РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК Медико-генетический Научный Центр
На правах рукописи УДК 575.113.2+616-056.7
Чеснокова Галина Геннадьевна
Изучение структурных аномалий и точковых мутаций генов ЕХТ1 и ЕХТ2 при множественной экзостозной хондродисплазии и спорадических злокачественных
новообразованиях.
03.00.15 "Генетика"
|
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель д.б.н. Д.В. Залетаев
Москва 1999
ОГЛАВЛЕНИЕ
Список используемых сокращений........................................................................................... 4
ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................................. 6
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................. 9
1.1 Клиническая характеристика заболевания................................................................. 9
1.2 Картирование и клонирование генов EXT............................................................... 10
1.2.1. Синдром Лангера-Гидиона (С ЛГ).............................................................................11
1.2.2. Синдром DEFECT 11................................................................................................... 14
1.2.3. Генетическое картирование МЭХД........................................................................... 14
1.2.4. Клонирование гена ЕХТ1............................................................................................................................ 16
1.2.5. Клонирование гена ЕХТ2............................................................................................ 16
1.3. Возможная роль генов ЕХТ в процессе формирования скелета позвоночных...... 18
1.3.1. Hedgehog белки как регуляторы эмбрионального развития................................... 18
1.3.2. Молекулярная регуляция дифференцировки хряща................................................ 21
1.3.3. Предполагаемые функции и свойства ЕХТ белков.................................................. 23
1.4. Поиск причин, приводящих к озлокачествлению................................................... 25
1.5. Поиск и характеристика мутаций.............................................................................. 27
1.5.1. Типы и номенклатура мутаций................................................................................. 27
1.5.2. Методы идентификации мутаций............................................................................. 33
1.5.3. Детекция мутаций в генах ЕХТ1 и ЕХТ2.................................................................. 37
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................................................... 41
2.1. Обследование больных.............................................................................................. 41
2.2. Забор венозной крови................................................................................................ 41
2.3. Выделение геномной ДНК........................................................................................ 42
2.4. Рестрикция и электрофорез при проведении блотинг-гибридизации................. 43
2.5. Гибридизация с радиоактивно меченым зондом.................................................... 44
2.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)...................................................................... 45
2.7. Радиоактивная нерадиоактивная детекция точковых мутаций методом SSCP.. 45
2.8. Анализ гетеродуплексов............................................................................................ 47
2.9. Определение нуклеотидной последовательности.................................................. 47
2.10. Программное обеспечение компьютерного анализа ДНК..................................... 48
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ....................................................................49
3.1. Характеристика больных.............................................................................. 49
3.2. Стратегия поиска мутаций в генах ЕХТ1 и ЕХТ2 в различных группах больных...51
3.3. Исследование больных с наследственной формой МЭХД....................... 57
3.3.1. Анализ полиморфных ДНК-маркеров в семьях с МЭХД......................... 57
3.3.2. Поиск мутаций в генах ЕХГ у больных с наследственной формой заболевания 62
3.4. Исследование больных со спорадической формой заболевания............. 76
3.4.1. Точковые мутации в гене ЕХТ1................................................................... 77
3.4.2. Точковые мутации в гене ЕХТ2................................................................... 85
3.4.3. Структурные изменения в генах ЕХТ1 и ЕХТ2.......................................... 88
3.5. Исследование больных МЭХД с экзостозами, претерпевшими злокачественную трансформацию и больных со спорадическими формами злокачественных новообразований 90
3.6. Характеристика полиморфных аллелей в гене ЕХТ1................................ 98
3.7. Анализ метилирования промоторной области генов ЕХТ1 и ЕХТ2 в
3.8. экзостозах, хондро- и остеогенных саркомах........................................... 101
3.9. Частота и структура мутаций в генах ЕХТ1 и ЕХТ2 среди исследованных больных 104
3.8.1. Спектр выявленных мутаций.......................................................................... 105
3.10. Причины, приводящие к озлокачествлению............................................ 110
ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................................... 112
ВЫВОДЫ....................................................................................................:............................ 114
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................... 116
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
БСА | - бычий сывороточный альбумин |
ГАГ | - гликозаминогликан |
ГС | - гепарансульфат |
ГСПГ | - протеогепарансульфат |
МЭ | - множественные экзостозы |
МЭХД | - множественная экзостозная хондродисплазия |
м.п.н. | - миллион пар нуклеотидов |
ПААГ | - полиакриламидный гель |
ПГ | - потеря гетерозиготности |
ПДРФ | - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов |
ПЦР | - полимеразная цепная реакция |
т.п.н. | - тысяча пар нуклеотидов |
ТРФС-1 | - трихо-рино-фаланговый синдром I типа |
ТРФС-П | - трихо-рино-фаланговый синдром II типа |
СЛГ | - синдром Лангера-Гидиона |
ЭДТА | - натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты |
ЭМ | - экстрацеллюлярный матрикс |
APS | - аммония персульфат |
АТР | - аденозинтрифосфат |
сМ | - сантиМорган |
CMC | - chemical mismatch cleavage, химическое расщепление не спарен |
| ных нуклеотидов |
Dhh | - Desert hedgehog, белок |
DGGE | - denaturating gradient gel electrophoresis, электрофорез в денатури |
| рующем градиентном геле |
ЕХТ1 | - ген МЭХД в участке хромосомы 8q24.1 |
EXT2 | - ген МЭХД в участке хромосомы 11р12 |
FISH | - флуоресцентная гибридизация in situ |
GlcA - D-глюкуроновая кислота
GlcNAc - N-ацетил D-глюкозаминовая кислота
НА - heteroduplex analysis, анализ подвижности гетеродуплексов
hh - hedgehog, ген сегментной полярности у Drosophila
Ihh - Indian hedgehog, белок
PTHrP - Parathyroid hormone-related protein
PTH/PTHrP - рецептор PTHrP
SDS - додецил сульфат натрия
Shh - Sonic hedgehog, белок
SRO - the shortest region of overlap, наименьший участок перекрывания всех делеций
SSC - 0,15 M хлорид натрия, 0,015 M цитрат натрия
SSCP - single-strand conformation polymorphism, однонитевой конформа
ционный полиморфизм ТВЕ - 89 тМ трис-борат, 89 тМ борная кислота, 2 тМ ЭДТА ТЕ -10 тМ трис-HCl, рН 8.0,1 тМ ЭДТА TEMED - тетраметилэтилендиамин
YAC - yeast artificial chromosome, искусственная дрожжевая хромосома
ВВЕДЕНИЕ.
Актуальность проблемы.
Множественная экзостозная хондродисплазия (МЭХД) - аутосомно- доминантное заболевание, встречающееся в популяции с частотой 1:50000, составляющее до 10% обращений в специализированные клиники и более чем в 70% представленное семейными случаями. МЭХД характеризуется наличием множественных хрящевых экзостозов (МЭ) в районах костного роста и проявляется до 4-х лет. Рост и оссификация экзостозов замедляет рост кости и, как следствие, вызывает деформации скелета. Экзостозы вызывают сдавливание крупных сосудов и нервов, что требует неоднократного операционного вмешательства по их удалению в течение периода роста и развития организма. До 14% МЭ имеют тенденцию к трансформации во вторичную хондрому и хондро- саркому. Заболевание генетически гетерогенно и гены МЭХД ЕХГ1 и ЕХТ2 картированы и клонированы на хромосомах Щ24Л и 11р12, соответственно. Предполагаемый третий ген картирован в коротком плече хромосомы 19, но до сих пор не клонирован. Поскольку гены МЭХД клонированы недавно, они недостаточно изучены. Предполагается, что гены ЕХТ1 и ЕХТ2 являются генами- супрессорами канцерогенеза, т.к. установлено их участие при злокачественной трансформации хрящевой и костной ткани. Спектр мутаций генов, приводящих к экзостозам, и злокачественной трансформации не определен. Изучение структуры генов, их мутаций и причин злокачественной трансформации является как фундаментальной проблемой, способствующей пониманию закономерностей развития и дифференцировки специализированных тканей и процессов неопластической трансформации, так и социально значимой задачей по диагностике, профилактике, прогнозированию течения этого заболевания.
Цель и задачи исследования: Основной целью работы является изучение и характеристика структурных аномалий и точковых мутаций генов ЕХТ1 и ЕХТ2, приводящих к множественной экзостозной хондродисплазии и злокачественной трансформации экзостозов.
Задачами исследования являются:
1. Провести комплексный анализ области локализации гена ЕХТ1 в районе хромосомы 8q24.1 и гена ЕХТ2 в районе хромосомы lip 12 на предмет обнаружения микроструктурных нарушений;
2. Провести поиск и характеристику точковых мутаций в генах ЕХТ1 и ЕХТ2;
3. Изучить причины трансформации экзостозов в хондросаркому и остео- генную саркому в операционном материале и состояние генов ЕХТ в спорадических случаях тех же новообразований;
4. Разработать диагностические подходы для лабораторной ДНК- диагностики МЭХД.
Научная новизна.
В результате проведенного исследования изучены частота и спектр мутаций генов ЕХТ у больных с МЭХД. Все выявленные в данной работе точковые мутации генов ЕХТ описаны впервые. Описаны три новых полиморфизма гена ЕХТ1, для двух из них определены частоты, как среди больных, так и контрольных индивидов. Показано, что для гена ЕХТ2 более характерны структурные изменения, чем точковые мутации. Два случая структурных изменений в области локализации гена ЕХТ1 затронули потенциально регуляторную область в 60 т.п.н. от 3' области гена, что заставляет предполагать наличие мутаций типа «эффект положения» в случаях, где точковых и структурных аномалий генов не выявлено при заболевании МЭХД. Впервые описаны мутации ЬгапсЬ-сайтов в интронах 7 и 10 гена ЕХТ1. Все структурные изменения и мутации в не кодирующих районах ЕХТ генов показаны впервые. Проведен анализ зиготности в операционном материале экзостозов и злокачественных новообразований, показавший потерю гетерозиготности по микросателлитным маркерам хромосомы 8, как в ткани экзостоза, так и при злокачественных новообразованиях. Описаны 3 новые терминальные мутации при озлокачествленных экзостозах. Впервые проведенный анализ метилирования и мутаций в промоторных областях ЕХТ генов патологии не выявил.
Практическая значимость работы.
В результате выполненного исследования разработаны подходы для мо- лекулярно-биологической лабораторной диагностики и характеристики микроструктурной патологии и мутаций генов ЕХТ при множественной экзостозной хондродисплазии. Сконструированы наборы олигонуклеотидных праймеров для обоих генов. ДНК-диагностика проведена у 36 больных с МЭХД и у 9 больных со злокачественными новообразованиями. Показано, что кроме мутаций, гены ЕХТ могут повреждаться в результате структурных изменений, в том числе и за пределами кодирующего района. Проведена пренатальная диагностика заболевания. Показано, что мутации, структурные перестройки и потерю гетерозигот- ности генов ЕХТ имеет смысл тестировать в операционном материале спорадических хондро- и остеогенных сарком. Социально-экономическая значимость результатов исследования связана с повышением точности лабораторной диагностики, пренатальной диагностикой, прогноза и профилактикой заболевания.
Положения, выносимые на защиту.
1. Определены частота и спектр молекулярной патологии генов ЕХТ при МЭХД.
2. Описаны новые мутации и полиморфизмы в генах ЕХТ при МЭХД.
3. Районы локализации генов ЕХТ в ряде случаев повреждаются у больных со спорадическими остеогенными и хондросаркомами.
4. Аномалии метилирования промоторных районов генов ЕХТ не характерны при спорадических злокачественных новообразованиях и экзостозах, претерпевших злокачественную трансформацию.
5. Разработаны подходы для лабораторной ДНК-диагностики МЭХД.
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Клиническая характеристика заболевания.
Множественная экзостозная хондродисплазия (МЭХД) относится к числу достаточно распространенных наследственных заболеваний. Частота заболевания в разных популяциях составляет от 1:50000 до 1:90000 или 1 на 7000 ортопедических больных, на его долю приходится 27,4% всех доброкачественных опухолей, опухолеподобных и диспластических поражений скелета. Заболевание имеет аутосомно-доминантный тип наследования, очень велика доля семейных случаев - до 80%. Пенетрантность составляет 100%. Отмечается некоторое преобладание в популяции пораженных мужчин (Lückert-Wickland et al., 1994; Wicklund et al.,1995). Этиология заболевания оставалась неясной до последнего времени, хотя в качестве причины предполагалась генная мутация, приводящая к пороку развития эпифизарной ростковой зоны хряща (Раззоков, 1986).
МЭХД относится к числу наследственных системных заболеваний скелета, проявляется до 4 лет, начиная с бессимптомных форм и заканчивая генерализованными формами поражения скелета с многочисленными прогрессирующими деформациями костей и суставов, укорочением и вторичными изменениями костей, вторичными изменениями в мышечной системе, что вызывает нарушение функции опорно-двигательного аппарата. Как правило, к 18-20 годам рост множественных экзостозов (МЭ) прекращается.
Серьезным осложнением является трансформация отдельных экзостозов во вторичную хондрому и/или хондросаркому, кроме того описаны отдельные случаи трансформации в остеогенную саркому (Hennekam, 1991). По данным литературы до 5% случаев МЭХД претерпевают подобную трансформацию, из них около 5% приходится на хондросаркому (Волков и др., 1982; Берглезов, Раззоков, 1985; Matsuno et al., 1988; Quirihi et al., 1996). Частота трансформации экзостозов за последние годы возросла и составляет около 14%. Умственной отсталости при МЭХД, как правило, не наблюдается.
1.2. Картирование и клонирование генов EXT.
Клонирование генов, ответственных за МЭХД, названных генами ЕХТ, является классическим примером клонирования генов с применением стратегии позиционного клонирования, поскольку этиология этого заболевания на уровне биохимических процессов остается до конца не выясненной. Только в этом году появились работы, авторы которых пытаются обосновать процессы, приводящие к образованию экзостозов, и выявить роль в этих процессах белков ЕХГ1 и ЕХТ2. Изменения в этих белках на данный момент принято считать причиной развития МЭХД (Wicklund et al., 1995).
Стратегия позиционного клонирования основана на информации о локализации заболевания на определенной хромосоме или в конкретном сегменте хромосомы. Первоначальный район локализации гена-кандидата может составлять до Юм. п. о. и более и определяется несколькими способами.
Наиболее широко распространен анализ сцепления между локусом болезни и полиморфными ДНК-маркерами в семьях с использованием различных статистических программ, основанных на вычислении вероятности сцепления или несцепления двух и более локусов с известной долей рекомбинантов в выборке семей или при анализе родословных (Davis, 1988., Friedmann, 1990., Collins, 1993).
Второй подход основан на выявлении хромосомных аномалий, сопровождающих заболевание. Наличие цитогенетических аномалий значительно облегчает локализацию гена болезни в определенном районе хромосомы, которая сводится к поиску наименьшего участка перекрывания всех делеций, клонированию точек разрыва при структурных перестройках и поиску потери гетерозиготности хромосомных районов, повреждаемых в опухолях (Emanuel, 1988., Ledbetter et al, 1989., Buhler, 1990).
Оба этих подхода были использованы при клонировании генов, ответственных за МЭХД. Значительную роль при картировании и клонировании ЕХТ1 и ЕХТ2 генов сыграли делеционные синдромы: синдром Лангера-Гидиона (СЛГ) и синдром DEFECT 11, сопровождающиеся микроделециями районов хромосом 8q24.1 и 11р12, соответственно (Bridge et al., 1998).
1.2.1. Синдром Лангера-Гидиона (СЛГ).
СЛГ или трихо-рино-фаланговый синдром II типа (ТРФС-П) - редкое генетическое заболевание, описанное впервые в 1969 г. (Hall et al., 1969). Популя- ционная частота синдрома не определена, в литературе описано около 80 случаев. Тип наследования строго не установлен, но предполагается аутосомно- доминантная передача заболевания, т.к. известно только три семейных случая (Murachi et al.,1981; Shabtai et al., 1985; Brenholz et al., 1989). По данным литературы СЛГ возникает в результате хромосомной патологии.
Фенотип СЛГ складывается из 4 основных диагностических признаков: тонкие редкие волосы на голове, бульбообразный нос, конические эпифизы фаланг и множественные экзостозы (МЭ). Кроме этих признаков больные имеют целый комплекс микроаномалий, создающих запоминающийся фенотип. Характерны: высокая линия роста волос на лбу, широкие редкие брови, чуть более густые к переносице, глубоко посаженные глаза, широкая и уплощенная переносица. Бульбообразность носу придает гипоплазия крыльев и их более высокое прикрепление, чем у широкого корня носа, фильтр длинный и уплощенный, верхняя губа тонкая, макростомия. Отмечаются: высокое небо, нарушение роста зубов и их прорезывания, микроретрогнатия. Череп микроцефальной формы, ушные раковины большие, оттопыренные, низко расположенные. Характерна патология скелета: низкий рост, искривление позвоночника, незаращение дужек позвонков, гипоплазия ребер, крыловидные лопатки, гиперподвижность суставов. МЭ развиваются до 4-х лет, обладают высокой скоростью роста и располагаются везде, где есть растущий хрящ (Zaletayev, Marincheva, 1983; Buhler et al., 1984; Залетаев и др., 1987). Рост экзостозов усиливается в периоды усиленного роста организма, вызывая деформации скелета. Случаев озлокачествления экзостозов при СЛГ не описано. Больные с СЛГ имеют различные степени умственной отсталости: 29% имеют нормальный интеллект, 17% - слабо выраженную умственную отсталость, 40% - выраженную умственную отсталость и 14% страдают тяжелой степенью умственного недоразвития.
Особый интерес к СЛГ появился в 1980 г., когда у двух больных были обнаружены делеции хромосомы 8 (Buhler et al., 1980; Pfeiffer et al., 1980). Патология представляла собой небольшую интерстициальную делецию длинного плеча хромосомы 8 в участке q24.1. Делеции варьируют по величине, но наименьший участок перекрывания всех делеций на цитогенетическом уровне - 8q24.12 (Buhler et al., 1984,1987; Chen et al., 1996; Hou et al., 1995; Залетаев и др., 1987, 1989; Fennell et al., 1989). В нескольких случаях описаны сбалансированные структурные перестройки хромосомы 8, одна из точек разрыва при которых локализована в сегменте 8q24.1, и несбалансированные перестройки, сопровождающиеся потерей критического сегмента (Залетаев и др., 1988; Yoshiura et al., 1994). Таким образом, обнаружение микроделеций в большей части случаев при использовании адекватных методов заставило предполагать хромосомную этиологию СЛГ.
Был предпринят ряд попыток молекулярной диагностики микроделеций. В работе Parrish с соавт. (1991) была сделана попытка молекулярной диагностики делеций у трех больных с СЛГ. Исследование проводилось на гибридных (человек х хомяк) клеточных линиях, содержащих делетированную хромосому 8. Был использован 31 ДНК-маркер, картированные в участке хромосомы 8(q22-qter). Больные имели различные по величине цитогенетические делеции. 8 ДНК- маркеров располагались в области этих делеций, причем удалось выявить единственный локус - D8S67, делетированный у всех, что позволило определить наименьший район перекрывания делеций (SRO), составляющий около 2 м.п.н.
Используя клонотеку ДНК-маркеров, полученную в результате микро- диссекции сегмента 8q24.1 Ludecke с соавт. (1991) охарактеризовали протяженность делеций 16 больных с СЛГ. 12 из них имели цитогенетически определяемую делецию, двое имели сбалансированные транслокации и двое - нормальный кариотип. Во всех случаях, кроме одного, имевшего транслокацию, была выявлена потеря генетического материала. 13 анонимных ДНК-маркеров подразделили область делеций на 10 интервалов. Один из этих клонов L-48, соответствующий хромосомному локусу D8S51, был делетирован у всех больных и явился наименьшим участком перекрывания всех делеций (SRO) в этой серии больных. Предполагалось, что протяженность этого локуса составляет менее 2 м.п.н., однако исследования (Wood et al., 1993) показали, что критический район составил не менее 5 м.п.н.
В лаборатории клинической цитогенетики МГНЦ РАМН проводился анализ ДНК пациентов посредством дозовой блот-гибридизации и анализа ПДРФ. В работе было исследовано 8 больных с СЛГ, у всех выявлена хромосомная патология, 4 - с ТРФС-1, хромосомная патология выявлена в 2-х случаях и более 30 больных с МЭХД - патология хромосом не обнаружена. В целях молекулярной диагностики случаев без видимой хромосомной патологии и характеристики по длине цитогенетически выявленных делеций в дозовом блот- гибридизационном анализе были использованы уникальные ДНК-зонды, картированные в длинном плече хромосомы 8q24.1, в качестве референсного ДНК- зонда использован фрагмент гена кальцитонина, расположенного в коротком плече хромосомы 11. Результаты дозового анализа показали, что у всех больных с СЛГ и видимой патологией хромосомы 8 на молекулярном уровне делетиро- ваны локусы D8S51, D8S67 и D8S43. Этот участок является наименьшим участком перекрывания всех делеций и составляет около 600 т.п.н. (Немцова и др., 1994, 1996) У двух больных с ТРФС-1 и видимой патологией делетированы локусы D8S42, D8S50, D8S98, D8S51. У одного больного с ТРФС-1 патологии выявить не удалось. Это может свидетельствовать в пользу того, что комплекс генов, отвечающих за фенотипическое проявление СЛГ и ТРФС-1 расположены в локусах D8S98 и D8S51, а ген, отвечающий за возникновение МЭХД расположен в локусе D8S67 или D8S43 (Немцова и др., 1996).
В четырех семьях с МЭХД был проведен анализ ПДРФ с маркерами из локуса D8S67. ДНК-зонд 49С2Н14 показал у всех больных наличие дополнительного сигнала в области 5,3 т.п.н. на рестриктах геномной ДНК по ферменту Taql. Как оказалось в последствие, этот ДНК-зонд расположен в 60 т.п.н. от 3'конца гена ЕХТ1 и позволяет проводить косвенную ДНК-диагностику (Немцова и др., 1996).
1.2.2. Синдром DEFECT 11.
В 1995 г. появилось первое сообщение о больных, имеющих множественные экзостозы, комплекс аномалий развития, умственную отсталость, сопровождающиеся хромосомной патологией в коротком плече хромомосомы 11 (Van Hui et al., 1995, Potoki et al., 1995, 1996; Ligon et al., 1998). На сегодняшний день описано 12 больных и очерчен симптомокомплекс, называемый DEFECT 11 синдром по основным признакам: делеция, увеличенный родничок (форамина), экзостозы, черепнолицевой дизостоз, умственная и физическая отсталость.
Редко встречаемыми признаками являются: микропенис, гипотония, аномалии дерматоглифики, эпикант и телекант (Bartsch et al., 1996). Выявлен единственный случай, когда описанный симптомокомплекс сопровождался WAGR- комплексом и почти полной делецией короткого плеча хромосомы 11 (McGaughran et al., 1995, Gustavson et al., 1994). Синдром DEFECT 11, так же, как и синдром Лангера-Гидиона, является синдромом генных последовательностей, т.к. множественные экзостозы и форамина объединяются только в случае деле- ции хромосомы 11.
Основная масса МЭ при МЭХД по структуре и расположению идентичны таковым как при СЛГ (Langer et al., 1984), так и при выше описанном синдроме (Bartsch et al., 1996).
1.2.3. Генетическое картирование МЭХД.
Наличие экзостозов при СЛГ позволило предположить, что наиболее вероятным районом локализации гена, ответственного за МЭХД, является район 8q24.1. Однако, в работе Cook с соавт. (1993) по сцеплению МЭХД с районом хромосомы 8q24.1 с использованием микросателлитных ДНК-маркеров удалось показать, что только в 8 семьях из 11 было обнаружено достоверное сцепление - лод-балл равный 8,11. Наиболее вероятным оказалось расположение гена между локусами D8S85 и D8S199. Это послужило основанием для предположения о наличии генетической гетерогенности МЭХД и инициировало поиски других возможных генов, ответственных за возникновении патологии. В частности, в работе Le Merrer с соавт. (1992) не было получено сцепления МЭХД с участком хромосомы 8q24.1. Авторами были использованы 8 маркеров, имеющих ПДРФ, из них 4 располагались более чем в 40 сМ от "критического" района. Позже, этой же группе авторов удалось показать сцепление МЭХД с локусом короткого плеча хромосомы 19 (Le Merrer et al.,1994). Анализируя 21 семью с использованием высокополиморфных микросателлитных маркеров, авторам удалось сцепить заболевание с локусом D19S221 с достаточно высокой вероятностью - лод балл - 7,22 и показать, что предполагаемый ген ЕХТЗ расположен между локусами D19S413 и D19S221, расстояние между которыми оценивается в 2-3 м.п.н., однако этот ген до сих пор не клонирован.
Анализ сцепления с использованием микросателлитных маркеров из районов возможной локализации трех генов МЭХД в 12 многопоколенных семьях с МЭХД позволило локализовать ген ЕХТ1 в участке хромосомы 8q24.1 между локусами D8S592 и D8S199 в 6 семьях, а в других 6 - на хромосоме 11р11.2, между локусами D11S905 и D11S554 (Blanton et al., 1996).
Другая группа авторов, исследуя две больших семьи с МЭХД, которые не имели сцепления с хромосомой 8q24.1, обнаружила сцепление заболевания с микросателлитными маркерами, картированными в прицентромерном районе короткого плеча хромосомы 11р11.2. Сцепление было показано с локусом D11S554 - наибольший лод-балл равнялся 7.148 (Wu et al., 1994). Исследуя ка- риотипы нескольких больных, имеющих, кроме множественных экзостозов, аномалии развития и умственную отсталость, Van Hul с соавт. (1995) показали наличие микроделеции в участке хромосомы 11(р11.2-р12), что явилось подтверждением локализации второго гена МЭХД на хромосоме 11. Т.о., в настоящее время определено два основных района, изменения в которых приводят к МЭХД: 8q24.1 и 11р11.2. В этих районах клонированы гены ЕХТ1 и ЕХГ2, соответственно (Legein-Mallet et al., 1997).
1.2.4. Клонирование гена ЕХТ1.
Ген ЕХТ1 клонирован в 1995 году. Работа осуществлялась двумя группами из Хьюстона (США) и из Эссена (ФРГ) и заключалась в клонировании точек разрыва при транслокации хромосом t(4;8)(pl5.3;q24.1) и перицентрической инверсии inv(8)(p23;q24.1) при СЛГ. Используя контиг космидных клонов хромосомы 8 ими была проведена гибридизация in situ на хромосомах, полученных из лимфобластоидных клеточных линий с указанными перестройками и определены космидные клоны, которые оказались в точках разрыва. С использованием космидных клонов был проведен скрининг кДНК-библиотек (полученных из фе- тального мозга, фетального хряща и плаценты) и выявлено несколько перекрывающихся кДНК-клонов, предположительно соответствующих экзонам предполагаемого гена ЕХТ1. В сумме эти кДНК клоны составили 3287 п.н. и имели открытую рамку считывания длиной в 2238 п.н., кодирующей 746 аминокислот. Предполагаемая аминокислотная последовательность не показала гомологии ни с одним из известных белков, также, как и нуклеотидная последовательность не обнаружила сходства с известными генами (Ahn et al., 1995; Ludecke et al., 1996). Нозерн-анализ с использованием этой последовательности показал единичный гибридизационный сигнал на мРНК, полученной из печени, почек, мозга, плаценты, сердца, легких, скелетной мышцы и хондроцитах, причем наибольшая экспрессия наблюдалась в печени и почках. Клонированный ген ЕХТ1 состоит из 11 экзонов и занимает около 330 т.п.н. на геномной ДНК. Ген имеет большой по размерам первый экзон - 1725 п.н., составляющий 43% кодирующей области, и необычно большой первый интрон, составляющий 250 т.п.н. Остальные 10 экзонов с интронными областями занимают около 70 т.п.н. (Ludecke et al., 1996). Промоторная область содержит крупный CpG-участок, характерный для генов "домашнего хозяйства"(Ludecke et al., 1997).
Дата добавления: 2015-08-27; просмотров: 57 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |
