Российская академия медицинских наук медико-генетический научный центр 2 страница

1.2.5. Клонирование гена ЕХТ2.

В 1995 году ген ЕХТ2 был картирован между локусами D11S1355 и D11S1361. Обнаружение ряда новых микросателлитных ДНК-маркеров в этом районе (Gyapay et al., 1994; James et al. 1994) позволило продолжить работу по более точной локализации второго гена МЭХД -ЕХТ2 (Wuyts et al. 1995). Были использованы ДНК-маркеры, соответствующие локусам D11S905 (7 аллелей), D11S1355 (4 аллеля), D11S903 (8 аллелей), D11S1361 (5 аллелей) и D11S554. Двухлокусные лод-баллы бьши подсчитаны между ЕХТ2 и ДНК-маркерами с ис­пользованием программ сцепления MLINK и ILINK. Семьи, в которых лод-балл хотя бы по одному маркеру не превышал +2, далее не анализировались.

В результате анализ проводился только на 7 семьях из 22 первоначально исследованных. Наиболее вероятным местом расположения гена являлся локус D11S903, который показал максимальный лод-балл при полном отсутствии ре- комбинационных событий - 17,883.

Более подробное изучение семейных гаплотипов и обнаружение рекомби­наций у больных позволило локализовать ген в участке, равном 3 млн.п.о. между локусами D11S1355 и D11S554.

На этой стадии был сконструирован контиг YAC- и Р1- клонов для участ­ка наиболее вероятного расположения гена-кандидата ЕХТ2. Было отобрано три клона, которые перекрывали локус D11S903. Только YAK 923В11, длиной 1690 т.п.о. содержал все маркеры данного района и был использован для скрининга библиотеки Р1 и кДНК селекции. При анализе выделенных кДНК клонов был отобран клон из кДНК библиотеки фетального мозга, длина которого составила 1813 п.н. и открытая рамка считывания составила 224 аминокислоты. Нуклео- тидная и белковая последовательности выявленного клона показали гомологию с ЕХТ1. Поиск по базам данных позволил выявить значительно большую кДНК последовательность, которая оказалась 3'- концом гена-кандидата ЕХТ2. Клони­рованный ген ЕХТ2 имеет открытую рамку считывания 2154 п.н., что соответст­вует 718 аминокислотам. Нозерн-анализ показал два сигнала, соответствующие 3,5 т.п.н. и 3,2 т.п.н., что позволяет предположить наличие альтернативного сплайсинга для ЕХТ2. В отличии от ЕХТ1, показавшего максимальную экспрес­сию в печени, а минимальную в сердце, ЕХТ2 имеет наибольшую экспрессию в сердечной мышце, плаценте и поджелудочной железе, а наименьшую в мозге и почках.

1.3. Возможная роль генов ЕХТ в процессе формирования скелета позвоночных.

Один из этапов формирования скелета позвоночных, представленного на ранних стадиях хрящевой тканью, впоследствии заменяющегося на костную, на­зывается энхондральной оссификацией или окостенением. Этот процесс начина­ется с выделения пула недифференцированных клеток мезенхимы. Клетки, нахо­дящиеся в центре этого образования, дифференцируются в хондроциты, в то время как клетки внешнего слоя образуют своего рода «футляр», названный пе- рихондриумом (надхрящницей). Эти предшественники скелетных элементов уд­линяются за счёт пролиферации хондроцитов и формирования матрикса. На сле­дующем этапе хондроциты в центральном районе хрящевого элемента прекра­щают пролиферацию, становятся гипертрофированными, наряду с этим происхо­дят изменения в экстрацеллюлярном матриксе (ЭМ). Изменения в ЭМ приводят к возможности васкуляризации этой области и вместе с этим к началу окостене­ния. Зоны пролиферирующих и гипертрофированных хондроцитов постепенно отодвигаются в направлении концов скелетного элемента. Преждевременному окостенению препятствует продолжающаяся пролиферация хондроцитов в дис- тальных частях костей и жесткий контроль скорости их дифференцировки в ги­пертрофированные хондроциты. Регуляция скорости энхондральной оссифика- ции является критической для костного морфогенеза, так как играет основную роль в детерминации объёма и длины скелетного элемента (A.Vortkamp, 1996; Bianco et al., 1998).

1.3.1. Hedgehog белки как регуляторы эмбрионального развития.

Известно, что при эмбриональном развитии многих организмов требуется упорядоченная система межклеточных взаимодействий, для осуществления ко­торых служат экстрацеллюлярные сигнальные молекулы. Среди них выделяют семейство так называемых Hedgehog белков, представленных высоко консерва­тивными молекулами, которые передают ключевые сигналы при развитии эм­бриональных тканей и органов (Коуаша et al., 1996; Akiyama et al., 1997). Пер­вым из этого семейства был охарактеризован ген сегментной полярности hh у

Drosophila (Nasslein-Volhard et al., 1980). Продукт этого гена ответственен за ре­гуляцию эмбриональной сегментации и порядок расположения имагинальных дисков. Гомологи гена hh были выявлены и у других видов беспозвоночных и позвоночных животных. У высших позвоночных известно, как минимум, три белка из этого семейства: Sonic hedgehog (Shh), Desert hedgehog (Dhh) и Indian hedgehog (Ihh) (Echelard et al., 1993). Продукты hh генов характеризуются тремя основными свойствами: автопротеолитической функцией, сигнальной активно­стью и способностью диффундировать на большие расстояния. Характерной особенностью структуры белков этого семейства является наличие высоко кон­сервативного протеолитического сайта, представленного гистидином в позиции 313. В результате посттрансляционного автопротеолитического процессинга об­разуется N-терминальный пептид и С-терминальный пептид с молекулярным ве­сом 19 kDa и 26 Ша, соответственно. (Valentini et al., 1997). Функцию сигналь­ной последовательности выполняет N-терминальный пептид, для которого пока­зана высокая степень консервативности в эволюции (Kumar et al., 1996; Ming et al., 1998).

Наиболее широко распространенным в различных тканях является Shh белок. Экспрессия shh показана при закладке нервной трубки, конечностей и сегментов тела, а также зубов, волосяных фолликул, кишечника и легких, то есть всех структур, закладка которых основывается на эпителиально-мезенхимальных взаимодействиях, причем экспрессия shh происходит исключительно в эпителии (Bitgood, 1995).

Для ihh показаны две основные области экспрессии: эндодерма кишечни­ка и хрящевая ткань. На ранних этапах развития кишечной трубки наблюдается некоторое перекрывание экспрессии ihh и shh, но на более поздних стадиях экс­прессия ihh выявляется в более дифференцированных клетках, в то время как shh экспрессируется в недифференцированных клетках. Второй район экспрессии ihh - ростовая зона кости, а именно, прегипертрофированные хондроциты (Yang et al., 1998). Далее процессы в этой области будут рассматриваться более подробно.

И, наконец, dhh экепрессируется в районах, не перекрывающихся с экс­прессией shh и ihh: в мужских гонадах, в клетках Сертоли соматического проис­хождения и их предшественниках, в периферических нервах - в некапсулиро- ванных Швановских клетках. Помимо этого показана экспрессия dhh в области развивающегося атриовентрикулярного клапана сердца и в эндотелиальных клетках больших кровеносных сосудов (Marigo et al., 1996).

Не последней по значимости ролью Hh белков является активация допол­нительных сигнальных путей, участвующих в регуляции развития эмбриона. Для Drosophila показана роль Hh в активации экспрессии генов dpp и wingless, участ­вующих в регуляции закладки имагинальных дисков. Аналогично, Shh белок ре­гулирует экспрессию dpp гомолога - bone morphogenetic protein-2 (bmp-2) в ко­нечностях цыпленка (Kingsley et al., 1994). В работе Bitgood и др. (1995) показана четкая корреляция между экспрессией семейства hh генов и семейства Ьтр генов в тканях мышей: в зубах, волосах, кишечнике, уретре, легких и др. Выявлено, что экспрессия Ътр-2/Ьтр-4 происходит в мезенхиме, прилежащей к эпителию, в ко­тором экепрессируется shh. Интересно, что взаимодействие между Hh и Втр не ограничивается Shh белком. Подобная корреляция экспрессии показана для ihh в эпителии кишечника и Ътр-4 в примыкающей мезенхиме, а также ihh и Ътр-6 в хряще. Экспрессия dhh в эндокардиуме атриовентрикулярного клапана коррели­рует с экспрессией bmp-2,-4,-6 (Bitgood et al., 1995).

Корреляция экспрессии ihh и Ътр-6 в хряще является особенно интерес­ной, так как позволяет определить место Ътр-6 в системе регуляции роста хряща и формировании кости. В этой ткани ihh экепрессируется в менее дифференци­рованных клетках ростовой зоны, а именно, в прегипертрофических хондроци- тах, тогда как Ътр-6 - в дифференцированных производных этих клеток, в гипер­трофических хондроцитах. Это наблюдение ставит Ihh в сигнально-регуляторной цепи над Втр-6, так как экспрессия гена ihh предшествует экспрессию гена Ътр- 6 (Iwasaki et al., 1997). Приведенные данные заставляют предполагать, что, во- первых, гены Ьтр могут быть основными «мишенями» Hh сигналов и, во- вторых, система взаимного обмена при эпителиально-мезенхимальных взаимо­действиях включает сигнальную «петлю» между hh- и Ътр- экспрессирующими клетками в смежных клеточных популяциях (Zou et al., 1997).

Помимо описанных взаимодействий Hh белков с Втр белками, показано взаимодействие в частности Ihh с другим представителем ряда цитокинов, а именно, трансформирующим фактором pocma-Rl (TGFB1), причем последний является регулятором экспрессии ihh в остеобластах (Murakami et al., 1997). Эта регуляция основана на стабилизации мРНК ihh, что приводит к увеличению ко­личества копий полипептида. Костная реконструкция основана на балансе согла­сованной регуляции multiple calcitropic factors остеобластов и остеокластов. Цен­тральную роль в регуляции формирования кости играют белки TGFR семейства. Очевидно одно, что Ihh является ранее неизвестным членом этой системы, но его роль до конца не выяснена. Выявление экспрессии ihh в остеобластах, наряду с упомянутой ранее экспрессией ihh в прегипертрофических хондроцитах предпо­лагает, что, белок Ihh выполняет, очевидно, различные функции на двух полно­стью различных этапах оссификации.

1.3.2. Молекулярная регуляция дифференцировки хряща.

В работе A. Vortramp и др. (1998) показана роль Ihh как регулятора ско­рости перехода пролиферирующих хондроцитов в гипертрофированные, а значит регулятора морфогенеза скелета. Ими был клонирован Ihh цыпленка, который состоит из 408 аминокислот, содержит консервативный протеазный сайт и NH2- терминальный домен, идентичный на 93% с Shh белком.

Экспрессия ihh установлена в районе перехода от пролиферирующих хондроцитов к гипертрофированным, а точнее, в прегипертрофированных клет­ках, в то время как гены-мишени этого белка gli и ptc экспрессируются в пери- хондриуме. То есть существует механизм передачи этого сигнала, о котором бу­дет сказано ниже. Полная схема регуляции перехода от пролиферирующих хонд­роцитов к гипертрофированным включает еще несколько белков. Parathyroid hormone-related protein (PTHrP) экспрессируется в периартикулярном перихонд- риуме, а его рецептор (РТН/РТНгР receptor) экспрессируется в прегипертрован- ной зоне раньше, чем ген ihh (Suda, 1997; Chung et al., 1998; Kronenberg et al.,
1998). Эта регулирующая система работает следующим образом (Рис 1.). Как только в пролиферирующих хондроцитах в прегипертрофированной зоне экс- прессируется РТН/РТНгР рецептор, это значит, что клетки однозначно станут гипертрофированными. В них происходит скоротечная экспрессия //г/г, пока клетки не станут гипертрофированными. 1Ш-сигнал действует на гены-мишени которые экспрессируются в перихондриуме, примыкающем к прегипер­трофированной зоне. Продукты этих генов прямо или опосредованно действуют на более дистальный периартикулярный перихондриум, активируя экспрессию РТНгР белка, который в свою очередь блокирует экспрессию РТН/РТНгР ре­цепторов, что препятствует недифференцированным хондроцитам двигаться в направлении гипертрофированного пути. Таким образом, белки Шк и РТНгР пу­тём простой обратной связи регулируют скорость дифференцировки хондроци- тов и баланс между ростом и окостенением скелетных элементов (Ьапэке е1 а1., 1996).

Молекулярная регуляция

Генная

экспрессия

ктШ

же-.*?

Морфология

дифференциации

Пролиферирующие хоидроыиты

РТН/РТНгР

гесерЮг

Препгаертрофич хоидроциты

Гнифтрофич. хондрошпы

Рис. 1. Молекулярная регуляция скорости дифференцировки хондроцитов.

1.3.3. Предполагаемые функции и свойства ЕХТ белков.

Остаётся открытым вопрос о механизме передачи сигнала Ihh из зоны прегипертрофированных хондроцитов в перихондриум. Именно на роль участ­ников в этом механизме предполагается обсуждаемое семейство ЕХТ - генов.

Механизм, позволяющий Hh белкам диффундировать на большие дистан­ции, до сих пор непонятен. Однако, было показано Bellaiche и др. (1998) для Drosophila, что для диффузии Hh, которые экспрессируются в клетках задних от­делов имагинальных дисков, в передние отделы, необходимо присутствие белка Ttv, который представляет собой интегральный мембранный белок 2 типа и при­надлежит к семейству ЕХТ генов. Гомология его с геном ЕХТ1 составляет 56%, геном ЕХТ2 - 25%.

Наряду с этим установлено, что ЕХТ1 белок, будучи трансмембранным гликопротеином 2 типа, участвует в синтезе гликозаминогликанов (ГАГ) кле­точной поверхности (Me Cormick, 1998; Lin et al., 1997). Экспрессия EXTI в клетках приводит к появлению на их поверхности новых форм гепарансульфатов (ГС).

Протеогепарансульфаты (ГСПГ) широко представлены на клеточной по­верхности в экстрацеллюлярном матриксе в различных типах тканей (Schmidt et al., 1988). Роль ГСПГ показана в таких физиологических процессах, как клеточ­ная адгезия, обеспечение действия цитокинов, регуляция энзиматического ката­лиза (Ghiselli et al., 1998; Stickens et al., 1998). Своими биологическими качества­ми они обязаны взаимодействию с различными экстрацеллюлярными белками посредством специфических полисахаридных последовательностей.

Биосинтез ГС включает формирование полисахаридной цепи из мономе­ров D-глюкуроновой кислоты (GlcA) и/или N-ацетил D-глюкозаминовой кисло­ты (GlcNAc) по 1 - 4 в цепи. Этот полимер частично модифицируется в серии ре­акций, включая N-деацетилирование и N-сульфатирование GlcNAc единиц, а также О-сульфатирование GlcA единиц (Linholt et al., 1992; Lind et al., 1993; Lin­dahl et al., 1998; Kusche-Gull et al., 1998). Таким образом, для биосинтеза ГС не­обходима активная а1,4-]\[-ацетилгексозаминилтрансфераза (Fritz et al., 1994; Li et al., 1997; Griffiths et al., 1998). При идентификации al,4-N- ацетилгексозаминилтрансферазы, вьщеленной из бычьей кровяной сыворотки была выявлена гомология ее с ЕХТ2 белком на 94% (Lind et al., 1998). Таким об­разом, оказалось, что белок ЕХТ2 обладает GlcA-трансферазной и GlcNAc- трансферазной активностью, необходимой для синтеза ГС. Подобное свойство выявлено еще у одного белка из семейства ЕХТ, а именно у EXTL2 (Kitagawa et al., 1999). Lind и др. ввел новое понятие для определения функции ЕХТ белков: ГС-полимеразная активность (ГС-ПОЛ). Роль биосинтеза ГС в этиологии МЭХД пока не ясна, но в связи с тем, что ГС, как представители ГАГ, широко участву­ют в сигнал-передающих системах, можно предполагать, что изменения в био­синтезе ГС могут приводить к МЭХД.

Очевидно, что полная потеря ГС-ПОЛ активности приведет к отсутствию ГС, тогда как частичная его потеря - к уменьшению количества и/или формиро­ванию более коротких цепей с измененной структурой. Поскольку МЭХД - забо­левание генетически гетерогенное и может развиваться вследствие либо наруше­ния структуры гена ЕХТ1, либо гена ЕХТ2, очевидно, что ГС-ПОЛ активность одного белка не может замещать активность другого. Возможно, они активны на различных этапах полимермодифицирующего процесса или являются генетиче­ски различными изоформами, соответствующая комбинация которых необходи­ма для синтеза специфических ГС.

Из всего вышесказанного следует, что обсуждаемая сигнальная система опосредована изменением в экстрацеллюлярном матриксе, вследствие появления новых форм ГАГ, а именно ГС при непосредственном участии ЕХТ белков. Из этого следует, что нарушение функции ЕХТ белков приводит к изменению со­стояния экстрацеллюлярного матрикса, что в свою очередь делает невозможным нормальное функционирование системы регуляции дифференцировки хондроци- тов, что, по-видимому, и является причиной возникновения экзостозов и их оз- локачествления.

Во многих других типах злокачественных опухолей также выявляется ха­рактерное изменение гликозаминогликанов, в частности, несульфатированных

ГС (Iozzo, 1989). Ряд новых генов, показывающих высокую гомологию с геном ЕХТ1, то есть относящихся к семейству ЕХТ генов, картированы в хромосомных районах, ассоциированных с различными формами рака. Например, EXT LI кар­тирован в районе 1р36, часто делетируемом при различных формах рака (Wise et al., 1997), EXTL3 - ген-кандидат, ответственный за опухоль мозга, картирован в локусе 8р12-22 (Van Hui, 1998). Также в локусе 1р11-р12 картирован ген EXTL2, показавший гомологию с ЕХТ1 и ЕХТ2 генами 24% и 25% соответственно (Wuyts et al., 1997; Saito et al, 1998). Семейство EXT генов, следовательно, может пред­ставлять новый класс генов-модификаторов либо генов-супрессоров опухолевого роста, который проявляет своё действие путем модификации протеогликанов, окружающих клеточную поверхность. Причем, это семейство является высоко консервативным среди различных видов. Помимо описанных гомологичных ге­нов у Drosophila, выделены два гена, гомологичные EXT, у Caenorhabditis elegans - видов, не имеющих хрящевой и костной ткани (Clines et al., 1997).

1.4. Поиск причин, приводящих к озлокачествлению.

Hall с соавт. (1985) не обнаружили каких-либо хромосомных нарушений в культурах, полученных из экзостозов. Спустя 10 лет Mertens с соавт. (1994) об­наружили структурные хромосомные аномалии, приведшие к потери дистальной части длинного плеча хромосомы 8 в трех из восьми спорадических костно- хрящевых экзостозах. Участок хромосомы 8q24.1 был поврежден во всех трех случаях. Авторы предположили, что ген, несущий мутантный аллель, наследу­ется в поколениях и приводит к развитию МЭ только в случае какой-либо сома­тической мутации в гомологичной хромосоме. Еще одним фактом, подтверж­дающим гетерогенность заболевания, стали исследования секционного мате­риала хондросарком, развившихся из экзостозов. Была выявлена большая семья с МЭХД, у одного члена которой была обнаружена хондросаркома (Hecht et al. 1995; Hecht et al., 1997). Эта семья показала сцепление с микросателлитными ДНК-маркерами хромосомы 11. Геномная ДНК из лимфоцитов больного была сравнена с ДНК из экзостоза по микросателлитным ДНК маркерам, соответст­вующим трем участкам расположения генов - 8q24.1, 1 lpl 1.2 и 19р12. Бьша вы­явлена потеря гетерозиготности (ПГ) в опухоли только по маркерам хромосом 8 и 11. Авторы обнаружили конституциональную делецию, затрагивающую локус D11S903, у всех больных в семье как в крови так и в опухолевом материале. Кроме того, была проанализирована ДНК из лимфоцитов и спорадических хонд- росарком от 6 неродственных пациентов, два из которых имели МЭХД. В одной опухоли, развившейся из экзостоза, была установлена ПГ по ДНК-маркерам хро­мосомы 8. В другом образце спорадической хондросаркомы была обнаружена делеция и ПГ по маркерам хромосомы 11. Эти факты заставили предполагать,

что гены ЕХТ 1 и ЕХТ 2 могут являться генами - супрессорам, подавляющими

ф.

процесс злокачественной трансформации, а сама трансформация является много­ступенчатым процессом.

Подобное исследование было проведено Raskind с соавт. (1995). Бьша об­наружена потеря гетерозиготности по полиморфным маркерам в областях карти­рования генов МЭХД. В одном случае была выявлена ПГ по маркерам хромосо­мы 8q24.1 в хондросаркоме, развившейся из экзостоза. Анализируя спорадиче­ские хондросаркомы, в 4 случаях из 17 была выявлена ПГ по маркерам, сцеплен­ным с ЕХТ 1, vil случаев показали ПГ по маркерам, сцепленным с ЕХТ 2. В це­лом, ПГ по маркерам, соответствующим двум генам-кандидатам, составила 44% в 18 опухолях, в то же время, ПГ не обнаружена для предполагаемого гена ЕХТ 3 на хромосоме 19. Одна опухоль показала ПГ только по маркерам хромосомы 8q24.1, три опухоли показали ПГ только по маркерам хромосомы 11р12 и четыре опухоли показали ПГ по маркерам обеих хромосом. ПГ по внутригенным марке­рам гена р53 (фактор некроза опухолей) была выявлена в 4 опухолях из 14. Эти опухоли были очень агрессивные и авторы предполагают, что мутации в ЕХТ ге­нах могут свидетельствовать о начальных стадиях злокачественной трансформа­ции, в то время, как мутации в р53 ассоциируются с прогрессированием заболе­вания.

1.5. Поиск и характеристика мутаций. 1.5.1. Типы и номенклатура мутаций.

Под мутацией понимают все изменения в последовательности ДНК, неза­висимо от их локализации и влияния на жизнеспособность особи. Таким обра­зом, понятие мутации является более широким по сравнению с понятием му- тантного аллеля, которое применительно к гену означает нарушение его функ­ции. В научной литературе достаточно часто встречающиеся в популяции вари­анты последовательностей генов, не приводящие к заметным нарушениям функ­ций, обычно рассматриваются как нейтральные мутации или полиморфизмы, то­гда как понятие «мутация» и «мутантный аллель» употребляются как синонимы (Горбунова, Баранов, 1997).

Различные изменения в нуклеотидной последовательности транскриби­руемых областей ДНК могут иметь различные фенотипические проявления. Му- тантные аллели в связи с этим подразделяют на три класса:

- мутации, ведущие к полной потере функции;

- мутации, сопровождающиеся количественными изменениями соответствующих мРНК и первичных белковых продуктов;

- доминантно-негативные мутации, изменяющие свойства белковых субъединиц таким образом, что они оказывают повреждающее действие на жизнеспособ­ность или функционирование экспрессирующих типов клеток.

По месту локализации в различных типах ДНК-последовательности мута­ции подразделяют на следующие три типа:

- мутации, затрагивающие кодирующие последовательности генов;

- мутации, затрагивающие внутригенные некодирующие последовательности генов;

- мутации в регуляторных последовательностях за пределами экзонов (Б^асИап, 1996).

К первому типу относится большинство выявляемых в настоящее время патогенных мутаций. В случае миссенс-мутаций наиболее часто замены, приво­дящие к изменениям на уровне белка, затрагивают нуклеотидные основания в первой или во второй позиции кодоиа, однако замены основания в третьей пози­ции кодона также могут приводить к серьезным нарушениям из-за вероятности активации криптических сайтов сплайсинга. К высоко мутабильным районам, так называемым «горячим точкам» мутагенеза, относят CpG обогащенные рай­оны и тандемные повторы в кодирующих районах ДНК.

Второй тип мутаций, как правило, представляет небольшую часть (10­15%) от общего числа патогенных мутаций, выявляемых в определенном генном локусе (Cooper et al., 1995). Однако, весьма уязвимыми для этих мутаций явля­ются гены с небольшими экзонами и большим количеством интронов. Обычны­ми мутации сайтов сплайсинга являются в генах, кодирующих коллагены, кото­рые содержат от 50 до 106 интронов (Cooper et al., 1995).

Большинство мутаций, затрагивающих регуляторные области, выявляют в настоящее время в промоторной части генов, где они изменяют консервативные последовательности. Этот тип мутаций остается пока наименее изученным и, возможно, часть не выявляемых в ряде патологий мутаций относится к этому ти­пу. Мутации, затрагивающие регуляторные области генов сопровождаются, как правило, количественными изменениями соответствующего продукта и не затра­гивают структуры и функциональной активности белка. Проявление таких мута­ций определяется пороговым уровнем концентрации белка, при котором его функция еще сохраняется. Как правило, регуляторные мутации менее серьезны и обладают более выраженным плейотропным эффектом по сравнению с мутация­ми структурных генов.

По типу изменениия в нуклеотидной последовательности выделяют мута­ции сдвига рамки считывания, приводящие либо к образованию бессмысленно­го белка, либо к преждевременному окончанию его синтеза, обладающие вместе с нонсенс-мутациями, представляющими собой замены нуклеотидов, при кото­рых образуются терминирующие кодоны, наибольшим повреждающим действи­ем. Мутации сдвига рамки считывания возникают вследствие делеции или ин- серции, некратные трем нуклеотидам. Проявление таких мутаций зависит от их локализации. Чем ближе мутации к началу гена, то есть к началу транскрипции, тем короче их белковые продукты, которые не способны к модификациям и бы­стро деградируют. Фенотипическое проявление замен в кодонах миссенс- мутаций зависит от природы соответствующих аминокислотных замен в белке и от функциональной значимости того домена, в котором это произошло. Так, за­мены аминокислот в активных центрах белков могут сопровождаться полной по­терей его функциональной активности, тогда как даже значительно более серьез­ные нарушения в других частях белка часто оказывают существенно меньшее влияние на фенотип (Горбунова, Баранов, 1997).

Мутации на стыке экзонов и интронов - мутации сайтов сплайсинга - часто нарушают процессинг первичного РНК-транскрипта, в результате чего происходит либо неправильное вырезание соответствующей интронной области и трансляция бессмысленного удлиненного белка, не защищенного от протеоли- тического действия внутриклеточных ферментов, либо вырезания экзонов и об­разование делетированного белка. Во всех случаях мутации сайтов сплайсинга, как правило, обусловливают тяжелое течение болезни. Наиболее часто мутации затрагивают существенные инвариантные ОТ и АО динуклеотиды, локализован­ные соответственно в начале интрона (донорный сайт сплайсинга) и в конце ин- трона (акцепторный сайт сплайсинга). В результате чего происходит потеря эк- зона (Рис. 2). Критическое значение имеют также последовательности, прилежа­щие к указанным динуклеотидам, а также так называемый ЬгапсЬ-сайт (сайт ветвления), расположенный около акцепторного сайта сплайсинга на расстоянии 6-59 нуклеотидов (Рис. ЗА). Самый консервативный в ЬгапсЬ-сайте - аденозин, который непосредственно участвует при образовании петли с донорным сайтом сплайсинга в процессе вырезания интрона (Рис. ЗВ). Помимо этого ЬгапсЬ-сайт выполняет функцию связывания с малым ядерным рибонуклеопротеиновым комплексом 112. Для млекопитающих определена наиболее характерная последо­вательность нуклеотидов, фланкирующих высоко консервативный аденозин:

Т С ТА С

5' - N------------ Аг 3'

С ТСС т

Мутация

Происходящие в этих последовательностях изменения также приводят к нарушению нормального процесса сплайсинга. В настоящее время в литературе описан ряд мутаций, затрагивающих последовательность ЬгапсЬ-сайта. Замены, вставки и делеции в непосредственном окружении (3-5 нуклеотида) консерва­тивного аденина часто приводят к сбоям нормального процессинга с потерей эк- зона, прилегающего к интрону с поврежденным ЪгапсЬ-сайтом (Burrows at al., 1998). Иногда незаконный сплайсинг может произойти при мутациях, затраги­вающих последовательности, которые в норме не участвуют в сплайсинге. Тако­выми являются криптические сайты сплайсинга, причем в зависимости от распо­ложения криптического сайта в интроне или в экзоне, получающаяся мРНК бу­дет удлинена за счет фрагмента интрона, либо укорочена, вследствие потери час­ти экзона (Рис. 4) (Strachan, 1996)

Мутация

II

IL

AG

AT

AG

GT-

Рис. 2. Мутации сайтов сплайсинга: I - мутация в акцепторном сайте сплай­синга приводит к потере следующего за нитроном экзона; II - мутация в до- норном сайте сплайсинга приводит к потере предыдущего интрону экзона.

ЬгапсЬ-сайт

акцепторный

экзон

экзон донорныи

Т СТА С

- N-------- А------ \\-

сайт сплаисинга

в А

АОСТ- АОТ^-

с тсв т сайт сплаисинга СССССС С • И-Ав

В.

Экзон	г
	си

ЬгапсЬ-сайт

------- А-------------

Экзон 2

АС

Дата добавления: 2015-08-27