Nhe I G GCTAGC C
CG GCTAGC CG
CTA GCTAGC TAG
Pst I G CTGCAG C
TGCA CTGCAG TGCA
Таблица II.1 (окончание)
Процент расщепления
олигонуклеотида после
инкубации в течение
Рестриктаза Последовательность
олигонуклеотидов в
окрестностях сайта
рестрикции
Длина
цепи, нт
2 ч 20 ч
Pvu I C CGATCG G
AT CGATCG AT
TCG CGATCG CGA
Sac I C GAGCTC G 8 10 10
Sac II G CCGCGG C
TCC CCGCGG GGA
>90
Sma I CCCGGG
C CCCGGG G
CC CCCGGG GG
TCC CCCGGG GGA
>90
Spe I G ACTAGT C
GG ACTAGT CC
CGG ACTAGT CCG
CTAG ACTAGT CTAG
>90
>90
Sph I G GCATGC C
CAT GCATGC ATG
ACAT GCATGC ATGT
Xba I C TCTAGA G
GC TCTAGA GC
TGC TCTAGA GCA
CTAG TCTAGA CTAG
>90
>90
>90
>90
Xho I C CTCGAG G
CC CTCGAG GG
CCG CTCGAG CGG
Примечание. Курсивом выделены последовательности сайтов рестрикции.
ДНК-метилазы. Большинство штаммов E. coli содержит два типа
ферментов, метилирующих ДНК: dam- и dcm-метилазы. Первая осуществляет
перенос метильных групп в N-положение аденина в последовательности GATC.
В таком случае многие рестриктазы (например Bcl I, Mbo I или Cla I), в состав
сайтов рестрикции которых входит данная метилированная
последовательность, перестают расщеплять ДНК по этим сайтам. Аналогичное
действие на некоторые рестриктазы, например EcoR II, оказывает и dcm-
метилаза, осуществляющая метилирование остатков цитозина по положению
С5 в последовательностях CMeCAGG и CMeCTGG. Для того чтобы избежать
нежелательного влияния этих метилаз на клонируемые ДНК, в качестве хозяев
используют мутантные штаммы E. coli: dam- и dcm-. ДНК-метилазы
бактериальных систем рестрикции и модификации применяют для
блокирования in vitro соответствующих сайтов рестрикции на исследуемых
фрагментах ДНК с целью получения под действием гомологичных рестриктаз
фрагментов больших размеров.
7.1.2. ДНК- и РНК-лигазы
Создание фосфодиэфирных связей в одноцепочечных разрывах
двухцепочечной ДНК с помощью ДНК-лигаз является наряду с рестрикцией
одним из важнейших этапов получения рекомбинантных ДНК in vitro.
Наибольшее применение в генно-инженерных исследованиях находит ДНК-
лигаза __________бактериофага Т4. Реакция лигирования протекает в два этапа (рис. II.3).
Вначале образуется промежуточный комплекс фермент–АМР (этап 1), после
чего остаток АМР переносится на 5’-фосфатную группу концевого нуклеотида в
точке разрыва ДНК (этап 2). Образовавшаяся фосфодиэфирная связь
гидролизуется во время нуклеофильной атаки 3’-ОН группы соседнего
нуклеотида, что приводит к образованию новой фосфодиэфирной связи,
восстанавливающей целостность сахаро-фосфатного остова ДНК. Т4-ДНК-
лигаза осуществляет соединение фрагментов двухцепочечной ДНК,
обладающих комплементарными "липкими" или "тупыми" концами. Как следует
из механизма реакции, необходимым условием протекания лигирования
является наличие 5’-концевого фосфата и 3'-концевого гидроксила в точках
разрыва цепей ДНК. При этом эффективность соединения фрагментов ДНК по
"тупым" концам Т4-ДНК-лигазой возрастает в присутствии Т4-РНК-лигазы,
которая осуществляет ковалентное соединение 5’-фосфорилированных концов
одноцепочечных ДНК или РНК с 3’-ОН группами одноцепочечных нуклеиновых
кислот.
Рис. II.3. Механизм лигирования ДНК Т4-ДНК-лигазой
____________1 – образование промежуточного комплекса фермент Е–AMP; 2 –
образование фосфодиэфирной связи
7.1.3. Ферменты матричного синтеза ДНК и РНК
К ферментам матричного синтеза нуклеиновых кислот относятся
многочисленные ДНК- и РНК-зависимые ДНК- и РНК-полимеразы,
осуществляющие зависимый от матричных ДНК или РНК синтез нуклеиновых
кислот. Эти ферменты обычно используются в генной инженерии для
получения двухцепочечных молекул ДНК из одноцепочечных, а также для
обратной транскрипции, т.е. синтеза двухцепочечных ДНК, комплементарных
мРНК, которые называют комплементарными ДНК (кДНК).
ДНК-зависимые ДНК-полимеразы. Среди ДНК-зависимых ДНК-
полимераз наибольшее применение в генной инженерии находят ДНК-
полимераза I E. coli и ее большой фрагмент (фрагмент Кленова), Т4-ДНК-
полимераза и в последнее время термостабильные ДНК-полимеразы, особенно
ДНК-полимераза Thermus aquaticus (Taq-полимераза). Все эти ферменты в
присутствии ионов Mg2+ из четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dATP,
dCTP, dGTP и TTP) осуществляют синтез ДНК, комплементарной матричной
ДНК, и для функционирования требуют наличия затравки на одноцепочечной
матричной ДНК, т.е. олиго- или полидезоксирибонуклеотида со свободным 3’-
ОН-концом, комплементарного матричной ДНК. ДНК-полимераза I E. coli
состоит из одной полипептидной цепи с молекулярной массой около 109 кДа и
обладает тремя активностями: полимеризующей в направлении 5’→3’, 5’→3’-
экзонуклеазной и 3’→5’-экзонуклеазной. Большой фрагмент ДНК-полимеразы I
E. coli (фрагмент Кленова) является частью полипептидной цепи ДНК-
полимеразы I с молекулярной массой около 76 кДа, у которой отсутствует
домен, соответствующий 5’→3’-экзонуклеазе. Как ДНК-полимераза I, так и ее
фрагмент используются для введения радиоактивно меченных
дезоксирибонуклеотидов в синтезируемые цепи ДНК путем ник-трансляции,
т.е. перемещения одноцепочечного разрыва вдоль молекулы двухцепочечной
ДНК, в котором 3’-ОН-конец используется в качестве затравки для ферментов.
При этом ДНК-полимераза I прокладывает себе путь с помощью 5’→3’-
экзонуклеазы, а фрагмент Кленова вытесняет цепь ДНК с 5’-конца. Кроме того,
фрагмент Кленова используют для синтеза второй цепи кДНК, секвенирования
ДНК по методу Сенгера, заполнения 5’-выступающих "липких__________" концов ДНК с
образованием "тупых" концов, введения концевой радиоактивной метки, а также
для удаления 3’-выступающих концов рестрикционных фрагментов ДНК 3’→5’-
экзонуклеазой этого фермента. Как и ДНК-полимераза I E. coli, Т4-ДНК-
полимераза обладает 3’→5’- (но не 5’→3’-) экзонуклеазной активностью,
которая у последней, по крайней мере, в 200 раз выше. Это позволяет
использовать Т4-ДНК-полимеразу, в частности, для введения радиоактивной
метки путем реакции обмена немеченного 3’-концевого нуклеотида на
меченный радиоактивным изотопом.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Термостабильная Taq-
полимераза в настоящее время широко используется для проведения
полимеразной цепной реакции (ПЦР), а ее модифицированный аналог – и для
секвенирования ДНК по методу Сенгера. Сущность ПЦР заключается в
следующем (рис. II.4). Реакционная смесь обычно содержит исследуемую ДНК,
dATP, dCTP, dGTP и TTP, Taq-полимеразу и два синтетических
олигодезоксирибонуклеотидных праймера длиной 15–30 нуклеотидов,
комплементарных участкам противоположных цепей ДНК, фланкирующих
исследуемый участок ДНК-матрицы. ПЦР начинается с кратковременного (1–2
мин) прогревания реакционной смеси при ∼95o, в процессе которого происходит
плавление цепей матричной ДНК и инактивация примесных белков, которые
могут присутствовать в реакционной смеси, если используется недостаточно
очищенная матричная ДНК, например из клинических образцов. Далее
реакционную смесь охлаждают до температуры отжига праймеров с матричной
ДНК (37–65o). В результате праймеры связываются с комплементарными им
местами на матрице и с этого момента начинают служить затравками для
синтеза Taq-полимеразой новых цепей ДНК, комплементарных каждой из цепей
денатурированной матричной ДНК. Для проведения синтеза ДНК в
оптимальных для Taq -полимеразы условиях температуру реакционной смеси
поднимают до 72o и при такой температуре проводят элонгацию цепей вновь
синтезирующейся ДНК в течение 0,5–2 мин. По окончании стадии синтеза ДНК
заканчивается первый цикл ПЦР, после чего проводятся такие же второй,
третий и т.д. в автоматическом режиме. По окончании третьего цикла уже
образуется дискретный продукт ПЦР – фрагмент двухцепочечной ДНК,
содержащий на своих 5’-концах последовательности нуклеотидов праймеров.
Количество продукта ПЦР в реакционной смеси после завершения каждого
цикла удваивается и, следовательно, по мере прохождения реакции
экспоненциально возрастает, достигая нескольких микрограммов в
реакционной смеси объемом 25–50 мкл. По окончании ПЦР содержимое
реакционной смеси анализируют электрофорезом в агарозном геле в
присутствии бромистого этидия, где продукт реакции выявляется в УФ-свете.
Продукт ПЦР можно выделить из агарозного геля в чистом виде и работать с
ним, как с обычным фрагментом двухцепочечной ДНК, т.е. гидролизовать
рестриктазами, клонировать в плазмидных векторах по "липким" и "тупым"
концам, секвенировать или использовать в качестве зондов при гибридизации.
С помощью ПЦР можно амплифицировать in vitro сегменты ДНК длиной
от 0,1 до 5–7 т.п.о. и более, а для получения положительного результата
достаточно присутствия в реакционной смеси одной–двух копий
амплифицируемой последовательности нуклеотидов (например геномной ДНК,
содержащейся в одной–двух соматических клетках). При этом не возникает
необходимости в тщательной очистке матрицы, так как большинство
попадающих в реакционную смесь белков и ферментов инактивируется в
первых же циклах ПЦР и не оказывает влияния на протекание реакции при
высоких температурах. Благодаря таким особенностям, как простота
постановки, высокая чувствительность и воспроизводимость, ПЦР в последнее
время получила широкое распространение в фундаментальных и прикладных
исследованиях по молекулярной биологии и генетике. Возможность
амплификации любого сегмента ДНК, последовательность нуклеотидов
которого известна, и получение его по завершении ПЦР в гомогенном виде и
препаративном количестве делают ПЦР альтернативным методом
молекулярного клонирования коротких фрагментов ДНК. При этом не возникает
необходимости в применении тех сложных методических приемов, которые
используют в генной инженерии при обычном клонировании.
Рис. II.4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Поскольку специфичность ПЦР зависит главным образом от
соответствия последовательности нуклеотидов праймеров первичной структуре
амплифицируемых фрагментов ДНК, эта специфичность приближается к
абсолютной при повышении длины праймеров до 17–20 нуклеотидов. Такая
высокая специфичность и чувствительность позволяют использовать ПЦР для
ДНК-диагностики инфекционных и наследственных заболеваний человека, а
также вирусоносительства в тех случаях, когда вирусом в латентной форме
заражены лишь отдельные соматические клетки, например в случае вируса
иммунодефицита человека (ВИЧ) (см. главу 11). Разработка метода ПЦР во
многом расширила методические возможности молекулярной генетики, и в
частности генной инженерии, причем настолько, что это кардинально изменило
и усилило исследовательский потенциал многих ее направлений.
Точность амплификации ДНК термостабильными ДНК-полимеразами
является особенно критическим параметром в том случае, если продукты ПЦР
используются далее для конструирования экспрессирующихся генов.
Необходимость в уменьшении частоты мутаций стимулирует поиски новых
термостабильных ДНК-полимераз, амплифицирующих ДНК с большей
точностью. В табл. II.2 приведены результаты испытаний точности синтеза ДНК
различными коммерческими ДНК-полимеразами.
Относительно высокая точность синтеза ДНК in vitro ДНК-полимеразами
Pfu и Vent обусловлена наличием у них 3’-5’-экзонуклеазной корректирующей
активности. Частота ошибочно включенных нуклеотидов в результате
одновременного функционирования двух разных ДНК-полимераз в смесях,
применяемых для амплификации длинных сегментов ДНК (long PCR),
оказывается ниже, чем при использовании Taq-полимеразы, но выше, чем для
очищенной ДНК-полимеразы Pfu.
При проведении аллель-специфической ПЦР (см. раздел 11.1)
необходимо учитывать способность Taq-полимеразы инициировать синтез ДНК
на праймерах, 3’-концевой нуклеотид которых некомплементарен матричной
ДНК. При исследовании этого вопроса оказалось, что не все пары
Таблица II.2
Частота ошибок при синтезе ДНК, осуществляемом
термостабильными ДНК-полимеразами in vitro при проведении
ПЦР в оптимальных условиях
ДНК-полимераза
Частота мутаций
(на 1 нуклеотид/1 раунд репликации)
Pfu 1,3 10-6
Deep Vent 2,7 10-6
Vent 2,8 10-6
Taq 8,0 10-6
exo(-)Pfu и UITma 5,0 10-5
Смесь Taq/Pfu или Klentaq/Pfu ∼5 10-6
ошибочно спаренных нуклеотидов праймера и ДНК-матрицы одинаково
эффективно предотвращают синтез ДНК Taq -полимеразой. По способности
направлять синтез ДНК все такие пары 3’-концевого нуклеотида праймера и
соответствующего нуклеотида матричной ДНК располагаются в следующий
ряд: C–C, A–G, G–A, G–G < A–A < T–C, C–T, T–T << A–C, C–A << G–T, T–G
(данные фирмы "Cetus"). При этом наименее благоприятными для продолжения
синтеза ДНК являются пары нуклеотидов пурин–пурин и пиримидин–
пиримидин.
РНК-зависимые ДНК-полимеразы (обратные транскриптазы,
ревертазы). Обратные транскриптазы способны осуществлять синтез ДНК на
матрице РНК, полимеризуя четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата, как это
имеет место в случае ДНК-зависимых ДНК-полимераз. Обратные
транскриптазы, так же как и ДНК-полимеразы функционируют только при
наличии затравки. Широко используемая в генной инженерии обратная
транскриптаза вируса миелобластоза птиц помимо полимеризующей
активности обладает 5’→3’- и 3’→5’-экзорибонуклеазными активностями и
расщепляет РНК в ДНК-РНК-гибридах по процессивному механизму. Обратные
транскриптазы находят применение в синтезе двухцепочечных ДНК,
комплементарных РНК (особенно мРНК), для последующего ее клонирования в
плазмидных векторах при получении библиотек (клонотек) кДНК (см. раздел
7.3). Обратные транскриптазы, подобно ДНК-полимеразам, могут быть
использованы для введения радиоактивной или флуоресцентной метки в ДНК-
зонды в составе соответствующим образом меченных
дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.
Недавно способность синтезировать ДНК на матрице РНК в
определенных условиях была продемонстрирована для термостабильной ДНК-
полимеразы Thermus thermophilus. Это позволяет использовать ее для прямого
обнаружения специфических РНК в биологических образцах методом ПЦР.
Современные модификации такого подхода дают возможность в одной
реакционной смеси (и пробирке) синтезировать в реакции обратной
транскрипции небольшое число копий амплифицируемого фрагмента ДНК на
матрице РНК, которые сразу же используются тем же ферментом в качестве
матрицы в обычной ПЦР (one tube PCR).
7.1.4. Другие ферменты
Среди других многочисленных ферментов, используемых в генной
инженерии, прежде всего следует упомянуть полинуклеотидкиназы, которые
осуществляют перенос γ-фосфатных групп ATP на 5’-OH группы ДНК или РНК.
Полинуклеотидкиназа бактериофага Т4 широко используется для введения
радиоактивной метки в ДНК или РНК с целью получения радиоактивно
меченных зондов или секвенирования нуклеиновых кислот.
Терминальная трансфераза из тимуса теленка (терминальная
дезоксирибонуклеотидилтрансфераза), осуществляющая последовательное
присоединение дезоксирибонуклеозидмонофосфатов из пула
дезоксирибонуклеозидтрифосфатов к 3’-OH-группам молекул ДНК,
используется для введения радиоактивной метки в составе меченых
нуклеотидов в 3’-концы ДНК, а также присоединения к 3’-концам фрагментов
ДНК (особенно кДНК) протяженных гомополимерных последовательностей
нуклеотидов (коннекторов) для последующего их клонирования.
Щелочные фосфатазы бактерий (BAP) и кишечника теленка (CIAP)
катализируют удаление 5’-фосфатных групп ДНК или РНК, а также
расщепление макроэргических связей рибо- и
дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Их используют при подготовке
фрагментов нуклеиновых кислот к введению 5’-концевой радиоактивной метки
32Р, а также для предотвращения лигирования векторных молекул ДНК самих
на себя. Как уже упоминалось выше, ДНК-лигаза способна образовывать
фосфодиэфирные связи в одноцепочечных разрывах лишь при наличии в них
5'-концевого фосфата. Удаление 5'-концевых фосфатных групп молекул
вектора, лианеризованных с помощью одной рестриктазы во время его
подготовки для клонирования соответствующего фрагмента ДНК,
предотвращает образование кольцевых молекул вектора (без вставки), а также
его олигомеров во время лигирования с клонируемой последовательностью.
Необходимые для лигирования со вставкой фосфатные группы содержатся в
самих клонируемых фрагментах ДНК, а остающиеся в результате неполного
лигирования два одноцепочечных разрыва репарируются in vivo после
введения вектора со вставкой в бактериальные клетки.
В заключение следует рассмотреть некоторые нуклеазы, часто
используемые в генной инженерии. Нуклеазы – это гидролитические ферменты,
расщепляющие нуклеиновые кислоты. По механизму расщепления субстратов
нуклеазы разделяют на экзо- и эндонуклеазы. Экзонуклеазы осуществляют
последовательное отщепление моно- или небольших олигонуклеотидов с
концов молекул ДНК или РНК, тогда как эндонуклеазы вносят в молекулы
нуклеиновых кислот внутренние разрывы. В частности, к эндонуклеазам
относятся многочисленные рестриктазы, рассмотренные выше. Некоторые
нуклеазы обладают более широкой специфичностью и могут гидролизовать как
РНК, так и ДНК, а также одновременно проявлять эндо- и экзонуклеазную
активности. Нуклеаза Bal31 из Alteramonias aspejiana последовательно
отщепляет отдельные моно- и олигонуклеотиды с 5’- и 3’-концов
двухцепочечных ДНК, укорачивая обе цепи ДНК приблизительно с равной
скоростью. При этом нуклеаза Bal31 гидролизует и одноцепочечные ДНК.
Экзонуклеаза III E. coli катализирует последовательное отщепление 5’-
нуклеотидов из двухцепочечных ДНК в направлении 3’→5’. Фермент обладает
эндонуклеазной активностью по отношению к апуринизированной ДНК,
активностью РНКазы H (гидролиз РНК в РНК-ДНК-гибридах) и 3’-фосфатазной
активностью.
Экзонуклеаза фага λ катализирует последовательное отщепление 5’-
мононуклеотидов в двухцепочечных ДНК при наличии в них 5’-концевых
фосфатных групп. Ее используют для получения одноцепочечных молекул ДНК
с целью их последующего секвенирования.
Нуклеаза S1 из Aspergillus orizae специфически расщепляет
одноцепочечные молекулы ДНК с образованием 5’-фосфорилированных моно-
и олигонуклеотидов. Те же свойства присущи и нуклеазе золотистой фасоли
(mung bean).
Панкреатическая ____________рибонуклеаза A (РНКаза A) обладает активностью
эндорибонуклеазы, специфически расщепляющей фосфодиэфирные связи,
образованные пиримидиновыми нуклеотидами. Продуктами гидролиза
являются 3’-фосфорилированные пиримидиновые мононуклеотиды и
олигонуклеотиды, содержащие концевые пиримидин-3’-монофосфаты.
Панкреатическая дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I) представляет
собой эндонуклеазу, гидролизующую как одно-, так и двухцепочечную ДНК с
образованием сложной смеси моно- и олигонуклеотидов, содержащих 5’-
фосфатные группы. В присутствии ионов Mg2+ ДНКаза I независимо атакует
каждую цепь ДНК, при этом места разрывов располагаются статистически
вдоль молекулы, а в присутствии ионов Mn2+ расщепляет обе цепи ДНК
приблизительно напротив друг друга.
Рассмотренные ферменты не исчерпывают всего списка белков,
используемых в генной инженерии. Особенности применения многих из этих
ферментов для решения конкретных генно-инженерных задач будут не раз
обсуждаться при дальнейшем изложении принципов генной инженерии.
7.2. Векторы
Ферменты, описанные в предыдущем разделе, позволяют производить
тонкие манипуляции как с протяженными молекулами ДНК, так и с их
фрагментами. В частности, с помощью рестриктаз можно с большой точностью
разрезать молекулы ДНК, а образовавшиеся в результате фрагменты
соединять в любой желаемой последовательности друг с другом,
восстанавливая сахаро-фосфатный остов молекулы ДНК с помощью ДНК-
лигазы. Однако с использованием только этих ферментов еще нельзя решить
одну из основных методических задач молекулярной генетики – выделение
любой требуемой нуклеотидной последовательности в чистом виде и в
количестве, достаточном для исследования этих последовательностей
биохимическими методами. Исключение составляет метод ПЦР, однако его
применение ограничивается короткими последовательностями нуклеотидов.
Основная идея, позволяющая решать эту задачу, заключается в том,
чтобы присоединить исследуемые фрагменты ДНК к молекуле-переносчику,
которая могла бы автономно существовать внутри бактериальных или
эукариотических клеток в виде одной или нескольких копий и передаваться
вместе со встроенным в нее фрагментом ДНК от одной клетки к другой. Такие
молекулы-переносчики фрагментов нуклеиновых кислот были созданы, их
называют векторами, и они являются одним из важнейших инструментов
генной инженерии.
Идеальная векторная молекула должна обладать несколькими
обязательными свойствами. Во-первых, любой вектор должен длительное
время существовать в популяции клеток-хозяев, т.е. реплицироваться
автономно или вместе с хромосомами клеток. Во-вторых, в любом векторе
должны быть биохимические или генетические маркеры, которые позволяли бы
обнаруживать его присутствие в клетках. В-третьих, структура векторной
молекулы должна допускать встраивание в нее чужеродной
последовательности нуклеотидов без нарушения ее функциональной
целостности. Для конструирования векторов в генной инженерии используют
небольшие молекулы нуклеиновых кислот, способные к автономной репликации
в бактериальных и эукариотических клетках – плазмиды, хромосомы вирусов, а
также фрагменты хромосом эукариотических клеток.
7.2.1. Плазмидные векторы
Рис. II.5. Различные векторы для клонирования ДНК и их
рестрикционные карты
Обозначены положения уникальных сайтов рестрикции, а также
функционально значимых генов
а – векторная плазмида pBR322; б – экспрессирующая векторная
плазмида pUC18; в – векторная плазмида πAN7, предназначенная для
отбора рекомбинантных клонов с использованием гомологичной
рекомбинации; г – многофункциональная векторная плазмида Bluescript
Первые эффективные векторы для клонирования фрагментов
чужеродной ДНК, не утратившие своего значения и поныне, были получены с
использованием бактериальных плазмид. Большая серия векторных плазмид,
обозначенных символом pBR, создана на основе репликона природной
плазмиды ColEI, придающей клеткам E. coli устойчивость к колицину путем его
объединения с генами устойчивости к антибиотикам. Таким образом,
бактериальные клетки, несущие подобные комбинированные плазмиды,
приобретали устойчивость к соответствующим антибиотикам, и их было легко
отличить от бесплазмидных клеток путем простого посева на питательную
среду с антибиотиками. Генетическая карта одного широко распространенного
вектора этой серии – pBR322 изображена на рис. II.5, а. Такая плазмида
представляет собой кольцевую ковалентно замкнутую молекулу ДНК длиной
4363 п.о. Последовательность нуклеотидов pBR322 полностью известна.
Плазмида содержит гены устойчивости к тетрациклину (Tc) и ампициллину (Ap),
которые были перенесены в плазмиду pBR322 из плазмиды pSC101 и
транспозона Tn3 соответственно. Оба этих гена являются селектируемыми
генетическими маркерами плазмиды, т.е. позволяют проводить отбор
бактериальных клеток с плазмидой pBR322 по их способности к росту на
питательных средах в присутствии тетрациклина и(или) ампициллина.
Плазмида pBR322 содержит также обеспечивающий ее стабильную
репликацию в клетках E. coli участок ДНК, который включает область начала
репликации (ori). Характерной чертой плазмиды pBR322, как и любого
современного вектора, является наличие в ней нескольких уникальных сайтов
рестрикции, обозначенных на генетической карте. Следует иметь в виду, что
встраивание в плазмиду клонируемых чужеродных фрагментов ДНК по сайтам
рестрикции, расположенным в генах Ар или Tc (например Pst I или BamH I),
будет нарушать целостность этих генов и их функциональную активность. В
результате происходит утрата бактериальными клетками, содержащими
рекомбинантные плазмиды, устойчивости к соответствующим антибиотикам. По
такому признаку легко различить бактериальные клетки, не содержащие
плазмиды (не растут в присутствии ампициллина и тетрациклина), клетки с
плазмидой, не содержащей вставки клонируемой ДНК (растут в присутствии
обоих антибиотиков), и клетки с рекомбинантными плазмидами (в зависимости
от локализации вставки могут расти на среде только с одним из двух
вышеупомянутых антибиотиков). Следовательно, наличие в векторных
молекулах селектируемых маркеров резко повышает эффективность
клонирования из-за возможности проведения быстрого отбора рекомбинантных
плазмид на селективных питательных средах.
Помимо генов устойчивости к антибиотикам в качестве селектируемых
маркеров используют и другие гены или их фрагменты. В частности, для этих
целей часто применяются гены различных ферментов, присутствие которых в
клетках в составе плазмиды обнаруживают по появлению соответствующей
ферментативной активности. В часто используемых векторах серии pUC таким
селектируемым маркером является 5’-концевая часть гена β-галактозидазы
E. coli – lacZ’ (см. рис. II.5, б). Эта часть гена, находящаяся под контролем lac-
промотора, кодирует N-концевую часть β-галактозидазы (так называемый α-
пептид), которая путем объединения с недостающей С-концевой частью
полипептида без образования пептидной связи восстанавливает
ферментативную активность β-галактозидазы. β-Галактозидаза обладает
способностью расщеплять искусственный субстрат Xgal (5-бром-4-хлор-3-
индолил-β- D -галактопиранозид) с образованием окрашенного в голубой цвет
продукта реакции. В том случае, когда в бактериальных клетках, которые
содержат в хромосоме недостающую экспрессирующуюся 3’-концевую часть
гена lacZ и выращиваются на среде с Xgal, в результате комплементации α-
пептидом вектора появляется активность β-галактозидазы, образованные этими
клетками бактериальные колонии окрашиваются в голубой цвет. Уникальные
сайты рестрикции для клонирования ДНК локализованы в начале гена β-
галактозидазы в составе полилинкера (синтетической последовательности
нуклеотидов, содержащей несколько перекрывающихся уникальных сайтов
рестрикции), который не нарушает функциональной целостности
последовательности нуклеотидов α-пептида. Вставка рекомбинантной ДНК в
эти векторы разрывает структурную часть гена β-галактозидазы и инактивирует
его, в связи с чем колонии бактерий с подобными рекомбинантными
Дата добавления: 2015-08-29; просмотров: 18 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |