бесклеточных системах. Однако под контролем гомологичных регуляторных
элементов в бесклеточных системах могут быть успешно транслированы и
чужеродные мРНК – транскрипты рекомбинантных генов.
В некоторых бесклеточных системах транслируют предварительно
очищенную мРНК или используют эндогенную мРНК, присутствующую в
полисомах. В других белоксинтезирующих системах – системах сопряженной
транскрипции и трансляции, одновременно происходят синтез мРНК и ее
трансляция рибосомами.
Из-за высокой стоимости очищенных компонентов в подавляющем
большинстве случаев бесклеточные системы биосинтеза белка используют в
аналитическом варианте, когда объем пробы не превышает 100 мкл. Однако в
последнее время разработаны проточные белоксинтезирующие системы, в
которых процесс трансляции удается поддерживать длительное время,
непрерывно подводя извне расходуемые вещества, с одновременным
удалением синтезируемых белков и продуктов деградации компонентов
системы. Основные принципы получения и функционирования всех
разновидностей белоксинтезирующих систем будут рассмотрены ниже.
7.5.1. Прокариотические системы
Среди прокариотических бесклеточных белоксинтезирующих систем
наибольшее распространение получили системы на основе экстрактов клеток
E. coli, хотя основные принципы, используемые для их получения, могут быть
применены и для других бактериальных клеток. Прокариотическая, как и любая
другая бесклеточная система биосинтеза белка, должна содержать несколько
обязательных компонентов: 1) рибосомы и белковые факторы трансляции; 2)
матричный полирибонуклеотид (мРНК или синтетические полинуклеотиды); 3)
аминоацилированные тРНК; 4) GTP в качестве источника энергии; 5)
одновалентные (К+ или NH4
+) и двухвалентные (Mg2+ или Са2+) катионы, а также
буферные вещества для поддержания рН системы в физиологических
пределах.
Одним из наиболее важных условий функционирования бесклеточных
систем биосинтеза белка является нативное состояние рибосом и факторов
трансляции. В качестве источников этих компонентов в бактериальных
бесклеточных системах чаще всего используют экстракты соответствующих
клеток. Бактериальные клетки выращивают на богатой питательной среде,
суспендируют в буфере и разрушают тем или иным способом. Лизат
центрифугируют при 30 000 g. При этом в супернатанте (так называемом SЗО-
экстракте) остаются рибосомы и остальные белковые факторы трансляции,
необходимые для функционирования системы. Кроме того, в нем содержатся
бактериальные ДНК и мРНК, которые, если от них не освободиться, приводят к
неспецифическому синтезу белка в бесклеточной системе.
В том случае, если разрушение бактериальных клеток проводят
жесткими методами с применением ультразвука, растирания со стеклянными
бусами и т.п., освобождение от эндогенных нуклеиновых кислот становится
сложной задачей и требует фракционирования экстрактов с помощью
ионообменной хроматографии. При такой хроматографической очистке
фракции S1OO из нее удаляются все аминоацилированные и свободные
молекулы тРНК. Поэтому при реконструировании бесклеточной
белоксинтезирующей системы к объединенным фракциям рибосом и S1OO616
экстракта добавляют препарат очищенной суммарной тРНК.
Экстракты бактериальных клеток S30 и S1OO, кроме всех необходимых
факторов трансляции, содержат и основные компоненты системы
транскрипции, включая РНК-полимеразу, фактор терминации транскрипции ρ,
CRP-белок и т.п. Поэтому для создания ДНК-зависимой системы сопряженной
транскрипции и трансляции, в которой происходит полная экспрессия генов,
находящихся под контролем бактериальных регуляторных элементов, как
правило, не требуется введения в нее дополнительных белков. Достаточно
внесения в систему экзогенной ДНК-матрицы, транскрибируемой
бактериальной РНК-полимеразой, а также четырех
рибонуклеозидтрифосфатов, чтобы в ней начала активно синтезироваться
мРНК и одновременно транслироваться рибосомами. В итоге в таких
бесклеточных системах в ряде случаев удается синтезировать
высокомолекулярные белки, обладающие ферментативной активностью.
Экстракты бактериальных клеток содержат многочисленные нуклеазы и
протеолитические ферменты, которые понижают эффективность синтеза
белков in vitro, разрушая мРНК и образуемые полипептиды. Для преодоления
этих затруднений в бесклеточных системах часто используют экстракты
мутантных бактериальных клеток, дефектных по РНКазам и
полинуклеотидфосфорилазе, а в сами бесклеточные системы при
необходимости вводят ингибитор РНКазы из плаценты человека или
ингибиторы протеиназ: лейпептин, пепстатин, химостатин и т.п.
Не существует больших ограничений на первичную структуру мРНК,
транслируемых в бактериальных бесклеточных системах. Единственным
необходимым условием их эффективной трансляции является отсутствие
совершенной вторичной структуры или каких-либо особо прочных
кооперативных спиральных участков. Вторичную структуру транслируемых
мРНК обычно разрушают кратковременным прогреванием с последующим
быстрым охлаждением непосредственно перед внесением ее в пробы.
GTP относится к обязательным компонентам бесклеточной
белоксинтезирующей системы. Он не может быть заменен на любой другой из
известных рибонуклеозидтрифосфатов и необходим для мРНК-зависимого
связывания аминоацил-тРНК с рибосомами и транслокации. Поскольку при
трансляции происходит непрерывное расходование GTP, а образующийся при
этом GDP является ингибитором трансляции, в процессе функционирования
бесклеточной системы осуществляют постоянную регенерацию GTP. Для этого
применяют АТР в качестве донора фосфатных групп, которая, в свою очередь,
регенерируется путем переноса фосфатной группы вводимого в бесклеточную
систему фосфоэнолпирувата с помощью пируватфосфокиназы. Энергия
макроэргических связей АТР используется также при аминоацилировании тРНК
аминоацил-тРНК-синтетазами. В том случае, если создается бесклеточная
система сопряженной транскрипции и трансляции, для осуществления синтеза
РНК в нее вводятся еще два недостающих рибонуклеозидтрифосфата: UTP и
СТР.
Для функционирования бесклеточных белоксинтезирующих систем
необходимо обеспечивать в них определенные ионные условия. Наиболее
существенным фактором в этом случае является концентрация ионов Mg2+.
Достаточно изменения оптимальной концентрации Mg2+ в системе на 1–2 мМ,
чтобы в ней перестали синтезироваться полипептиды, обладающие
ферментативной активностью. При этом влияние ионов Mg2+ на суммарное
включение аминокислот в синтезируемые полипептидные цепи проявляется в
меньшей степени, что, по-видимому, объясняется нарушением точности
включения аминокислот в белки при неоптимальных концентрациях ионов Mg2+.
В системах in vitro ионы Mg2+ могут быть заменены на ионы Са2+ и даже Мn2+, а
также частично замещены полиаминами: спермидином или спермином, которые
благоприятно влияют на трансляцию и образование нативных белков.
Биосинтез белка в бесклеточных системах происходит также в
присутствии ионов K+ или NH4
+, оптимальные концентрации которых
составляют ∼100 мМ. Ионы Na+ ингибируют трансляцию, а ацетат-анионы в
используемых солях предпочтительнее анионов Сl-. Ионы Mg2+, К+ и NH4
+
необходимы для ассоциации субчастиц рибосом и поддержания их в
компактной форме, а также обеспечения других их функций.
Несмотря на то что в бесклеточной трансляции чаще всего находят
применение системы с использованием SЗО- и S1OO-экстрактов с
добавленными рибосомами, современный уровень знаний молекулярных
механизмов трансляции позволяет получать бесклеточные
белоксинтезирующие системы из полностью очищенных компонентов. Однако
создание таких систем является трудоемким процессом, поэтому их применяют
только в аналитическом варианте для решения специальных задач.
7.5.2. Эукариотические системы
Несмотря на относительную простоту получения бактериальных
белоксинтезирующих систем, их использование ограничивается трансляцией
бактериальных и фаговых мРНК или рекомбинантных последовательностей
нуклеотидов, находящихся под контролем генетических регуляторных
элементов бактерий или бактериофагов. В этой связи возникла необходимость
в разработке бесклеточных систем биосинтеза белка, пригодных для
непосредственной трансляции мРНК высших организмов.
В настоящее время наиболее часто применяемыми системами такого
рода являются белоксинтезирующие системы из ретикулоцитов кроликов,
зародышей пшеницы и культивируемых соматических клеток различного
происхождения. При этом системы всех трех типов могут быть использованы
почти с одинаковым успехом для трансляции разнообразных мРНК и, как
правило, такие системы не обнаруживают видоспецифичности. Основные
принципы конструирования прокариотических белоксинтезирующих систем
применяют и для получения систем биосинтеза белков высших организмов.
Специфика последних связана, прежде всего, с биологическими особенностями
объектов, которые служат источником белковых компонентов систем, а также с
различиями механизмов биосинтеза белка у прокариот и эукариот.
Ретикулоциты – безъядерные предшественники эритроцитов человека и
животных, осуществляют активный синтез гемоглобина и в связи с этим
обладают всеми необходимыми компонентами белкового синтеза. В то же
время отсутствие ядер в таких клетках дает возможность получать
бесклеточные экстракты, минимально загрязненные геномной ДНК. Эти
особенности ретикулоцитов животных делают их излюбленным источником
бесклеточных экстрактов, способных осуществлять эффективную трансляцию
разнообразных экзогенных мРНК.
Все основные компоненты, необходимые для функционирования
бактериальных бесклеточных систем биосинтеза белка, должны присутствовать
и в бесклеточной белоксинтезирующей системе из ретикулоцитов кроликов.
Однако необходимо отметить две существенные особенности такой системы.
Во-первых, для регенерации АТР в качестве доноров фосфатных групп
используют креатинфосфат – универсальный аккумулятор энергии в
макроэргических связях у большинства позвоночных, а сам перенос групп
осуществляется вводимой в систему креатинфосфокиназой. Во-вторых, для
предотвращения ингибирования трансляции в процессе синтеза белка в
систему вводят гемин (механизм его стимулирующего действия обсуждался в
первой части книги).
Функционирование системы из зародышей пшеницы и ее состав
существенно не отличаются от таковых ретикулоцитарной системы биосинтеза
белка. Различия заключаются главным образом в методах получения
бесклеточных экстрактов. Зародыши обычно выделяют из сухих зерен озимой
пшеницы. Преимуществами этих бесклеточных белоксинтезирующих систем
перед другими являются возможность длительного хранения и доступность
исходного биологического материала (зерен сортовой пшеницы), что
обеспечивает воспроизводимость получаемых результатов и не требует
проведения экспериментов с лабораторными животными.
Несмотря на то что разные эукариотические бесклеточные
белоксинтезирующие системы активно транслируют гетерологичные мРНК,
гомологичные матрицы, как правило, транслируются более эффективно.
Например, глобиновые мРНК используются в синтезе белка в 7–8 раз лучше
лизатами ретикулоцитов, чем экстрактами культивируемых клеток яичников
китайских хомячков. Кроме того, в клетках разных типов дифференцированных
тканей могут присутствовать специфические белковые ингибиторы трансляции
определенных мРНК. Факты такого рода необходимо учитывать при выборе
бесклеточной системы для решения конкретных экспериментальных задач.
7.5.3. Проточные системы
Бесклеточные системы биосинтеза белка позволили генной инженерии
получать экспрессию изолированных генов, не прибегая к помощи живых
клеток. До недавнего времени все обсуждавшиеся выше бесклеточные системы
существовали только в аналитическом варианте и были функционально
активны на протяжении короткого времени (40–60 мин). Для всех описанных
выше систем характерен малый выход синтезируемого белка (не более 1 мкг на
1 мл экстракта), и на 1 молекулу мРНК в них синтезируется лишь одна–две
молекулы полипептида.
Значительный прогресс в этой области исследований был достигнут в
лаборатории А.С. Спирина в 1988 г. Здесь с помощью простых
усовершенствований удалось получить эффективную бесклеточную
белоксинтезирующую систему. В их модификации бесклеточные экстракты
бактериальных или эукариотических клеток помещают в ячейку, закрытую с
двух сторон полупроницаемыми мембранами. Размер пор позволяет проходить
через мембраны вместе с током жидкости низкомолекулярным химическим
веществам и небольшим белкам. Содержимое ячейки, в которой имеются все
компоненты, необходимые для бесклеточной трансляции, инкубируют при
обычной температуре. При этом с одной стороны в такую ячейку-реактор со
скоростью ~1 мл/ч непрерывно поступают ингредиенты, расходуемые в
процессе биосинтеза белка (аминокислоты, АТР, GTP), а с другой – из нее
выходят синтезированные белковые продукты (если их молекулярная масса и
отсутствие способности к агрегации позволяют пройти через поры мембраны).
Такое простое усовершенствование бесклеточной системы сильно
изменило характер ее функционирования. Биосинтез белка в ней может
продолжаться непрерывно в течение нескольких десятков часов, причем на
одну молекулу транслируемой мРНК синтезируются сотни копий
полипептидных цепей белков, суммарный выход которых может достигать 200
мкг и более на 1 мл бесклеточного экстракта.
С разработкой проточной бесклеточной белоксинтезирующей системы
стало возможным проводить биосинтез рекомбинантных белков в
препаративных количествах in vitro. Такая система позволяет синтезировать в
больших количествах полипептиды, подверженные быстрой внутриклеточной
деградации протеиназами или образующие тельца включения в живых клетках.
Проточная система может быть полезна также для получения белков,
обладающих цитотоксической активностью, или других рекомбинантных
полипептидов, для которых нежелательны артефактные посттрансляционные
модификации, происходящие in vivo. Недавно в таких системах удалось
получить препаративные количества функционально активного интерлейкина 6
человека.
7.6. Другие современные методы исследования генов
Основным методическим достижением генной инженерии в
исследовании генов является разработка способов выделения индивидуальных
генов и экспрессии их в новом генетическом окружении в гомологичных и
гетерологичных генетических системах. Именно эти аспекты генной инженерии
были подробно рассмотрены в предыдущих разделах. Однако для изучения
тонкой структуры уже клонированных генов, их картирования на хромосомах и
исследования механизмов регуляции экспрессии были разработаны другие не
менее эффективные методы.
7.6.1. Рестрикционное картирование генов
Полную, но, к сожалению, пока трудно интерпретируемую информацию о
строении гена может дать только определение его первичной структуры, т.е.
последовательности составляющих ген нуклеотидов. На практике при
исследовании протяженных (до 40 т.п.о.) клонированных последовательностей
нуклеотидов, включающих исследуемые гены, прежде всего строят их
рестрикционные карты. Рестрикционные карты представляют собой схемы,
изображающие взаимное расположение сайтов рестрикции для разных
рестриктаз и расстояния между ними. Поскольку каждый сайт рестрикции
является не чем иным, как строго определенной последовательностью
нуклеотидов ДНК, рестрикционные карты наглядно заключают в себе
информацию об особенностях первичной структуры картируемых участков
генома.
Для построения рестрикционной карты используют гибридизацию по
методу Е. Саузерна. Клонированный фрагмент ДНК отдельно или в составе
вектора получают в препаративном количестве, затем его обрабатывают
соответствующими рестриктазами и продукты рестрикции разделяют
электрофорезом в агарозном геле. Количество образовавшихся
рестрикционных фрагментов ДНК, обнаруживаемых после окрашивания
бромистым этидием в виде флуоресцирующих полос в ультрафиолетовом
свете, соответствует количеству сайтов рестрикции в том случае, если
различия в размерах образовавшихся фрагментов ДНК достаточны для их
разделения при электрофорезе.
Размеры рестрикционных фрагментов оценивают путем сравнения их
электрофоретической подвижности с таковой фрагментов ДНК известных
размеров. Получив информацию о количестве сайтов рестрикции в гене, далее
определяют их взаимное расположение. Для этого в качестве зондов выбирают
короткие фрагменты ДНК и после введения в них радиоактивной метки их
гибридизуют с рестрикционными фрагментами ДНК, которые после
электрофоретического разделения в агарозном геле были перенесены на
нитроцеллюлозные или нейлоновые фильтры. По завершении гибридизации
положение фрагментов ДНК, связавших метку, на фильтрах обнаруживают с
помощью авторадиографии. Получение такой информации о принадлежности
конкретных фрагментов ДНК, образовавшихся под действием различных
рестриктаз, к 5’- или 3’-концевым частям исследуемой последовательности
нуклеотидов обычно бывает достаточным для определения взаимного
расположения различных сайтов рестрикции на рестрикционных картах.
7.6.2. "Прогулки и прыжки по хромосомам"
Многие гены в геноме эукариот располагаются в виде кластеров, члены
которых функционально или эволюционно связаны друг с другом. В связи с
этим в молекулярной генетике часто возникает задача клонирования генов,
расположенных по соседству с уже выделенными генами. Для ее решения был
разработан метод " прогулки по хромосоме ". Из клонотеки генов, полученной на
основе фаговых или космидных векторов, выделяют ген и короткие 5’- и 3’-
концевой фрагменты его последовательности используют в качестве зондов
для поиска фрагментов ДНК, перекрывающихся с этим геном. Основным
требованием, предъявляемым к зонду, является принадлежность его к
уникальной последовательности нуклеотидов, т.е. встречающейся в геноме
только один раз. С использованием такого простого подхода были исследованы
многие кластеры эукариотических генов, в частности β-глобинового локуса
человека, структура которого представлена на рис. II.14.
Рис. II.14. Генетическая карта локуса β-глобинового гена человека,
полученная методом "прогулки по хромосоме"
Перекрывающиеся фрагменты геномной ДНК человека получены путем ее
частичного расщепления рестриктазой EcoR I, сайты рестрикции для
которой отмечены поперечными черточками. Указаны расстояния между
EcoR I-сайтами рестрикции в т.п.о., гены β-глобинового локуса, а также
названия рекомбинантных фагов λ
С помощью "прогулки по хромосоме" удается детально картировать
участки ДНК длиной до 250 т.п.о. Недавно разработанный метод "прыжков по
хромосоме" позволяет стыковать за один прием фрагменты ДНК общей длиной
от 100 до 500–1000 т.п.о. В этом случае на первом этапе препарат
высокомолекулярной ДНК расщепляют соответствующей рестриктазой и с
помощью электрофореза в импульсном электрическом поле получают фракцию
фрагментов ДНК одинакового размера (в данном примере ~100 т.п.о.) (см.
рис. II.15). Затем фрагменты ДНК лигируют с маркерным геном, например геном
устойчивости к антибиотикам, что приводит к образованию кольцевых молекул.
Кольцевые молекулы ДНК расщепляют другой рестриктазой, для которой
отсутствуют сайты рестрикции в маркерном гене, что сопровождается
образованием коротких фрагментов ДНК, которые далее можно клонировать
обычными способами. Полученную клонотеку фрагментов ДНК исследуют с
использованием гибридизации с зондом, комплементарным точке начала
"прыжка по хромосоме". Отобранные в результате гибридизации клоны
содержат маркерный ген, фланкированный изучаемыми последовательностями
нуклеотидов, удаленными друг от друга на 100 т.п.о. Таким образом, получают
информацию о последовательностях нуклеотидов, удаленных от точки начала
"прыжка по хромосоме" на 100 т.п.о., и эти последовательности далее
используют в качестве зонда для выделения и исследования фланкирующих ее
фрагментов ДНК.
Рис. II.15. Схема метода "прыжков по хромосоме"
7.6.3. S1-картирование РНК и ДНК
Нуклеаза S1, специфически гидролизующая одноцепочечные ДНК и РНК,
успешно используется для исследования колинеарности ДНК и кодируемой ей
РНК, точного картирования мест инициации и терминации транскрипции на
ДНК-матрицах, а также для оценки гомологии между двумя молекулами ДНК
или РНК. Для обнаружения интронов в изучаемых генах клонированный в
составе геномной ДНК ген гибридизуют со зрелой РНК, кодируемой этим геном.
При наличии в гене интронов их последовательности в ДНК-РНК-гибридах
освобождаются в виде одноцепочечных участков и могут быть специфически
гидролизованы S1-нуклеазой. При электрофоретическом разделении продуктов
гидролиза в денатурирующих условиях при наличии интронов наблюдают
появление фрагментов ДНК, причем на основании размеров фрагментов можно
локализовать положение интронов в гене. Такой же подход используется и для
анализа гомологии между двумя последовательностями нуклеиновых кислот
или обнаружения мутаций.
Использование S1-нуклеазы позволяет с точностью до одного–двух
нуклеотидов картировать положение точек инициации и терминации
транскрипции внутри гена. И в этом случае короткие меченые фрагменты 5’-
или 3’-концевых частей гена, заключающие в себе указанные
последовательности ДНК, гибридизуют с исследуемыми РНК и образовавшиеся
ДНК-РНК-гибриды инкубируют с S1-нуклеазой. Электрофоретическая
подвижность полученного фрагмента ДНК, защищенного от действия S1-
нуклеазы концевой частью анализируемой РНК, сравнивается с таковой
фрагментов того же участка ДНК, образующихся при его секвенировании по
методу Максама-Гилберта. В результате однозначно определяют положение
нуклеотидов во фрагментах исследуемых ДНК, которые защищены в ДНК-РНК-
гибридах от действия S1-нуклеазы.
7.6.4. Футпринтинг
Принцип защиты последовательности нуклеотидов рестрикционных
фрагментов ДНК белками от действия агентов, расщепляющих ДНК, лежит в
основе футпринтинга – метода, позволяющего определять места
специфических контактов белков с ДНК. Этот метод оказался особенно
полезным для точной локализации последовательностей нуклеотидов генов,
взаимодействующих с регуляторными белками, активаторами и репрессорами,
а также с самими РНК-полимеразами, и своему появлению целиком обязан
генной инженерии. Рестрикционные фрагменты ДНК, последовательности
нуклеотидов которых известны, метят по одному из концов 32P и инкубируют с
исследуемыми белками. Образовавшиеся комплексы белок–ДНК подвергают
действию агентов, гидролизующих ДНК, например ДНКазы I, в условиях
неполного расщепления ДНК, и полученные продукты гидролиза разделяют с
помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей
авторадиографией. В отсутствие белка на авторадиограммах наблюдают
появление полного набора фрагментов ДНК в том виде, как это имеет место
при обычном секвенировании ДНК. Участки ДНК, защищенные белком от
действия ДНКазы, идентифицируются по исчезновению полос,
соответствующих продуктам статистического расщепления ДНК, концы которых
попадают в область связывания с белком. При этом на электрофоретических
дорожках появляются характерные пропуски (или "следы" – footprints), что и
дало название всему методу.
7.7. Стратегия выделения нового гена
После обсуждения основных экспериментальных приемов, используемых
в современной генной инженерии, становится ясно, каким образом можно
решить одну из основных методических задач молекулярной генетики, а
именно: выделить требуемый ген и заставить его работать в новых для него
генетических условиях. Такая задача наиболее просто решается в случае
бактериальных и вирусных генов, поскольку геном этих микроорганизмов
невелик. Кроме того, бактериальные гены, как правило, не содержат интронов и
даже гетерологичные бактериальные гены хорошо экспрессируются в клетках
E. coli. Но и клонирование эукариотических генов в настоящее время
представляется вполне посильной задачей. Приняв решение о клонировании
какого-либо эукариотического гена, прежде всего необходимо ответить на
вопрос: нужна ли экспрессия рекомбинантного гена в клетках микроорганизмов
или же можно ограничиться исследованием его структуры? Очевидно, что в
первом случае нужно думать о создании клонотеки безинтронных кДНК, а во
втором – клонотеки геномной ДНК исследуемого объекта, что в ряде случаев
технически менее сложно. Задача становится более трудной, если отсутствуют
сведения о первичной структуре клонируемого гена. Тогда единственным
источником получения частичной информации о последовательности его
нуклеотидов может быть кодируемый этим геном белок.
Определив последовательность нескольких N-концевых аминокислот
белка, можно в соответствии с генетическим кодом синтезировать ряд
олигонуклеотидных зондов, которые далее используют для скрининга клонотеки
генов. В этом случае удобнее использовать экспрессирующую клонотеку кДНК,
так как для получения необходимой информации нужно будет исследовать
меньшее количество клонов. Действительно, в клонотеках кДНК отсутствует
большинство некодирующих последовательностей нуклеотидов, суммарная
длина которых может значительно (на два–три порядка) превышать таковую
значимых последовательностей. Однако при использовании таких клонотек
особенно остро встает вопрос об их репрезентативности, поскольку
внутриклеточное содержание индивидуальных мРНК сильно различается в
клетках разных тканей. После выделения рекомбинантной ДНК,
гибридизующейся с упомянутыми выше олигонуклеотидными зондами, можно
идентифицировать кодируемый кДНК белок после ее экспрессии с
использованием специфических антител. Альтернативно: кодирующий
потенциал клонированной кДНК определяют после ее гибридизации с
суммарной мРНК, выделяя фракцию мРНК, задерживаемой иммобилизованной
кДНК на носителе, с последующей трансляцией мРНК в бесклеточной
белоксинтезирующей системе. Кроме того, если клонированная кДНК кодирует
мРНК исследуемого белка, то они и в растворе образуют специфический ДНК-
РНК-гибрид, и мРНК перестает участвовать в трансляции в бесклеточной
системе (метод прерванной трансляции). Наличие или отсутствие белкового
продукта бесклеточной трансляции легко обнаружить с помощью
специфических антител. После проведения таких исследований можно точно
идентифицировать клонированную кДНК и использовать ее в качестве зонда
для выделения целого гена из клонотеки геномной ДНК. Одновременно
возможна экспрессия клонированной кДНК в клетках микроорганизмов или в
гомологичных эукариотических клетках.
По-прежнему уникальной задачей, которая по плечу лишь большим
международным коллективам, остается клонирование неизвестных генов
животных и растений, функционирование которых можно заметить по сложным
фенотипическим признакам, например симптомам системного наследственного
заболевания. При выделении таких генов из генома человека работа
начинается с проведения скрупулезного анализа сцепления исследуемого
фенотипического признака и какого-либо полиморфного молекулярного
маркера, например редкого аллеля HLA или минисателлитного локуса всех
членов семьи больного. После обнаружения сцепленных маркеров задача
Дата добавления: 2015-08-29; просмотров: 17 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |