мочевина, гуанидинхлорид и детергенты. Солюбилизированный в этих жестких
условиях рекомбинантный белок для восстановления нативной конформации
требует ренатурации, в процессе обработки денатурирующими агентами белки
могут изменять свою структуру, а при концентрировании из разбавленных
растворов, в которых проводится ренатурация, часто вновь выпадают в осадок.
В чем же причина такого аномального поведения рекомбинантных
эукариотических белков в бактериальных клетках? Для поддержания белков в
растворимом состоянии в клетках эукариот реализуются три основных
механизма: компартментализация продуктов трансляции, белок-белковые
взаимодействия и посттрансляционные модификации. Образующиеся в
результате трансляции мРНК рибосомами в эндоплазматическом ретикулуме
полипептидные цепи не распределяются хаотически в цитоплазме
эукариотических клеток, но последовательно переходят через ряд
компартментов, где претерпевают посттрансляционные модификации. При
этом внутренние условия отдельных компартментов могут существенно
различаться. Так, молекулы инсулина накапливаются in vivo в секреторных
гранулах, pH в которых составляет 4,5–5,5. В то же время pH цитоплазмы
бактериальных клеток приближается к 7,8, в этих условиях инсулин лишь слабо
растворим. Многие гидрофобные эукариотические белки не существуют в
растворимой форме в отсутствие фосфолипидов мембран. Белки молока
являются интегральной частью мицелл, стабилизированных ионами Ca2+.
Посттрансляционные модификации белков, в частности
фосфорилирование, гидроксилирование, гликозилирование и ограниченный
протеолиз, происходящие в определенных компартментах эукариотических
клеток, также оказывают большое влияние на растворимость белков, их
стабильность и биологические функции. Это особенно относится к
секретируемым белкам эукариот. Поскольку в бактериальных клетках
соответствующие системы посттрансляционных модификаций белков
отсутствуют, в них не могут быть получены биологически полноценные
рекомбинантные эукариотические полипептиды, что накладывает ограничения
на использование бактерий в биотехнологии.
Наконец, третьим ключевым фактором, оказывающим влияние на
растворимость белков, является их нативная конформация в растворе.
Правильное сворачивание (фолдинг) полипептидных цепей некоторых белков в
клетках эукариот обеспечивается специфическими белками, называемыми
шаперонами, которые необходимы для эффективного формирования
третичной структуры полипептидных цепей других белков, но не входят в
состав конечной белковой структуры. Шапероны оказывают влияние лишь на
конформацию полипептидных цепей и не действуют на ковалентные связи
белковых молекул. К этому классу полипептидов относятся цитозольные белки
теплового шока Hsp70 и Hsp60, а также гомологичные им белки, например
белок, связывающийся с тяжелой цепью иммуноглобулинов (BiP). Шапероном
является также ядерный нуклеоплазмин, обеспечивающий сборку нуклеосом. У
E. coli соответствующие функции выполняют белки SecB, триггерный фактор, а
также GroEL и GroES, обеспечивающие экспорт полипептидов из цитоплазмы и
участвующие в морфогенезе бактериофагов. Два последних белка – GroEL и
GroES, известные также как Cpn60 и Cpn10, кодируются генами оперона groE,
регулируемого тепловым шоком. Белки, эволюционно родственные белку
GroEL, получили название шаперонинов. Один из таких белков, обнаруженный
в хлоропластах высших растений, участвует в сборке D -рибулозо-1,5-
дифосфаткарбоксилазы-оксигеназы (Rubisco), которую часто используют в
качестве модельного белка в исследованиях механизмов сворачивания
полипептидных цепей.
Из других белков, участвующих в сворачивании полипептидных цепей,
следует упомянуть так называемые фолдазы и изомеразы. Наиболее хорошо
изученными ферментами этой группы являются тиоредоксин и глутаредоксин,
которые наряду с глутатионзависимым превращением рибонуклеотидов в
дезоксирибонуклеотиды способны восстанавливать дисульфидные связи в
белках, способствуя формированию у них правильной третичной структуры. Те
же функции выполняет и дисульфидизомераза белков, осуществляя
образование дисульфидных связей в секретируемых белках после их переноса
через мембраны эукариотических клеток. Лимитирующей стадией в
образовании правильной третичной структуры полипептидных цепей является
цис-транс- изомеризация остатков пролина в полипептидных цепях. Этот
процесс в клетках эукариот осуществляется с участием пролил- цис-транс-
изомеразы. Поскольку все вышеперечисленные условия, необходимые для
поддержания эукариотических рекомбинантных белков в растворимой форме,
не могут быть реализованы в бактериальных клетках, в них происходит
агрегация рекомбинантных белков с образованием телец включения. В
настоящее время не существует универсального метода, который бы позволял
получать рекомбинантные эукариотические белки в бактериальных клетках в
нативном виде. В некоторых случаях уже понижение температуры
выращивания рекомбинантных бактерий до 30o приводит к образованию
полностью растворимых рекомбинантных белков. Это наблюдали в случае
рекомбинантного γ-интерферона, A-цепи рицина, щелочного фактора роста
фибробластов и в ряде других случаев.
Более универсальным подходом к получению рекомбинантных белков в
растворимой форме является обеспечение секретируемого характера их
экспрессии, т.е. секреции синтезирующихся рекомбинантных белков в
питательную среду. Системы секреции у грамположительных и
грамотрицательных бактерий интенсивно изучаются. Получение
рекомбинантных эукариотических белков в секретируемой форме
высокотехнологично, поскольку значительно облегчает их очистку. Кроме того,
у секретируемых белков больше шансов приобрести нативную конформацию,
так как сворачивание полипептидных цепей происходит в большом объеме, а
следовательно, и более низкой их концентрации, что предотвращает агрегацию
полипептидных цепей, не полностью сформировавших свою третичную
структуру. Примером эффективного использования секреторной системы E. coli
является получение рекомбинантного инсулино-подобного фактора роста I
(IGF-I) в секретируемой форме. В этой системе удавалось нарабатывать до 1 г
рекомбинантного белка в 1 л бактериальной культуры.
Еще одним возможным, хотя и более труднореализуемым подходом к
эффективному синтезу растворимых рекомбинантных белков в бактериальных
клетках является введение экспрессирующихся генов шаперонов в клетки
бактерий-хозяев. Так, сверхэкспрессия гомологичного gro -оперона в клетках
E. coli, содержащих экспрессирующиеся гены большой и малой субъединиц
Rubisco цианобактерии Anacistis nidulans, приводила к 5–10-кратному
возрастанию внутриклеточного содержания нативного рекомбинантного белка
Rubisco. В некоторых случаях внутриклеточную агрегацию
сверхэкспрессирующихся белков удается предотвратить искусственной
заменой отдельных аминокислот в полипептидных цепях методами белковой
инженерии. Например, удаление семи аминокислот перед спиралью G в N-
концевой части полипептидной цепи фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I
E. coli, а также замена нескольких гидрофобных аминокислот, боковые цепи
которых экспонированы на поверхности спирали G, на остатки аспарагина
полностью предотвращали внутриклеточную агрегацию фрагмента и
образование агрегатов в процессе его очистки. В нативной молекуле ДНК-
полимеразы I участок полипептидной цепи, в котором проведены замены,
закрыт доменом 5’→3’-экзонуклеазы, отсутствующим у фрагмента Кленова, и
не оказывает влияния на агрегационные свойства фермента.
Несмотря на определенные успехи в получении нативных
рекомбинантных эукариотических белков в бактериальных клетках, эти системы
экспрессии эукариотических генов в настоящее время еще далеки от
совершенства. По-прежнему остается открытым вопрос о посттрансляционных
модификациях рекомбинантных белков в бактериях, а для многих
рекомбинантных белков не решена даже проблема их внутриклеточной
растворимости. С этой точки зрения идеальными системами экспрессии
рекомбинантных эукариотических генов являются гомологичные генетические
системы, т.е. сами эукариотические клетки животных или растений (см. раздел
7.4). Действительно, такие системы экспрессии, хотя и более дорогие, с
успехом используются в биотехнологии. При этом одним из ключевых
факторов, обеспечивающих эффективное функционирование подобных систем,
могут быть эукариотические экспрессирующие векторы, основные особенности
которых будут рассмотрены в следующем разделе.
7.2.7. Векторы для переноса ДНК в клетки животных и растений
Все основные принципы, используемые при конструировании
бактериальных векторов, применимы и для получения векторов
эукариотических клеток. Как и в случае бактерий, эукариотический вектор
представляет собой небольшую молекулу ДНК, способную автономно
реплицироваться в клетках животных. Помимо последовательностей
нуклеотидов, обеспечивающих репликацию, эукариотические векторы могут
содержать гены, используемые в качестве селектируемых маркеров, а также
один или несколько уникальных сайтов рестрикции, по которым производится
встраивание клонируемых последовательностей нуклеотидов ДНК. Поскольку
непосредственное клонирование рекомбинантных ДНК в клетках животных
было бы дорогостоящей и малоэффективной процедурой, эукариотические
векторы используют, как правило, для получения экспрессии уже
клонированных последовательностей нуклеотидов в клетках животных и
растений, а сам процесс клонирования проводят в бактериях. Следовательно,
эукариотические векторы, помимо всего прочего, должны быть челночными
векторами. Для экспрессии в клетках рекомбинантные ДНК помещают под
контроль регуляторных элементов, узнаваемых и используемых
ферментативными системами эукариотических клеток.
В отличие от бактерий в клетках эукариот внехромосомные, автономно
реплицирующиеся генетические элементы типа бактериальных плазмид
встречаются редко. Поэтому при конструировании векторов, способных
реплицироваться и осуществлять экспрессию в клетках животных, чаще всего
используют регуляторные генетические элементы вирусов животных или, в
зависимости от задач, эукариотических генов домашнего хозяйства, а также
генов, для которых характерна тканеспецифическая экспрессия.
Экспрессирующий вектор pKSV-10. Структура теоретически
возможного эукариотического вектора для экспрессии клонированных генов в
клетках животных представлена на рис. II.12, из которого видно, что
эукариотический вектор сохраняет все основные генетические элементы
бактериальных векторов. Это, прежде всего, репликатор (область начала
репликации ori), распознаваемый репликативными системами эукариотической
клетки. В роли репликатора чаще всего используют соответствующие
последовательности нуклеотидов вирусов животных (например вируса SV40
или вируса Эпштейна–Барр). Особенностью функционирования такого
репликатора является потребность в вирусных белках для инициации
репликации. Так, в случае SV40 – это T-антиген, тогда как у вируса Эпштейна-
Барр – белок EBNA (Epstein-Barr nuclear antigen). Для того чтобы репликация
векторов, в которых использованы вирусные репликаторы, осуществлялась без
вируса-помощника, получили специальные линии клеток, которые стабильно
продуцируют соответствующие вирусные белки. Например, в клетках линии
COS синтезируется T-антиген вируса SV40, а клетки линии Hep-EBNA-2
экспрессируют ген EBNA.
Рис. II.12. Эукариотический вектор pKSV-10
Часть бактериальной плазмиды, содержащей область начала репликации
ori, соединена с транскрипционной единицей вируса SV40, 5’-концевая
часть которой включает ранние промотор и репликатор вируса SV40, а 3’-
конец содержит сайт полиаденилирования и интрон большого T-антигена.
Последовательности чужеродной ДНК, которые необходимо
экспрессировать в клетках животных, клонируют по Bgl II-сайту рестрикции.
Кроме того, в векторе имеются уникальные сайты для рестриктаз Kpn I,
BamH I, Sal I и EcoR I. Вектор может реплицироваться в клетках E. coli и в
клетках обезьян линии COS
В ряде случаев гены, необходимые __________для репликации эукариотического
вектора, вводят непосредственно в вектор. Так же как и бактериальный,
эукариотический вектор должен содержать один или несколько уникальных
сайтов рестрикции для клонирования требуемой последовательности
нуклеотидов. В экспрессирующем векторе полилинкер располагают
непосредственно за генетическими элементами, регулирующими транскрипцию
(наибольшее значение из них имеют промотор и энхансер), перед сайтом
полиаденилирования и терминатором транскрипции. Структура других кассет
генов, обеспечивающих экспрессию рекомбинантных генов в клетках животных,
будет рассмотрена в разделе 7.4.6.
Векторы растений. Специфика векторов для экспрессии
рекомбинантных генов в клетках растений обусловлена главным образом
регуляторными последовательностями нуклеотидов, которые обеспечивают
эффективную транскрипцию генов в растительных тканях. Например, в
известном векторе pCaMVCAT используются промотор и сайт
полиаденилирования генов вируса мозаики цветной капусты, под контролем
которых находится ген бактериальной хлорамфениколацетилтрансферазы
(cat). Этот ген-репортер применяется для оптимизации условий введения
векторной ДНК в клетки растений и может быть заменен на любой другой ген.
Вектор pCaMVCAT является челночным, т.е. может реплицироваться как в
клетках E. coli, так и растений. В первом случае селектируемым маркером
служит, как обычно, ген устойчивости к ампициллину.
Вектор pCaMVCAT принадлежит к большой группе так называемых
DMGT-векторов (DNA-mediated gene transfer), осуществляющих
опосредованный ДНК перенос генов в клетки растений. Это означает, что в
данном случае перенос генов в клетки растений опосредован ДНК вектора, так
как они находятся в составе векторной молекулы. Для получения стабильных
линий растительных клеток, которые бы содержали рекомбинантные ДНК в
интегрированном в хромосомы состоянии и активно экспрессировали его, часто
в состав DMGT-векторов вводят дополнительные селектируемые маркеры,
которые придают клеткам, включившим экзогенную ДНК, определенный, легко
обнаруживаемый фенотип. Такими маркерами могут быть, например гены
неомицинфосфотрансферазы II (NPT II), гигромицинфосфотрансферазы (HPT),
дигидрофолатредуктазы, в результате экспрессии которых клетки приобретают
устойчивость к канамицину, гигромицину B или метотрексату соответственно.
7.3. Клонотеки генов
Любой индивидуальный ген занимает лишь небольшую часть генома
живого организма. В то же время размер генома даже наиболее просто
организованных бактерий в среднем составляет 2•106 п.о., а суммарный размер
молекул ДНК, составляющих гаплоидный геном человека, по крайней мере, на
три порядка больше. Из этого следует, что уникальные гены, представленные в
гаплоидном геноме только одной копией, затеряны среди других
последовательностей генома, и для работы с индивидуальными
рекомбинантными ДНК требуется очистка от ненужного генетического
материала. Такая задача в генной инженерии решается через создание
репрезентативных (представительных) клонотек последовательностей
нуклеотидов ДНК или, иначе говоря, клонотек генов.
7.3.1. Получение клонотек генов
Клонотека генов представляет собой набор разных последовательностей
нуклеотидов ДНК, клонированных в составе векторных молекул, которые в
сумме составляют весь геном исследуемого организма или какую-либо
известную его часть. При этом репрезентативная клонотека должна заключать
в себе с высокой долей вероятности любую последовательность нуклеотидов
изучаемого генома. Как уже подробно обсуждалось выше, для большинства
генов эукариот характерна интрон-экзонная структура, а интроны,
присутствующие в первичных транскриптах таких генов, вырезаются в процессе
сплайсинга с образованием зрелых молекул мРНК. Для получения экспрессии
эукариотических генов в клетках прокариот, а также изучения
тканеспецифической экспрессии генов возникает необходимость в получении
кодирующих последовательностей эукариотических генов без интронов. В этом
случае задача решается через создание репрезентативных клонотек кДНК, в
которых с высокой вероятностью представлены последовательности
нуклеотидов мРНК, синтезирующихся в тканях, культурах тканей или отдельных
соматических клетках.
На рис. II.8 представлена схема конструирования клонотеки геномной
ДНК с использованием космидного вектора. Следует иметь в виду, что общие
принципы получения клонотек генов приложимы и к любым другим векторам.
На первом этапе конструирования осуществляют подготовку вектора и
клонируемой ДНК. Космидный вектор расщепляют рестриктазами BamH I и
Sma I, причем рестриктаза Sma I расщепляет ДНК с образованием "тупых"
концов. В результате образуются два "плеча" космидного вектора, содержащих
область начала репликации ori, используемую системой репликации
бактериальных клеток, и два селектируемых маркера, которые представляют
собой гены устойчивости к антибиотикам – ампициллину (Ampr) и канамицину
(Kanr), а также два cos -сайта хромосомы бактериофага λ. Параллельно со
всеми необходимыми предосторожностями получают препараты
высокомолекулярной ДНК, которую необходимо клонировать.
Геномную ДНК подвергают частичному гидролизу мелкощепящей
рестриктазой Mbo I (узнает последовательность из четырех нуклеотидов GATC,
которые комплементарны "липким" концам, образуемым рестриктазой BamH I).
Время рестрикции и концентрацию фермента подбирают таким образом, чтобы
средняя длина образующихся фрагментов ДНК составляла 35–45 т.п.о.
Обогащенную фракцию фрагментов ДНК подобного размера далее получают
центрифугированием смеси рестрикционных фрагментов в градиенте
концентрации сахарозы и лигируют с приготовленными "плечами" вектора в
условиях, при которых образование сшивок по "тупым" концам минимально.
При этом, помимо требуемых молекул рекомбинантных ДНК, могут
образовываться и артефактные молекулы, которые не будут упаковываться в
фаговые частицы либо из-за их неоптимального размера, либо вследствие
неправильной ориентации cos -сайтов.
Полученную после лигирования сложную смесь молекул рекомбинантных
ДНК упаковывают в фаговые частицы стандартным способом, и
образовавшимися фаговыми частицами заражают подходящие бактериальные
клетки. В итоге колонии бактериальных клеток, которые выросли в присутствии
антибиотиков, должны заключать в себе различные последовательности
нуклеотидов клонируемой ДНК приблизительно одинаковой длины.
На этом частном примере был рассмотрен один из подходов к
конструированию клонотеки геномной ДНК с использованием космидного
вектора, который иллюстрирует все основные этапы получения клонотек генов
с применением и других векторов, плазмидных или фаговых. Во всех случаях
для получения репрезентативных клонотек генов следует помнить о
необходимости случайной фрагментации клонируемой высокомолекулярной
ДНК, с тем чтобы все участки генома в образующейся смеси фрагментов были
представлены равновероятно. Кроме того, размеры образуемых фрагментов
ДНК должны соответствовать емкости вектора, используемого для их
клонирования. Так, для клонирования в космидах необходимо получать
фрагменты ДНК длиной 35–45 т.п.о., тогда как для клонирования в фаговых
векторах типа Charon и плазмидах эти размеры должны составлять
соответственно 20–24 и 1,5–3,0 т.п.о.
Чем короче фрагменты, используемые для получения библиотек генов, и
чем сложнее исследуемый геном, тем большее число клонов необходимо
получить, чтобы клонотека была полной. Например, для того чтобы создать
геномную клонотеку бактерий из фрагментов ДНК длиной в 20 т.п.о., в которой
любая последовательность была бы представлена с вероятностью 99%, в ней
необходимо иметь 460 клонов, тогда как для млекопитающих это число
возрастает до 600000, а для покрытосеменных растений оно еще в ~10 раз
больше. Отсюда следует, что в случае получения репрезентативных клонотек
генов бактерий для решения такой задачи вполне достаточно плазмидных
векторов, несмотря на их небольшую емкость. В то же время использование
плазмид для создания полных клонотек генов млекопитающих или растений
совершенно бесперспективно, так как потребовало бы поддержания в
клонотеке огромного количества клонов, многие из которых с большой
вероятностью могут быть утрачены.
Выше были обсуждены условия, которые необходимо соблюдать для
получения репрезентативных клонотек геномной ДНК. Однако во многих
случаях не возникает необходимости работать с полными клонотеками генов, и
исследователи ограничиваются неполными клонотеками, обогащенными
отдельными участками генома. Так, клонотеки кДНК заключают в себе
последовательности нуклеотидов, которые в виде зрелых мРНК специфически
экспрессируются в различных клетках или тканях. То же можно сказать и о
клонотеках повторяющихся последовательностей нуклеотидов, отобранных из
препарата суммарной ДНК на основании кинетики их реассоциации.
7.3.2. Введение рекомбинантных ДНК в клетки
После завершения лигирования векторных молекул с клонируемыми
фрагментами ДНК реакционную смесь с продуктами реакции уже можно
рассматривать как библиотеку генов. Полученные таким образом
рекомбинантные молекулы ДНК хранятся длительное время в замороженном
состоянии, и по мере необходимости из них отбирают аликвоты реакционной
смеси, содержащие требуемое количество рекомбинантных молекул, и вводят в
клетки микроорганизмов для клонирования и дальнейшей работы.
Процесс поглощения экзогенной ДНК бактериальными клетками,
сопровождающийся приобретением ими новых генетических маркеров,
называют генетической трансформацией. В том случае, если бактериальные
клетки поглощают ДНК бактериофагов и в результате происходит образование
зрелых фаговых частиц, говорят о трансфекции фаговой ДНК. Поглощение
экзогенной ДНК в процессе трансформации и трансфекции может
осуществляться лишь компетентными клетками. Под компетентностью
понимается такое состояние бактериальных клеток, при котором они способны
сорбировать экзогенную ДНК на своей поверхности и поглощать ее, после чего
экзогенная ДНК может быть интегрирована в бактериальную хромосому или
существовать в виде внехромосомного элемента (эписомы, плазмиды).
Для многих грамположительных бактерий компетентность является
естественным свойством, которое становится максимально выраженным на
определенных этапах роста культуры. В то же время у наиболее важных для
генной инженерии грамотрицательных клеток E. coli естественная
компетентность вообще отсутствует и клетки приобретают ее лишь в
искусственных условиях. В настоящее время установлено, что при низких
температурах и в присутствии двухвалентных катионов клетки E. coli и
экзогенная ДНК продуктивно взаимодействуют друг с другом и экзогенная ДНК
может с высокой эффективностью проникать внутрь бактериальных клеток.
Частоту трансформации и трансфекции клеток E. coli можно повысить разными
способами. Среди них наиболее популярными являются тепловой шок,
введение в инкубационную смесь одновалентных катионов (Rb+), хлорида
гексаминкобальта(III) или выращивание бактериальных клеток на среде с
повышенным содержанием ионов Mg2+ (10–20 мМ).
Современные методики трансформации бактериальных клеток
позволяют получать до 107–108 трансформантов или трансфектантов на 1 мкг
суперскрученной плазмидной ДНК. Поскольку трансформация и трансфекция
проводятся при низких концентрациях экзогенной ДНК, а для появления у
трансформированной бактерии устойчивости к антибиотикам или развития
фаговой бляшки достаточно проникновения внутрь бактериальной клетки одной
молекулы рекомбинантной ДНК, образовавшиеся колонии или бляшки
трансформантов и трансфектантов содержат, как правило, только один тип
рекомбинантных молекул ДНК с идентичными вставками клонируемых
последовательностей нуклеотидов.
Еще более высокой эффективности трансформации (до 109–1010
трансформантов на 1 мкг ДНК) достигают при использовании электропорации.
В этом случае клетки вместе с плазмидной или фаговой ДНК помещают в
небольшую ячейку между двумя электродами и подвергают кратковременному
(10–100 мкс) воздействию электрического поля высокой напряженности.
Быстрая поляризация клеточных мембран приводит к их обратимому
повреждению (образованию пор), сопровождаемому повышением их
проводимости и проницаемости для макромолекул. В это время происходит
эффективный перенос экзогенных молекул ДНК внутрь клеток, подвергнутых
электрическому шоку. После того как рекомбинантные молекулы ДНК введены
в бактериальные клетки и получены бактериальные колонии или фаговые
бляшки, каждая из которых содержит рекомбинантные ДНК только одного типа,
возникает важная задача отбора тех колоний или бляшек, которые заключают в
себе искомые последовательности нуклеотидов рекомбинантных ДНК.
7.3.3. Методы скрининга клонотек генов
Все методы получения из клонотек генов требуемых
последовательностей нуклеотидов можно разделить на две группы. При
использовании первой группы методов рекомбинантные бактерии или фаговые
частицы исследуют на наличие в них искомых последовательностей
нуклеотидов. Во втором случае присутствие этих последовательностей
обнаруживают косвенно, по появлению в бактериальных клетках или фаговых
лизатах продуктов экспрессии искомых генов – РНК, белков или
ферментативной активности.
Для выявления конкретных последовательностей нуклеотидов в
клонотеках генов рекомбинантные бактерии или фаги рассевают на чашках
Петри и образовавшиеся колонии или бляшки переносят на нитроцеллюлозные
или нейлоновые фильтры. Для этого стерильные фильтры накладывают на
поверхность чашек, в результате чего часть бактериальных клеток или фаговых
частиц прочно связывается с поверхностью фильтров. Расположение их на
фильтрах и поверхности чашек Петри точно совпадает. Бактериальные клетки
или фаговые частицы, сорбированные на фильтрах, лизируют щелочью, что
сопровождается одновременной денатурацией заключенной в них ДНК.
Освободившуюся ДНК фиксируют на фильтрах и гибридизуют с меченым
олигонуклеотидным зондом, последовательность нуклеотидов которого точно
соответствует последовательности нуклеотидов искомой ДНК. В результате
гибридизации происходит специфическое прочное связывание зонда с
идентичными и/или гомологичными последовательностями нуклеотидов в ДНК,
содержащейся в отдельных бактериальных колониях или бляшках.
После отмывки фильтров от несвязавшегося радиоактивного зонда их
высушивают и прикладывают к рентгеновской пленке. Образование
специфических гибридов обнаруживают после проявления рентгеновской
пленки по появлению на ней четких гибридизационных сигналов в виде темных
пятен, положение которых точно соответствует таковому определенных
колоний или бляшек на исходной чашке Петри. В результате проведения такого
исследования точно идентифицируются бактериальные колонии или фаговые
бляшки, содержащие искомые рекомбинантные ДНК. С этого момента с
помощью обычных микробиологических и биохимических методов можно
получать неограниченное количество идентичных копий клонированной
Дата добавления: 2015-08-29; просмотров: 19 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |