Российская академия медицинских наук медико-генетический научный центр 3 страница

Разрезание 5'конца

си

Ав

формирование петли

хю

АС

Разрезание З'конца и сплайсинг РНК

Рис. 3. А. — консенсусные последовательности донорного сайта сплайсинга, акцепторного сайта сплайсинга и ЬгапсЬ-сайта в интронах эукариот. В. - механизм сплайсинга РНК с участием ЬгапсЬ-сайта.

экзон 1

экзон 2

-ТТТТАСС-

Криптический акцепторный сайт

СТССАвв

вт

АС

Криптический акцепторный сайт

Мутация

экзон 2А

АС

Рис. 4. В результате мутации в донорном сайте сплайсинга и активации криптических сайтов сплайсинга возможно образование мРНК-продукта: А. - удлиненного при активации внутриинтронного криптического сайта сплайсинга; В. - укороченного при активации внутриэкзонного криптиче­ского сайта сплайсинга.

До недавнего времени единой номенклатуры записи мутаций не сущест­вовало. В 1992 г. была предложена универсальная стандартная система для обо­значения разных мутаций (Beudet, Tsui, 1993). Она рассчитана как на запись аминокислотных замен в белках, так и на нуклеотидные замены и перестановки в ДНК. В первом случае каждой аминокислоте соответствует однобуквенный сим­вол, слева записывается нормальный вариант аминокислоты, справа - мутант- ный, а расположенный в центре номер соответствует месту замены в цепочке первичного продукта трансляции. Буквой X обозначается место остановки синте­за полипептидной цепи при нонсенс-мутациях. Отсутствие одной или несколь­ких аминокислот обозначают значком Д-дельта.

Отсчет нуклеотидов в молекуле ДНК начинается с первого смыслового кодона, так что нуклеотид под номером +1 соответствует первому нуклеотиду в молекуле кДНК. Для многих генов отсутствие точных данных о положении ини­циирующего сайта и наличии нескольких мест инициации транскрипции сущест­венно затрудняет нумерацию нуклеотидов. Нуклеотиды экзонов обозначают за­главными буквами, интронов - прописными. Нуклеотидная система записи осо­бенно важна для обозначения инсерций, делеций, мутаций сайтов сплайсинга и полиморфизмов, не связанных с заменами аминокислот или происходящих в не- транслируемых частях гена. В случае делеции или инсерции одного или двух нуклеотидов проводится их буквенное обозначение; при делеции или инсерции трех и более нуклеотидов указывается только их число (Горбунова, Баранов, 1997).

При обозначении мутаций сайтов сплайсинга записывают номер крайнего нуклеотида в ближайшем к мутации экзоне, число нуклеотидов (со знаком «+» в случае 3'-конца экзона и со знаком «-» в случае 5'-конца) и характер нуклеотид- ной замены (Горбунова, Баранов, 1997).

1.5.2. Методы идентификации мутаций.

Идентификация мутантных аллелей, т. е. обнаружение нарушений в нук- леотидной последовательности ДНК, является самым точным методом молеку­лярной диагностики наследственных заболеваний.

Цитологические методы. Большие перестройки - делеции, инверсии, ду­пликации, транслокации - размером более 1 млн. п. н., затрагивающие целые ге­ны или несколько генов, могут быть обнаружены на цитологических препаратах с использованием карт высокого разрешения (анализ дифференциально окра­шенных прометафазных хромосом). Также большая разрешающая способность (до 50 т.п.н.) может быть достигнута при работе на специальным образом приго­товленных (растянутых) интерфазных хромосомах с использованием техники гибридизации in situ (FISH).

Метод блот-гибридизации. Мутации, изменяющие длину рестрикцион- ных фрагментов, могут быть выявлены путем блот-гибридизации рестрициро- ванной геномной ДНК с соответствующими ДНК-зондами. К числу таких мута­ций относятся достаточно протяженные, но не идентифицируемые цитогенети- чески, внутригенные делеции, инсерции и дупликации, а также точечные мута­ции, локализованные в сайтах рестрикции.

Непременным условием реализации метода блот-гибридизации для поис­ка подобных мутаций является наличие ДНК-зонда, являющегося либо частью гена, либо тесно сцепленной с этим геном ДНК-последовательностью. При поис­ке таких мутаций геномную ДНК от здорового донора и больного обрабатывают часто щепящими рестриктазами, подвергают электрофорезу, блот-гибридизации с меченным ДНК-зондом и проводят сравнительный анализ расположения сиг­налов на радиоавтографе. Особенно информативными оказываются рестриктазы Mspl и Taql, которые узнают сайты CCGG и TCGA, соответственно.

Метод секвенирования. Любые типы мутаций могут быть обнаружены путем прямого секвенирования мутантной кДНК или отдельных экзонов, и часто первичный поиск нарушений в кодирующих областях гена осуществляют имен­но таким образом. Для некоторых генов, имеющих небольшие размеры, метод прямого секвенирования с успехом применяется как основной метод сканирова­ния мутаций. Так, в частности, особенно удобным оказалось его применение для детекции мутаций в сравнительно небольших по размеру генах, таких, например, как ген фактора IX свертывания крови (гемофилия В).

Разработанные в последние годы модификации методов ПЦР значительно облегчили секвенирование амплифицированных фрагментов и повысили его эф­фективность. Так, в частности, предложен вариант асимметричной ПЦР, когда при амплификации концентрация одного из олигопраймеров в несколько десят­ков раз превосходит концентрацию другого праймера, в результате чего синтези­руется преимущественно только одна, нужная для секвенирования цепочка ДНК.

Методы, основанные на ПЦР технологии. Однако в общем случае секве­нирование полноразмерной кДНК, или всех экзонов, для генотипирования мута­ций у отдельных пациентов достаточно трудоемко, дорого и требует больших затрат времени. Поэтому на практике чаще проводят предварительный отбор бо­лее простыми методами амплифицированных фрагментов ДНК, предположи­тельно содержащих мутации, а затем секвенируют только эти участки ДНК. Ме­тоды поиска фрагментов ДНК, содержащих мутации, основаны на сравнитель­ном анализе мутантных и нормальных последовательностей по целому ряду фи­зических и химических характеристик, которые в значительной степени варьи­руют в зависимости от типа мутационного повреждения (Бгуе е1 а1., 1989; Ьапёе- §геп е1 а1., 1996). Следует подчеркнуть, что, независимо от метода детекции му­тации, точные молекулярные характеристики каждой мутации могут быть полу­чены только путем прямого секвенирования.

Наиболее просто обнаруживаются мутации, изменяющие длину ампли­фицированных фрагментов, так как подобные нарушения легко выявляются при электрофоретическом анализе. Так, протяженные делеции, захватывающие це­лые экзоны в генах, сцепленных с полом, могут успешно выявляться при исполь­зовании так называемого мультиплексного варианта ПЦР. Разница в размерах и числе амплифицированных фрагментов позволяет легко идентифицировать такие мутации на электрофорезе. Данный подход применим к анализу делеций в ауто- сомных генах только в тех случаях, когда возможно дополнить ПЦР количест­венной оценкой результатов амплификации. Оригинальный метод идентифика­ции подобных делеций у гетерозигот основан на использовании в качестве мат­ричной ДНК для ПЦР кДНК, полученной путем обратной транскрипции мРНК, изолированной из экспрессирующих данный ген тканей пациента. В отличие от нормального гомолога, в мутантной молекуле кДНК граничащие с делецией эк- зоны сближены. Для обнаружения гетерозигот по протяженным внутригенным делециям проводят мультиплексную ПЦР с использованием системы олигоп- раймеров, полностью перекрывающих всю молекулу кДНК. Наличие делеции регистрируют по появлению продуктов амплификации необычного размера.

После выявления различий между нормальной и мутантной ДНК по длине амплифицированного фрагмента необходимо провести секвенирование необыч­ного фрагмента с целью определения изменений в нуклеотидной последователь­ности предположительно мутантной ДНК.

При мутациях гена, представляющих собой замену одного или нескольких нуклеотидов, длины амплифицированных фрагментов остаются постоянными, однако, некоторые физико-химические свойства мутантных молекул меняются. С учетом этих особенностей разработаны различные варианты поиска мутантных фрагментов ДНК и идентификации в них точковых мутаций. Ведущими из этих методов являются: метод анализа конформационного полиморфизма одноните- вой ДНК (SSCP), метод анализа гетеродуплексов (НА), денатурирующий гради­ентный гель-электрофорез (DGGE) и метод химического расщепления неком­плементарных сайтов (CMC).

Основными методами, предназначенными для скрининга неизвестных му­таций и использованными в настоящей работе, являются SSCP-анализ и анализ гетеродуплексов.

SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) - метод анализа кон­формационного полиморфизма однонитевой ДНК (Orita et al., 1989; Teschauer et al., 1996) основан на регистрации различий в электрофоретической подвижности однонитевых ДНК, одинаковых по величине, но различающихся вследствие нук- леотидных замен по пространственной организации молекул. Конформация не­больших однонитевых ДНК зависит от нуклеотидной последовательности, по­этому замена даже одного нуклеотида приводит к изменению пространственной структуры. Метод включает амплификацию фрагментов ДНК размером до 300 п.

о., денатурацию продуктов ПЦР и нативный высокоразрешающий электрофорез в полиакриламидном геле. Конформационный метод выявления точечных мута­ций получил широкое распространение вследствие относительной простоты и возможности обнаруживать любые типы замен. Однако ограничением примене­ния этого метода является размер исследуемого фрагмента ДНК, так как высокая эффективность детекции мутаций, составляющая 80-95%, показана при длине фрагментов менее 200 п. н., в то время как для фрагментов более 400 п. н. веро­ятность обнаружения мутаций уменьшается до 50% (Cawthon et al., 1990).

В настоящее время разрешающая способность метода значительно повы­шена. В частности, разработаны подходы для идентификации точковых мутаций методом SSCP-анализа в амплифицированных фрагментах ДНК размером до 800 п.н., для этого используется ПААГ с низким значением рН (Cotton et al., 1998).

НА (Heteroduplex analysis) - позволяет выявлять мутации, находящиеся в гетерозиготном состоянии, а также инсерции и делеции (Keen et al., 1991; Gan­guly et al., 1993). Принцип этого метода заключается в следующем. При ампли­фикации фрагментов генов гетерозигот, последующей денатурацией и медлен­ной ренатурацией полученных продуктов ПЦР, в амплификационной смеси на­ряду с двумя типами гомодуплексов образуются гетеродуплексы между нор­мальной и мутантной цепями ДНК. Такие гетеродуплексные молекулы отлича­ются по электрофоретической подвижности от гомодуплексов за счет конфор- мационных особенностей в местах несовпадения нуклеотидов, электрофоретиче- ская подвижность гетеродуплексов значительно ниже, чем гомодуплексов. Эти различия обнаруживаются при электрофорезе в обьгчном полиакриламидном ге­ле. Обычно гетеродуплексный анализ проводят вместе с SSCP анализом, что по­зволяет значительно увеличить вероятность обнаружения мутации (Axton, 1998).

1.5.3. Детекция мутаций в генах ЕХТ1 и ЕХТ2.

После того, как в 1995-1996 гг, были клонированы гены, ответственные за развитие МЭХД, выявлена их экзон-интронная структура, началась активная ра­бота по поиску и характеристике мутаций в этих генах у больных. Основная ра­бота ведется по выявлению точковых мутаций при помощи SSCP-анализа и гете- родуплексного анализа. Поскольку МЭХД - заболевание генетически гетероген­ное, это значительно усложняет и делает трудоемким этот поиск. Спектр описан­ных на данный момент в литературе мутаций не выявил «мажорных» мутаций, хотя наибольшее количество мутаций определено в гене ЕХТ1, в его NH2- терминальной области. В основном это миссенс-мутации и мутации сдвига рам­ки считывания.

Даже для семейных форм с МЭХД не всегда удается выявить мутацию. В обзорной публикации Wuyts и др. (1998) указывается, что при исследовании 26 семей с МЭХД в 10 - выявлена мутация в гене ЕХТ1, в 10 - в гене ЕХТ2 и в 6 семьях мутацию установить не удалось.

В работе Raskind и др. (1998) обследовано 34 пробанда, из них 23 имели семейную форму заболевания. В работе использовался метод прямого тотального сиквенса всех экзонов ЕХТ1 гена. Мутации выявлены у 14 пробандов и только две мутации выявлены более чем в одной семье.

В работе Philippe и др. (1997) при обследовании 17 пробандов, мутации определены в 12 случаях, из них 7 - в гене ЕХТ1, 5 - в гене ЕХТ2. Более под­робно частота, спектр и характеристика мутаций будет рассмотрена в главе 3.

Возможно, что неполное выявление причин заболевания происходит из-за наличия еще не клонированных генов, например, гена ЕХТЗ, картированного на хромосоме 19, хотя анализ сцепления показал лишь незначительную долю семей, в которых заболевание сцеплено с этим локусом. Другое объяснение - использо­вание методов детекции мутаций, не позволяющих выявлять большие пере­стройки, инверсии, дупликации, делеции и т. д. Видимо, является целесообраз­ным использовать метод блот-гибридизации с ДНК-зондами, представленными участками генов ЕХТ, для выявления структурных перестроек, затрагивающих эти районы и приводящих к развитию заболевания.

Помимо этого, в представленных работах не проводился анализ некоди- рующих областей, прилегающих к исследуемым генам, в частности, промотор- ных районов, 3' и 5' нетранслируемых районов, первого интрона гена ЕХТ1, со­стоящего из 250 т.п.н. Вероятно, что эти районы могут содержать регуляторные последовательности, мутации в которых приводят к нарушению нормального процесса транскрипции.

Наряду с перечисленными причинами неполного выявления мутаций у больных МЭХД, нельзя забывать о наличие других генов, участвующих в регу­ляции дифференцировки хондроцитов, мутации в которых также, очевидно, мо­гут приводить к развитию заболевания.

РЕЗЮМЕ.

В настоящее время определено два основных района, изменения в кото­рых приводят к МЭХД: 8q24.1 и 11р11.2. В 1995 году в районе 8q24.1 клониро­ван ген ЕХТ1, который состоит из 11 экзонов, имеет открытую рамку считывания в 2238 п.н., кодирующую 746 аминокислот. В 1996 году был клонирован ген ЕХТ2 в районе lip 11.2, состоящий из 15 экзонов, имеющий открытую рамку считывания в 2154 п.н., что соответствует 718 аминокислотам.

Исследования по определению природы и функции белков ЕХГ1 и ЕХТ2 показали, что данные белки скорее всего представляют собой трансмембранные белки второго типа, участвующие в синтезе гепарансульфатов на клеточной по­верхности. Таким образом, £АТ-белки могут опосредованно влиять на диффузию белка Ihh — участника системы регуляции скорости дифференцировки хондроци­тов.

Семейство ЕХТ - генов рассматривают в настоящее время как новое се­мейство генов-супрессоров опухолевого роста, которое проявляет свое действие путем модификации протеогликанов, окружающих клеточную поверхность.

Поиск мутаций, который интенсивно начал проводиться в ряде лаборато­рий в последние два года, показал, что значительная часть изменений (>50%), приводящих к развитию МЭХД, приходится на ген ЕХТ1, около 30% мутаций выявляется в гене ЕХТ2, в 20% случаев мутации в кодирующей части генов ЕХТ1 и ЕХТ2 выявить не удается. По-видимому, эти изменения затрагивают некоди- рующие области изучаемых генов, либо расположены в других генах из ЕХТ- семейства.

Частота и спектр мутаций в генах ЕХТ1 и ЕХТ2 недостаточно охарактери­зован. Основная масса описанных мутаций относится к мутациям сдвига рамки считывания, нонсенс-мутациям и мутациям сайтов сплайсинга, то есть к мутаци­ям, приводящим к синтезу укороченных нефункциональных белков. Однозначно «мажорных» мутаций не выявлено, хотя показано, что в основном мутации лока­лизуются в NH2-терминальной части белков.

По данным литературы, от 5 до 14% случаев МЭХД претерпевает злока­чественную трансформацию во вторичную хондросаркому или остеогенную сар­кому, причем частота озлокачествления постоянно растет. В работах по изуче­нию спорадических новообразований в ряде случаев показана ПГ по одному или обоим клонированным генам EXT. В двух случаях спорадической остеогенной саркомы определены соматические точковые мутации в гене ЕХТ1. Но спектр мутаций, повышающих риск озлокачествления, пока не выявлен.

Все это определило цели и задачи исследования, которое является заклю­чительным этапом проекта по картированию и клонированию генов, ответствен­ных за развитие МЭХД в рамках ГНТП «Геном человека».

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Обследование больных.

Пациенты поступали из НПО МГНЦ РАМН, отделений травматологии и ортопедии и онкологии Российской детской клинической больницы МЗ РФ, Ин­ститута детской онкологии и гематологии ВОНЦ РАМН, Института педиатрии и детской хирургии МЗ РФ и ЦИТО им. Приорова МЗ РФ.

Было обследовано 53 пациента с МЭХД из них 25 со спорадической фор­мой заболевания, 28 - члены 11 семей с наследственной формой заболевания. Основными критериями служили фенотипические признаки, наличие множест­венных экзостозов. Все пациенты были обследованы с использованием рентге­нологических методов для подтверждения или опровержения диагноза множе­ственных экзостозов.

Также обследовано 9 больных со спорадическими злокачественными но­вообразованиями, затрагивающими различные части скелета. У четырех из них выявлена остеогенная саркома, у двоих - остеогенная саркома с выраженным хондрокомпонентом и у троих - хондросаркома. Диагнозы подтверждены гисто­логическими исследованиями операционного материала больных.

В отношении наличия хромосомной патологии все пациенты были об­следованы с использованием высокоразрешающих методов хромосомного ана­лиза. Исследование было проведено в лаборатории клинической цитогенетики МГНЦ РАМН. У пациентов, за исключением одного случая, хромосомной пато­логии не выявлено.

2.2. Забор венозной крови.

Для получения ДНК использовали венозную кровь пациентов и членов их семей. В качестве консерванта использовали 0.5 М раствор ЭДТА. При за­боре к 1 мл консерванта добавляли 10 мл крови и тщательно перемешивали.

2.3. Выделение геномной ДНК.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного моле­кулярного веса использовали следующий метод выделения ДНК из крови

(Sambrook et al., 1989):

1. Лизировали клетки крови, добавляли 9 объемов раствора, содержащего О, 32 М сахарозы, 10 mM Tris-HCl, pH 7, 5, 5mM MgC12, 1% Triton X-100.

2. Центрифугировали лизат для осаждения ядер при 1000g в течение 10 мин.

3. Супернатант тщательно удаляли и растворяли осадок в 1/10 первона­чального объема крови раствора ТЕ, pH 8.0.

4. Добавляли протеиназу К до концентрации 50 мкг/мл и SDS до 0.5%. Об­разец тщательно перемешивали.

5. Инкубировали 2 часа при 37 С.

6. Доводили объем образца до 5 мл раствором ТЕ, pH 8.0 и последователь­но проводили экстракцию ДНК равными объемами фенола, смеси фе­нол-хлороформ и хлороформом (Маниатис и др., 1984).

7. К образцу добавляли 1/10 объема 5М ацетата натрия, рН5, 3, перемеши­вали и осаждали ДНК 2.5 объемами холодного 96% этанола, выдержива­ли образец 30 мин. при -70 С.

8. Пробу центрифугировали при 00С, 15 мин. с ускорением 12000g. Вы­сушивали осадок ДНК на воздухе и растворяли в 200 мкл ТЕ рН8.0. Вы­ход ДНК составлял 25-50 мкг на 1 мл крови. После полного растворения ДНК, ее концентрацию измеряли на флюориметре фирмы "Hoefer". Для определения молекулярного веса ДНК проводили электрофорез в ага- розном геле. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК фага-лямбда, гидролизованную Hindill. Для проведения исследований с использованием блот-гибридизации, пригодной считали ДНК длиной не менее 50 т.п.н. Для проверки возможности расщепления ДНК рест- риктазами проводили пробную рестрикцию и электрофорез. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК тимуса человека и ДНК фага, обработанную рестриктазой Hind III.

Для получения ДНК из операционного материала больных, костный ма­териал измельчали в жидком азоте, затем переходили к этапу 3. (Sambrook et al., 1989).

2.4. Рестрикция и электрофорез при проведении блоттинг-гибридизации.

1. 10 мкг нативной ДНК обрабатывали ферментами рестрикции в объеме 30-50 мкл с трехкратным избытком рестриктазы в течение ночи, при необ­ходимом рН и 37 С или 65 С.

2. Электрофорез проводили в 0, 8% агарозном геле толщиной 4-5 мм в 1х ТВЕ. На дорожку наносили 5-10 мкг рестрицированной ДНК. Электрофо­рез проводили в течение ночи в электрическом поле с напряженностью 1.5 В/см. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК фага, обработанную рестриктазой Hindlll или Pstl.

Перенос ДНК из геля проводился на мембрану Hybond N с использовани­ем метода вакуумного блоттинга, который состоял в следующем:

1) на пористую поверхность аппарата для переноса помещали фильтр Hybond N, гель помещали на фильтр и подключали аппарат к насосу, при помо­щи которого создавали разряжение в 40-50 см водного столба;

2) на поверхность геля наносили раствор 0,25 М НС1 для депуринизациии на 4 мин, для денатурации ДНК на гель наносили раствор 0,5М NaOH, 1,5М NaCl на 3 мин;

3) перенос проводился раствором 0,25М NaOH, 1.5М NaCl в течение 60

мин;

4) после переноса фильтр нейтрализовали в 2xSSC в течение 2-х мин. и высушивали на воздухе;

5) фильтр помещали в термостат +80 С на 2 часа для фиксации ДНК.

2.5. Гибридизация с радиоактивно меченым зондом.

Для мечения двунитевой плазмидной ДНК использовали меченый dCTP [Р32] произведенный в г.Обнинске с удельной активностью 3000 Кю/ммоль. Т.к. dCTP поступал в водно-спиртовом растворе, перед процедурой мечения его лиофилизировали и затем растворяли в воде. Для мечения использовали метод ник-трансляции и набор Nick-translation kit фирмы" Boehringer Mannheim". Про­цедуру мечения проводили по протоколам фирмы.

Эффективность включения меченного нуклеотида достигала 90%, но удовлетворительной считали эффективность больше 50%. При помощи стан­дартной процедуры получали зонды с удельной активностью (0,6-1.8) 109 срм/мкг. Гибридизацию проводили в пакете по следующей схеме:

1. Фильтр предгибридизовали при слабом покачивании 1-2 часа при 65 С в 30ml следующего раствора: 2х раствор Денхардта (вместо БСА вводили сухое молоко), 10 mM NaH2P04, 0,5% SDS, 0,16 MNaCl,pH 7.0;

2. Гибридизацию проводили в том же растворе, но с 10% декстрана сульфата и добавлением зонда до концентрации 30-50 нг/мл в те­чение ночи при 65 С при слабом покачивании;

3. После гибридизации фильтр отмывали от неспецифически свя­завшегося зонда в 100ml раствора по следующей схеме: 2xSSC, 0,1% SDS при 65 С 3 раза по 20 мин. 0,lxSSC, 0,1% SDS при 65 С 2 раза по 10 мин. при слабом покачивании. Финальная отмывка подбиралась эмпирически и варьировала по времени и кратности SSC;

4. После отмывки фильтр высушивали на воздухе;

5. Фильтр экспонировали в течение 1-5 дней при -70 С.При этом ис­пользовали кассеты с усиливающими экранами ЭУИ1 и рентге­новскую пленку фирмы "Туроп" (Швейцария).

2.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Полимеразную цепную реакцию проводили по стандартной схеме (Saiki 1989) при помощи программируемого термоциклера РНС-2 фирмы "Techne" с использованием термофильной ДНК-полимеразы Taq фирмы "MBI" г. Вильнюс.

ПЦР проводили по следующей схеме: 0,05 мкг геномной ДНК, 0,05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 50 мкл однократного буфера для ПЦР прогревали в течение 7 мин. при 950С, добавляли 1-2 единицы термофильной ДНК-полимеразы, 40-60 мкл вазелиного масла и проводили 37 циклов с параметрами:

денатурация: 94 С- 30 сек.

отжиг: 45-65 С- 40 сек.

Элонгация: 72 С- 45-60 сек.

Режим отжига и синтеза цепи зависит от конкретной пары праймеров. Финальную инкубацию проводили при 72 С в течение 7 мин. При проведении реакции с помощью термофильной полимеразы в качестве буфера для ПЦР использовали раствор следующего состава: 50 мМ КС1, 10 мМ трис-HCl рН8,4, 1.5 мМ MgC12, 0,1 мг/мл BSA, 0,01% твин-20.

Оптимальное молярное содержание MgC12 в буфере подбирали экспери­ментальным путем для каждой пары используемых олигопраймеров.

Результаты эксперимента оценивали в 2% агарозном геле или в 6-12 % ПААГ, с последующим прокрашиванием в растворе бромистого этидия концен­трацией 1 мг/мл, в качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК фага X, гидролизованную Pstl, и pUC19, гидролизованную Hpall.

2.7. Радиоактивная и нерадиоактивная детекция точковых мутаций методом SSCP.

Поиск мутаций проводили стандартным методом SSCP (Landegren, 1996). Для радиоактивной детекции ДНК в этом методе использовали радиоактивноме- ченые dATP[P32] или dCTP[P32]. Меченный предшественник вводили в реакци­онную смесь амплификации. Пробы подвергали тепловой денатурации 10 мин.

при 95°С, потом резко охлаждали во льду в присутствии денатурирующего бу­фера: 95% формалин, 10 мМ NaOH, 0,25% ксиленцианол, 0,25% бромфеноло- вый синий. Затем наносили в 8% ПААГ.

Состав 8% ПААГ: 14 мл 40% раствора акриламида(АА), 3.5 мл 10х буфера TBE, 3.5 мл глицерина до 70 мл диет. Н20,

700 мкл 10% аммония персульфата(АРЗ), 280 мкл TEMED.

Электрофорез проводили при U=150V при комнатной температуре в те­чение 5-7 часов или U=70V при комнатной температуре в течение 15 часов. Ви­зуальный контроль электрофореза проб ДНК проводили по ксиленцианолу. За­тем гель на стекле высушивали и закладывали с рентгеновской пленкой фирмы "Туроп" Швейцария и экспонировали ее в течение 12-16 часов. Полученный ав­тограф анализировали визуально.

Для нерадиоактивной детекции мутаций использовали новую, разрабо­танную в лаборатории, модификацию метода окраски нитратом серебра (Яценко, 1996).

Гель помещали в раствор 10% метанола и 5% уксусной кислоты на 10 мин., отмывали дважды дистиллированной водой. Затем гель инкубировали в растворе 0,011 М/л AgN03 в течение 10 мин., трижды промывали в дистиллиро­ванной воде. Проявление геля проводили в модифицированном растворе прояви­теля (изменена концентрация НСНО) около 10-15мин., в зависимости от необхо­димой интенсивности окраски исследуемых проб: 0.75 М/л NaOH, 0.50 М/л НСНО, 2,30 мМ/л Na(BH4). Гель дважды промывали дистиллированной водой и фиксировали 5% ук­сусной кислотой в течение 10 минут.

2.8. Анализ гетеродуплексов.

1. 2-6 мкл амллификата смешивали с равным объемом буфера

Состав буфера: 90% формамид, lxTBE, 0,05 ксиленцианол, 0,05 бромфе- ноловый синий.

2. Проводили температурную денатурацию кипячением в течение 5 мин. и оставляли на 15 мин при комнатной температуре.

3. Проводили электрофорез в 10% ПААГ (39:1) с добавлением 10% глице­рина при U=180V при 4°С от 3 до 5 часов.

4. После электрофореза проводили окрашивание серебром по приведен­ной выше методике.

2.9. Определение нуклеотидной последовательности.

При прямом сиквенсе для приготовления матрицы были использо­ваны праймеры соответствующих экзонов. Реакцию проводили с праймером UNIQV*: 5'^ioopec4eHH-d(GTTCGTACGTGAATCGCGGTAC)-3' по про­токолу DNA Sequencing System (Promega) при следующих условиях: 95°С - 2 минуты, затем 30 циклов: 94°С - 30 секунд, 55°С - 30 секунд, 72° С - 45 секунд.

Реакцию останавливали добавлением в смесь стоп-раствора, со­держащего 95% формамида и 5% голубого декстрана. Затем образцы подвергали электрофорезу в 6% ПААГ с исходным соотношением АА/БА=19/1, содержа­щим 7М мочевины. В качестве электрофорезного буфера использовали 0.6*ТВЕ. Электрофорез, регистрацию и обработку результатов проводили на приборе ALFTM DNA Sequencer (Pharmacia Biotech).

2.10. Программное обеспечение компьютерного анализа

ДНК.

Компьютерный анализ ДНК проводился с использованием следующих программ:

1) анализ ДНК на наличие сайтов ферментов рестрикции при помощи программ Genbank Pustell, Genepro, WIN-SUN;

2) определение относительного содержания AT, GC динуклеотидов при помощи программ Genbank Pustell, Genepro;

3) анализ последовательности на наличие возможных функциональных районов и сайтов сплайсинга при помощи программы Autogene 1.1;

4) компьютерное конструирование праймеров ПЦР при помощи програм­мы Oligo 4.0.

5) анализ хроматограмм отсеквенированных последовательностей и рас­печатка результатов с помощью программ Executor и Chromas.

Дата добавления: 2015-08-27