.7).
|
При анализе гетерозиготности по микросателлитному маркеру 08867, расположенному в непосредственной близости от 3' конца гена ЕХТ1, выявлена потеря гетерозиготности в материале одного из экзостозов пробанда 3 (Рис. 11). Логично предположить, что данный экзостоз мог претерпеть злокачественную трансформацию. Может оказаться, что именно активно растущие экзостозы наиболее подвержены процессу озлокачествления.
В ЩШШя ^ И^^^Н ^ '4
1 2 3 4 5
Рис. 11. Анализ состояния зиготности гена ЕХТ1 по маркеру Б8867: 1 - пробанд 4 (кровь), 2 - пробанд 4 (экзостоз), 3 - пробанд 3 (кровь), 4 - пробанд 3 (экзостоз I), 5 - пробанд 3 (экзостоз II).
При проведении анализа гетеродуплексов и SSCP- анализа экзонов, как гена ЕХТ1, так и гена ЕХТ2, выявить каких-либо изменений в семье 3 не удалось. В результате блот-гибридизации с ДНК-зондами для генов ЕХТ1 и ЕХТ2 так же каких-либо перестроек выявлено не было. В связи с этим был проведен анализ состояния района, расположенного со стороны 3'конца гена ЕХТ1, для чего был использован ранее клонированный и охарактеризованный в нашей лаборатории маркер 49С4Н14, картированный на расстоянии 60 т.п.н. от З'конца гена ЕХТ1. При изучении этого маркера было показано значительное количество сайтов связывания для факторов транскрипции таких как NF-A3, CTF1, Oct3, Oct5, характерных для регуляторных районов. При проведении блот-гибридизации маркера 49С2Н14 с ДНК пробанда 3 и ДНК из его экзостоза выявлены отличные от нормы сигналы (Рис. 12) как в крови, так и в материале экзостоза. При гибридизации ДНК из лимфоцитов пробанда 3, гидролизованной по Taql, выявлены атипичные легкие сигналы 2.5 т.п.н., 1.2 т.п.н. наряду с нормальными 3.7 т.п.н. и 2.3 т.п.н., что свидетельствует о появлении дополнительного сайта узнавании фермента рестрикции Taql в одном из аллелей. В гибридизационной картине экзостоза наряду с легкими атипичными сигналами, определенными в ДНК лимфоцитов, выявлена потеря нормального сигнала 3.7 т.п.н., что свидетельствует о делеции, затронувшей второй аллель, не поврежденной в лимфоцитах. В пользу соматической мутации в экзостозе пробанда 3 свидетельствует результат блот-гибридизации ДНК из операционного материала пробанда 3, гидролизованной по Seal, а именно отсутствие в гибридизационной картине ДНК из экзостоза нормального сигнала 3.6 т.п.н., присутствующего как в ДНК из лимфоцитов больного, так и в норме. Поскольку при гибридизации по ■Seal каких-либо изменений в гибридизационной картине ДНК из лимфоцитов больного не обнаружено, в то время как по Taql изменения были выявлены, логично предположить, что наследуемая в семье 3 терминальная мутация представляет собой микроструктурную перестройку, приводящую к образованию дополнительного сайта узнавания для фермента рестрикции Taql. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что причиной заболевания наряду с мутациями и перестройками в кодирующей части генов ЕХТ1 и ЕХТ2, по-видимому, могут оказаться перестройки в регуляторных районах, приводящие к нарушению нормальной транскрипции генов.
А) 1 |
|
#2.0т.п.н. |
Щ 4.5 т. п. н. |
43.6 т.п. н. |
■ |
41.От.п.н. |
1 2 3
3.7т.п.н.
<4^1. 2т. п. н. |
■Й9
|
С)
Seal |
Терминальная мутация |
Seal |
Рис. 12. А) Результат блот-гибридизации маркера 49С2Н14 с ДНК гидролизованной по БсаЪ 1- норма; 2- экзостоз; 3- лимфоциты пробанда 3. В) Результат блот-гибридизации маркера 49С2Н14 с ДНК гидролизованной по ТацI: 1- норма; 2- экзостоз; 3- лимфоциты пробанда 3. С) Схема структурной перестройки. В литературе описан целый ряд генов, для которых выявлены перестройки, затрагивающие районы, значительно удаленные от 3'конца генов, и приводящие к изменению транскрипции этих генов. Данные изменения в транскрипции генов относят на счет активно изучаемого в настоящее время феномена, названного эффектом положения (ЭП), который можно определить, как нарушение уровня экспрессии гена в результате изменения местоположения гена в структуре генома либо изменения окружения гена, но не ассоциированного со структурной патологией или мутацией, затрагивающей кодирующую часть гена и его промоторную область (Кагреп, 1994, М1Ы е1 |
делеция 3.7-3.8 т.п.н. |
al.,1996). Одним из первых генов, для которого описан ЭП, является ген РАХ6, расположенный в районе хромосомы lip 13 и изменения в котором приводят к возникновению аниридии. В пяти случаях у больных были выявлены транслокации, точки разрыва при которых были локализованы в 100-125 т.п.н. от 3' района гена (Fantes et al., 1995).
Дата добавления: 2015-08-27; просмотров: 41 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |
