Студопедия
Случайная страница | ТОМ-1 | ТОМ-2 | ТОМ-3
АрхитектураБиологияГеографияДругоеИностранные языки
ИнформатикаИсторияКультураЛитератураМатематика
МедицинаМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогика
ПолитикаПравоПрограммированиеПсихологияРелигия
СоциологияСпортСтроительствоФизикаФилософия
ФинансыХимияЭкологияЭкономикаЭлектроника

Российская академия медицинских наук медико-генетический научный центр 1 страница



РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК Медико-генетический Научный Центр

На правах рукописи УДК 575.113.2+616-056.7

Чеснокова Галина Геннадьевна

Изучение структурных аномалий и точковых мутаций генов ЕХТ1 и ЕХТ2 при множественной экзостозной хондродисплазии и спорадических злокачественных

новообразованиях.

03.00.15 "Генетика"

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д.б.н. Д.В. Залетаев

Москва 1999


ОГЛАВЛЕНИЕ

Список используемых сокращений........................................................................................... 4

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................................. 6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................. 9

1.1 Клиническая характеристика заболевания................................................................. 9

1.2 Картирование и клонирование генов EXT............................................................... 10

1.2.1. Синдром Лангера-Гидиона (С ЛГ).............................................................................11

1.2.2. Синдром DEFECT 11................................................................................................... 14

1.2.3. Генетическое картирование МЭХД........................................................................... 14

1.2.4. Клонирование гена ЕХТ1............................................................................................................................ 16

1.2.5. Клонирование гена ЕХТ2............................................................................................ 16

1.3. Возможная роль генов ЕХТ в процессе формирования скелета позвоночных...... 18

1.3.1. Hedgehog белки как регуляторы эмбрионального развития................................... 18

1.3.2. Молекулярная регуляция дифференцировки хряща................................................ 21

1.3.3. Предполагаемые функции и свойства ЕХТ белков.................................................. 23

1.4. Поиск причин, приводящих к озлокачествлению................................................... 25

1.5. Поиск и характеристика мутаций.............................................................................. 27

1.5.1. Типы и номенклатура мутаций................................................................................. 27

1.5.2. Методы идентификации мутаций............................................................................. 33

1.5.3. Детекция мутаций в генах ЕХТ1 и ЕХТ2.................................................................. 37

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................................................... 41

2.1. Обследование больных.............................................................................................. 41

2.2. Забор венозной крови................................................................................................ 41

2.3. Выделение геномной ДНК........................................................................................ 42

2.4. Рестрикция и электрофорез при проведении блотинг-гибридизации................. 43



2.5. Гибридизация с радиоактивно меченым зондом.................................................... 44

2.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)...................................................................... 45

2.7. Радиоактивная нерадиоактивная детекция точковых мутаций методом SSCP.. 45

2.8. Анализ гетеродуплексов............................................................................................ 47

2.9. Определение нуклеотидной последовательности.................................................. 47

2.10. Программное обеспечение компьютерного анализа ДНК..................................... 48

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ....................................................................49

3.1. Характеристика больных.............................................................................. 49

3.2. Стратегия поиска мутаций в генах ЕХТ1 и ЕХТ2 в различных группах больных...51

3.3. Исследование больных с наследственной формой МЭХД....................... 57

3.3.1. Анализ полиморфных ДНК-маркеров в семьях с МЭХД......................... 57

3.3.2. Поиск мутаций в генах ЕХГ у больных с наследственной формой заболевания 62

3.4. Исследование больных со спорадической формой заболевания............. 76

3.4.1. Точковые мутации в гене ЕХТ1................................................................... 77

3.4.2. Точковые мутации в гене ЕХТ2................................................................... 85

3.4.3. Структурные изменения в генах ЕХТ1 и ЕХТ2.......................................... 88

3.5. Исследование больных МЭХД с экзостозами, претерпевшими злокачественную трансформацию и больных со спорадическими формами злокачественных новообразований 90

3.6. Характеристика полиморфных аллелей в гене ЕХТ1................................ 98

3.7. Анализ метилирования промоторной области генов ЕХТ1 и ЕХТ2 в

3.8. экзостозах, хондро- и остеогенных саркомах........................................... 101

3.9. Частота и структура мутаций в генах ЕХТ1 и ЕХТ2 среди исследованных больных 104

3.8.1. Спектр выявленных мутаций.......................................................................... 105

3.10. Причины, приводящие к озлокачествлению............................................ 110

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................................... 112

ВЫВОДЫ....................................................................................................:............................ 114

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................... 116

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

БСА

- бычий сывороточный альбумин

ГАГ

- гликозаминогликан

ГС

- гепарансульфат

ГСПГ

- протеогепарансульфат

МЭ

- множественные экзостозы

МЭХД

- множественная экзостозная хондродисплазия

м.п.н.

- миллион пар нуклеотидов

ПААГ

- полиакриламидный гель

ПГ

- потеря гетерозиготности

ПДРФ

- полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПЦР

- полимеразная цепная реакция

т.п.н.

- тысяча пар нуклеотидов

ТРФС-1

- трихо-рино-фаланговый синдром I типа

ТРФС-П

- трихо-рино-фаланговый синдром II типа

СЛГ

- синдром Лангера-Гидиона

ЭДТА

- натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты

ЭМ

- экстрацеллюлярный матрикс

APS

- аммония персульфат

АТР

- аденозинтрифосфат

сМ

- сантиМорган

CMC

- chemical mismatch cleavage, химическое расщепление не спарен

 

ных нуклеотидов

Dhh

- Desert hedgehog, белок

DGGE

- denaturating gradient gel electrophoresis, электрофорез в денатури

 

рующем градиентном геле

ЕХТ1

- ген МЭХД в участке хромосомы 8q24.1

EXT2

- ген МЭХД в участке хромосомы 11р12

FISH

- флуоресцентная гибридизация in situ

 

GlcA - D-глюкуроновая кислота

GlcNAc - N-ацетил D-глюкозаминовая кислота

НА - heteroduplex analysis, анализ подвижности гетеродуплексов

hh - hedgehog, ген сегментной полярности у Drosophila

Ihh - Indian hedgehog, белок

PTHrP - Parathyroid hormone-related protein

PTH/PTHrP - рецептор PTHrP

SDS - додецил сульфат натрия

Shh - Sonic hedgehog, белок

SRO - the shortest region of overlap, наименьший участок перекрывания всех делеций

SSC - 0,15 M хлорид натрия, 0,015 M цитрат натрия

SSCP - single-strand conformation polymorphism, однонитевой конформа

ционный полиморфизм ТВЕ - 89 тМ трис-борат, 89 тМ борная кислота, 2 тМ ЭДТА ТЕ -10 тМ трис-HCl, рН 8.0,1 тМ ЭДТА TEMED - тетраметилэтилендиамин

YAC - yeast artificial chromosome, искусственная дрожжевая хромосома

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Множественная экзостозная хондродисплазия (МЭХД) - аутосомно- доминантное заболевание, встречающееся в популяции с частотой 1:50000, со­ставляющее до 10% обращений в специализированные клиники и более чем в 70% представленное семейными случаями. МЭХД характеризуется наличием множественных хрящевых экзостозов (МЭ) в районах костного роста и проявля­ется до 4-х лет. Рост и оссификация экзостозов замедляет рост кости и, как следствие, вызывает деформации скелета. Экзостозы вызывают сдавливание крупных сосудов и нервов, что требует неоднократного операционного вме­шательства по их удалению в течение периода роста и развития организма. До 14% МЭ имеют тенденцию к трансформации во вторичную хондрому и хондро- саркому. Заболевание генетически гетерогенно и гены МЭХД ЕХГ1 и ЕХТ2 кар­тированы и клонированы на хромосомах Щ24Л и 11р12, соответственно. Пред­полагаемый третий ген картирован в коротком плече хромосомы 19, но до сих пор не клонирован. Поскольку гены МЭХД клонированы недавно, они недоста­точно изучены. Предполагается, что гены ЕХТ1 и ЕХТ2 являются генами- супрессорами канцерогенеза, т.к. установлено их участие при злокачественной трансформации хрящевой и костной ткани. Спектр мутаций генов, приводящих к экзостозам, и злокачественной трансформации не определен. Изучение структуры генов, их мутаций и причин злокачественной трансформации являет­ся как фундаментальной проблемой, способствующей пониманию закономер­ностей развития и дифференцировки специализированных тканей и процессов неопластической трансформации, так и социально значимой задачей по диагно­стике, профилактике, прогнозированию течения этого заболевания.

Цель и задачи исследования: Основной целью работы является изучение и характеристика структур­ных аномалий и точковых мутаций генов ЕХТ1 и ЕХТ2, приводящих к множе­ственной экзостозной хондродисплазии и злокачественной трансформации экзо­стозов.

Задачами исследования являются:

1. Провести комплексный анализ области локализации гена ЕХТ1 в районе хромосомы 8q24.1 и гена ЕХТ2 в районе хромосомы lip 12 на предмет обнаружения микроструктурных нарушений;

2. Провести поиск и характеристику точковых мутаций в генах ЕХТ1 и ЕХТ2;

3. Изучить причины трансформации экзостозов в хондросаркому и остео- генную саркому в операционном материале и состояние генов ЕХТ в спорадических случаях тех же новообразований;

4. Разработать диагностические подходы для лабораторной ДНК- диагностики МЭХД.

Научная новизна.

В результате проведенного исследования изучены частота и спектр мута­ций генов ЕХТ у больных с МЭХД. Все выявленные в данной работе точковые мутации генов ЕХТ описаны впервые. Описаны три новых полиморфизма гена ЕХТ1, для двух из них определены частоты, как среди больных, так и контроль­ных индивидов. Показано, что для гена ЕХТ2 более характерны структурные из­менения, чем точковые мутации. Два случая структурных изменений в области локализации гена ЕХТ1 затронули потенциально регуляторную область в 60 т.п.н. от 3' области гена, что заставляет предполагать наличие мутаций типа «эффект положения» в случаях, где точковых и структурных аномалий генов не выявлено при заболевании МЭХД. Впервые описаны мутации ЬгапсЬ-сайтов в интронах 7 и 10 гена ЕХТ1. Все структурные изменения и мутации в не коди­рующих районах ЕХТ генов показаны впервые. Проведен анализ зиготности в операционном материале экзостозов и злокачественных новообразований, пока­завший потерю гетерозиготности по микросателлитным маркерам хромосомы 8, как в ткани экзостоза, так и при злокачественных новообразованиях. Описаны 3 новые терминальные мутации при озлокачествленных экзостозах. Впервые про­веденный анализ метилирования и мутаций в промоторных областях ЕХТ генов патологии не выявил.

Практическая значимость работы.

В результате выполненного исследования разработаны подходы для мо- лекулярно-биологической лабораторной диагностики и характеристики микро­структурной патологии и мутаций генов ЕХТ при множественной экзостозной хондродисплазии. Сконструированы наборы олигонуклеотидных праймеров для обоих генов. ДНК-диагностика проведена у 36 больных с МЭХД и у 9 больных со злокачественными новообразованиями. Показано, что кроме мутаций, гены ЕХТ могут повреждаться в результате структурных изменений, в том числе и за пределами кодирующего района. Проведена пренатальная диагностика заболе­вания. Показано, что мутации, структурные перестройки и потерю гетерозигот- ности генов ЕХТ имеет смысл тестировать в операционном материале споради­ческих хондро- и остеогенных сарком. Социально-экономическая значимость результатов исследования связана с повышением точности лабораторной диаг­ностики, пренатальной диагностикой, прогноза и профилактикой заболевания.

Положения, выносимые на защиту.

1. Определены частота и спектр молекулярной патологии генов ЕХТ при МЭХД.

2. Описаны новые мутации и полиморфизмы в генах ЕХТ при МЭХД.

3. Районы локализации генов ЕХТ в ряде случаев повреждаются у больных со спорадическими остеогенными и хондросаркомами.

4. Аномалии метилирования промоторных районов генов ЕХТ не ха­рактерны при спорадических злокачественных новообразованиях и экзостозах, претерпевших злокачественную трансформацию.

5. Разработаны подходы для лабораторной ДНК-диагностики МЭХД.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Клиническая характеристика заболевания.

Множественная экзостозная хондродисплазия (МЭХД) относится к числу достаточно распространенных наследственных заболеваний. Частота заболева­ния в разных популяциях составляет от 1:50000 до 1:90000 или 1 на 7000 ортопе­дических больных, на его долю приходится 27,4% всех доброкачественных опу­холей, опухолеподобных и диспластических поражений скелета. Заболевание имеет аутосомно-доминантный тип наследования, очень велика доля семейных случаев - до 80%. Пенетрантность составляет 100%. Отмечается некоторое пре­обладание в популяции пораженных мужчин (Lückert-Wickland et al., 1994; Wicklund et al.,1995). Этиология заболевания оставалась неясной до последнего времени, хотя в качестве причины предполагалась генная мутация, приводящая к пороку развития эпифизарной ростковой зоны хряща (Раззоков, 1986).

МЭХД относится к числу наследственных системных заболеваний ске­лета, проявляется до 4 лет, начиная с бессимптомных форм и заканчивая ге­нерализованными формами поражения скелета с многочисленными прогресси­рующими деформациями костей и суставов, укорочением и вторичными изме­нениями костей, вторичными изменениями в мышечной системе, что вызывает нарушение функции опорно-двигательного аппарата. Как правило, к 18-20 годам рост множественных экзостозов (МЭ) прекращается.

Серьезным осложнением является трансформация отдельных экзостозов во вторичную хондрому и/или хондросаркому, кроме того описаны отдельные случаи трансформации в остеогенную саркому (Hennekam, 1991). По данным ли­тературы до 5% случаев МЭХД претерпевают подобную трансформацию, из них около 5% приходится на хондросаркому (Волков и др., 1982; Берглезов, Раззо­ков, 1985; Matsuno et al., 1988; Quirihi et al., 1996). Частота трансформации экзо­стозов за последние годы возросла и составляет около 14%. Умственной отстало­сти при МЭХД, как правило, не наблюдается.

1.2. Картирование и клонирование генов EXT.

Клонирование генов, ответственных за МЭХД, названных генами ЕХТ, является классическим примером клонирования генов с применением стратегии позиционного клонирования, поскольку этиология этого заболевания на уровне биохимических процессов остается до конца не выясненной. Только в этом году появились работы, авторы которых пытаются обосновать процессы, приводящие к образованию экзостозов, и выявить роль в этих процессах белков ЕХГ1 и ЕХТ2. Изменения в этих белках на данный момент принято считать причиной развития МЭХД (Wicklund et al., 1995).

Стратегия позиционного клонирования основана на информации о лока­лизации заболевания на определенной хромосоме или в конкретном сегменте хромосомы. Первоначальный район локализации гена-кандидата может состав­лять до Юм. п. о. и более и определяется несколькими способами.

Наиболее широко распространен анализ сцепления между локусом болез­ни и полиморфными ДНК-маркерами в семьях с использованием различных ста­тистических программ, основанных на вычислении вероятности сцепления или несцепления двух и более локусов с известной долей рекомбинантов в выборке семей или при анализе родословных (Davis, 1988., Friedmann, 1990., Collins, 1993).

Второй подход основан на выявлении хромосомных аномалий, сопровож­дающих заболевание. Наличие цитогенетических аномалий значительно облег­чает локализацию гена болезни в определенном районе хромосомы, которая сво­дится к поиску наименьшего участка перекрывания всех делеций, клонированию точек разрыва при структурных перестройках и поиску потери гетерозиготности хромосомных районов, повреждаемых в опухолях (Emanuel, 1988., Ledbetter et al, 1989., Buhler, 1990).

Оба этих подхода были использованы при клонировании генов, ответст­венных за МЭХД. Значительную роль при картировании и клонировании ЕХТ1 и ЕХТ2 генов сыграли делеционные синдромы: синдром Лангера-Гидиона (СЛГ) и синдром DEFECT 11, сопровождающиеся микроделециями районов хромосом 8q24.1 и 11р12, соответственно (Bridge et al., 1998).

1.2.1. Синдром Лангера-Гидиона (СЛГ).

СЛГ или трихо-рино-фаланговый синдром II типа (ТРФС-П) - редкое гене­тическое заболевание, описанное впервые в 1969 г. (Hall et al., 1969). Популя- ционная частота синдрома не определена, в литературе описано около 80 слу­чаев. Тип наследования строго не установлен, но предполагается аутосомно- доминантная передача заболевания, т.к. известно только три семейных случая (Murachi et al.,1981; Shabtai et al., 1985; Brenholz et al., 1989). По данным лите­ратуры СЛГ возникает в результате хромосомной патологии.

Фенотип СЛГ складывается из 4 основных диагностических признаков: тонкие редкие волосы на голове, бульбообразный нос, конические эпифизы фа­ланг и множественные экзостозы (МЭ). Кроме этих признаков больные имеют целый комплекс микроаномалий, создающих запоминающийся фенотип. Харак­терны: высокая линия роста волос на лбу, широкие редкие брови, чуть более гус­тые к переносице, глубоко посаженные глаза, широкая и уплощенная пе­реносица. Бульбообразность носу придает гипоплазия крыльев и их более высо­кое прикрепление, чем у широкого корня носа, фильтр длинный и уплощенный, верхняя губа тонкая, макростомия. Отмечаются: высокое небо, нарушение роста зубов и их прорезывания, микроретрогнатия. Череп микроцефальной формы, ушные раковины большие, оттопыренные, низко расположенные. Характерна патология скелета: низкий рост, искривление позвоночника, незаращение дужек позвонков, гипоплазия ребер, крыловидные лопатки, гиперподвижность суста­вов. МЭ развиваются до 4-х лет, обладают высокой скоростью роста и распола­гаются везде, где есть растущий хрящ (Zaletayev, Marincheva, 1983; Buhler et al., 1984; Залетаев и др., 1987). Рост экзостозов усиливается в периоды усиленного роста организма, вызывая деформации скелета. Случаев озлокачествления экзо­стозов при СЛГ не описано. Больные с СЛГ имеют различные степени умствен­ной отсталости: 29% имеют нормальный интеллект, 17% - слабо выраженную умственную отсталость, 40% - выраженную умственную отсталость и 14% стра­дают тяжелой степенью умственного недоразвития.

Особый интерес к СЛГ появился в 1980 г., когда у двух больных были об­наружены делеции хромосомы 8 (Buhler et al., 1980; Pfeiffer et al., 1980). Пато­логия представляла собой небольшую интерстициальную делецию длинного плеча хромосомы 8 в участке q24.1. Делеции варьируют по величине, но наи­меньший участок перекрывания всех делеций на цитогенетическом уровне - 8q24.12 (Buhler et al., 1984,1987; Chen et al., 1996; Hou et al., 1995; Залетаев и др., 1987, 1989; Fennell et al., 1989). В нескольких случаях описаны сбалансирован­ные структурные перестройки хромосомы 8, одна из точек разрыва при которых локализована в сегменте 8q24.1, и несбалансированные перестройки, сопровож­дающиеся потерей критического сегмента (Залетаев и др., 1988; Yoshiura et al., 1994). Таким образом, обнаружение микроделеций в большей части случаев при использовании адекватных методов заставило предполагать хромосомную этио­логию СЛГ.

Был предпринят ряд попыток молекулярной диагностики микроделеций. В работе Parrish с соавт. (1991) была сделана попытка молекулярной диагностики делеций у трех больных с СЛГ. Исследование проводилось на гибридных (чело­век х хомяк) клеточных линиях, содержащих делетированную хромосому 8. Был использован 31 ДНК-маркер, картированные в участке хромосомы 8(q22-qter). Больные имели различные по величине цитогенетические делеции. 8 ДНК- маркеров располагались в области этих делеций, причем удалось выявить един­ственный локус - D8S67, делетированный у всех, что позволило определить наи­меньший район перекрывания делеций (SRO), составляющий около 2 м.п.н.

Используя клонотеку ДНК-маркеров, полученную в результате микро- диссекции сегмента 8q24.1 Ludecke с соавт. (1991) охарактеризовали протяжен­ность делеций 16 больных с СЛГ. 12 из них имели цитогенетически определяе­мую делецию, двое имели сбалансированные транслокации и двое - нормальный кариотип. Во всех случаях, кроме одного, имевшего транслокацию, была выяв­лена потеря генетического материала. 13 анонимных ДНК-маркеров подраздели­ли область делеций на 10 интервалов. Один из этих клонов L-48, соответствую­щий хромосомному локусу D8S51, был делетирован у всех больных и явился наименьшим участком перекрывания всех делеций (SRO) в этой серии больных. Предполагалось, что протяженность этого локуса составляет менее 2 м.п.н., од­нако исследования (Wood et al., 1993) показали, что критический район составил не менее 5 м.п.н.

В лаборатории клинической цитогенетики МГНЦ РАМН проводился ана­лиз ДНК пациентов посредством дозовой блот-гибридизации и анализа ПДРФ. В работе было исследовано 8 больных с СЛГ, у всех выявлена хромосомная па­тология, 4 - с ТРФС-1, хромосомная патология выявлена в 2-х случаях и более 30 больных с МЭХД - патология хромосом не обнаружена. В целях молекуляр­ной диагностики случаев без видимой хромосомной патологии и характеристики по длине цитогенетически выявленных делеций в дозовом блот- гибридизационном анализе были использованы уникальные ДНК-зонды, кар­тированные в длинном плече хромосомы 8q24.1, в качестве референсного ДНК- зонда использован фрагмент гена кальцитонина, расположенного в коротком плече хромосомы 11. Результаты дозового анализа показали, что у всех больных с СЛГ и видимой патологией хромосомы 8 на молекулярном уровне делетиро- ваны локусы D8S51, D8S67 и D8S43. Этот участок является наименьшим уча­стком перекрывания всех делеций и составляет около 600 т.п.н. (Немцова и др., 1994, 1996) У двух больных с ТРФС-1 и видимой патологией делетированы ло­кусы D8S42, D8S50, D8S98, D8S51. У одного больного с ТРФС-1 патологии вы­явить не удалось. Это может свидетельствовать в пользу того, что комплекс ге­нов, отвечающих за фенотипическое проявление СЛГ и ТРФС-1 расположены в локусах D8S98 и D8S51, а ген, отвечающий за возникновение МЭХД располо­жен в локусе D8S67 или D8S43 (Немцова и др., 1996).

В четырех семьях с МЭХД был проведен анализ ПДРФ с маркерами из локуса D8S67. ДНК-зонд 49С2Н14 показал у всех больных наличие дополни­тельного сигнала в области 5,3 т.п.н. на рестриктах геномной ДНК по ферменту Taql. Как оказалось в последствие, этот ДНК-зонд расположен в 60 т.п.н. от 3'конца гена ЕХТ1 и позволяет проводить косвенную ДНК-диагностику (Немцо­ва и др., 1996).

1.2.2. Синдром DEFECT 11.

В 1995 г. появилось первое сообщение о больных, имеющих множе­ственные экзостозы, комплекс аномалий развития, умственную отсталость, со­провождающиеся хромосомной патологией в коротком плече хромомосомы 11 (Van Hui et al., 1995, Potoki et al., 1995, 1996; Ligon et al., 1998). На сегодняшний день описано 12 больных и очерчен симптомокомплекс, называемый DEFECT 11 синдром по основным признакам: делеция, увеличенный родничок (форамина), экзостозы, черепнолицевой дизостоз, умственная и физическая отсталость.

Редко встречаемыми признаками являются: микропенис, гипотония, ано­малии дерматоглифики, эпикант и телекант (Bartsch et al., 1996). Выявлен един­ственный случай, когда описанный симптомокомплекс сопровождался WAGR- комплексом и почти полной делецией короткого плеча хромосомы 11 (McGaughran et al., 1995, Gustavson et al., 1994). Синдром DEFECT 11, так же, как и синдром Лангера-Гидиона, является синдромом генных последовательностей, т.к. множественные экзостозы и форамина объединяются только в случае деле- ции хромосомы 11.

Основная масса МЭ при МЭХД по структуре и расположению идентичны таковым как при СЛГ (Langer et al., 1984), так и при выше описанном синдроме (Bartsch et al., 1996).

1.2.3. Генетическое картирование МЭХД.

Наличие экзостозов при СЛГ позволило предположить, что наиболее ве­роятным районом локализации гена, ответственного за МЭХД, является район 8q24.1. Однако, в работе Cook с соавт. (1993) по сцеплению МЭХД с районом хромосомы 8q24.1 с использованием микросателлитных ДНК-маркеров удалось показать, что только в 8 семьях из 11 было обнаружено достоверное сцепление - лод-балл равный 8,11. Наиболее вероятным оказалось расположение гена между локусами D8S85 и D8S199. Это послужило основанием для предположения о на­личии генетической гетерогенности МЭХД и инициировало поиски других воз­можных генов, ответственных за возникновении патологии. В частности, в рабо­те Le Merrer с соавт. (1992) не было получено сцепления МЭХД с участком хро­мосомы 8q24.1. Авторами были использованы 8 маркеров, имеющих ПДРФ, из них 4 располагались более чем в 40 сМ от "критического" района. Позже, этой же группе авторов удалось показать сцепление МЭХД с локусом короткого плеча хромосомы 19 (Le Merrer et al.,1994). Анализируя 21 семью с использованием высокополиморфных микросателлитных маркеров, авторам удалось сцепить за­болевание с локусом D19S221 с достаточно высокой вероятностью - лод балл - 7,22 и показать, что предполагаемый ген ЕХТЗ расположен между локусами D19S413 и D19S221, расстояние между которыми оценивается в 2-3 м.п.н., одна­ко этот ген до сих пор не клонирован.

Анализ сцепления с использованием микросателлитных маркеров из рай­онов возможной локализации трех генов МЭХД в 12 многопоколенных семьях с МЭХД позволило локализовать ген ЕХТ1 в участке хромосомы 8q24.1 между ло­кусами D8S592 и D8S199 в 6 семьях, а в других 6 - на хромосоме 11р11.2, между локусами D11S905 и D11S554 (Blanton et al., 1996).

Другая группа авторов, исследуя две больших семьи с МЭХД, которые не имели сцепления с хромосомой 8q24.1, обнаружила сцепление заболевания с микросателлитными маркерами, картированными в прицентромерном районе короткого плеча хромосомы 11р11.2. Сцепление было показано с локусом D11S554 - наибольший лод-балл равнялся 7.148 (Wu et al., 1994). Исследуя ка- риотипы нескольких больных, имеющих, кроме множественных экзостозов, аномалии развития и умственную отсталость, Van Hul с соавт. (1995) показали наличие микроделеции в участке хромосомы 11(р11.2-р12), что явилось под­тверждением локализации второго гена МЭХД на хромосоме 11. Т.о., в настоя­щее время определено два основных района, изменения в которых приводят к МЭХД: 8q24.1 и 11р11.2. В этих районах клонированы гены ЕХТ1 и ЕХГ2, соот­ветственно (Legein-Mallet et al., 1997).

1.2.4. Клонирование гена ЕХТ1.

Ген ЕХТ1 клонирован в 1995 году. Работа осуществлялась двумя группа­ми из Хьюстона (США) и из Эссена (ФРГ) и заключалась в клонировании точек разрыва при транслокации хромосом t(4;8)(pl5.3;q24.1) и перицентрической ин­версии inv(8)(p23;q24.1) при СЛГ. Используя контиг космидных клонов хромо­сомы 8 ими была проведена гибридизация in situ на хромосомах, полученных из лимфобластоидных клеточных линий с указанными перестройками и определе­ны космидные клоны, которые оказались в точках разрыва. С использованием космидных клонов был проведен скрининг кДНК-библиотек (полученных из фе- тального мозга, фетального хряща и плаценты) и выявлено несколько перекры­вающихся кДНК-клонов, предположительно соответствующих экзонам предпо­лагаемого гена ЕХТ1. В сумме эти кДНК клоны составили 3287 п.н. и имели от­крытую рамку считывания длиной в 2238 п.н., кодирующей 746 аминокислот. Предполагаемая аминокислотная последовательность не показала гомологии ни с одним из известных белков, также, как и нуклеотидная последовательность не обнаружила сходства с известными генами (Ahn et al., 1995; Ludecke et al., 1996). Нозерн-анализ с использованием этой последовательности показал единичный гибридизационный сигнал на мРНК, полученной из печени, почек, мозга, пла­центы, сердца, легких, скелетной мышцы и хондроцитах, причем наибольшая экспрессия наблюдалась в печени и почках. Клонированный ген ЕХТ1 состоит из 11 экзонов и занимает около 330 т.п.н. на геномной ДНК. Ген имеет большой по размерам первый экзон - 1725 п.н., составляющий 43% кодирующей области, и необычно большой первый интрон, составляющий 250 т.п.н. Остальные 10 экзо­нов с интронными областями занимают около 70 т.п.н. (Ludecke et al., 1996). Промоторная область содержит крупный CpG-участок, характерный для генов "домашнего хозяйства"(Ludecke et al., 1997).


Дата добавления: 2015-08-27; просмотров: 57 | Нарушение авторских прав







mybiblioteka.su - 2015-2024 год. (0.02 сек.)







<== предыдущая лекция | следующая лекция ==>