щий кодон
Понижение уровня мРНК на
≥50%; задержка созревания В-
клеток
Фактор роста нервов 1300 Экзоны Изменение базального уровня
фактора роста нервов в коже
wnt-1 4700 Экзоны Понижение уровня мРНК на
≤98%
Gαi2 39 5'-НТ и
инициирую-
щий кодон
Понижение уровня белка в
печени и жировой ткани на
≤95%, уменьшение скорости
роста тела
Таблица II.3 (окончание)
Гены-мишени
Длина
micРНК
(п.о.)
Мишень в
гене
Фенотип
Белок нуклеокапсида
вируса гепатита мышей
1800 Экзоны Повышение устойчивости к
вирусной инфекции
GLUT-2 1489 ｻ Понижение уровня белка
GLUT-2 на 80%
Интерлейкин 3 990 ｻ Понижение уровня IL-3,
приводящее к развитию
лимфопролиферативных
заболеваний β-клеток
Миниген COLIA1 ∼1200 ｻ Понижение уровня белка
COLIA1 на 50%, приводящее к
летальной ломкости костей
Ангиотензиноген 1900 ｻ До индукции промотора –
повышение уровня мРНК в
печени; после индукции –
понижение уровней мРНК в
печени и почках и повышение в
мозге на 20 дней, после чего
уровни нормализуются;
понижение уровня
ангиотензиногена в плазме
через 30 дней после индукции
Глюкокиназа β-клеток 1900 ｻ Понижение уровня мРНК в β-
клетках, сопровождаемое 50%-
ным снижением активности
глюкокиназы, повышение
уровня глюкозы в крови
Использование антисмысловых РНК для исследования онтогенеза
животных выявило высокую чувствительность определенных его стадий к
изменению уровня экспрессии генов, а также неспецифическую токсичность
антисмысловых транскриптов, проявляющуюся за счет взаимного влияния
различных частей ранних эмбрионов друг на друга и гетерогенности экспрессии
самих антисмысловых РНК в развивающихся зародышах. Это затрудняет
интерпретацию результатов, полученных при экспрессии антисмысловых РНК в
раннем эмбриогенезе. Поэтому более удобными объектами для получения
фенокопий являются культивируемые соматические клетки животных и
растений.
Исследование клеточного цикла. Антисмысловые РНК оказались
полезными в исследованиях роли протоонкогенов и факторов роста в
пролиферации клеток. С использованием такого подхода были изучены
протоонкогены c-fos, c-myc, c-src, антионкоген p53. В норме уровень экспрессии
c-myc выше в пролиферирующих клетках, чем в дифференцирующихся. В
присутствии антисмысловых олигонуклеотидов наблюдали понижение
внутриклеточного уровня белка c-Myc в клетках линии HL60, что
сопровождалось понижением скорости роста клеток и усилением миелоидной
дифференцировки. Природные антисмысловые c-myc-РНК были обнаружены
среди транскриптов клеток мышей. Антисмысловые c-fos -РНК предотвращали
повторное вхождение покоящихся клеток 3Т3 (фаза Go) в клеточный цикл.
Противовирусная терапия. Внутриклеточная экспрессия
антисмысловых РНК, направленных против мРНК некоторых ключевых
вирусных белков, может эффективно подавлять вирусную инфекцию. Этот
результат был впервые получен с клетками E. coli, содержащими плазмиды,
которые экспрессировали антисмысловые РНК, комплементарные различным
участкам генов бактериофага SP. Бактериальные клетки приобретали
иммунитет к фагу в наибольшей степени в том случае, если антисмысловые
РНК были комплементарны 5’-концевым последовательностям мРНК (включая
последовательности Шайна–Дальгарно) гена белка созревания. Менее
эффективными оказались антисмысловые РНК, комплементарные мРНК белков
оболочки бактериофага или его репликазы. 15-Нуклеотидная антисмысловая
последовательность, комплементарная сайту связывания рибосом мРНК, на
94% подавляла выход фага SP и оказывала значительный ингибирующий
эффект на развитие родственных фагов Qβ и GA. Эти опыты показали
принципиальную возможность использования антисмысловых РНК для борьбы
с вирусными инфекциями. Кроме того, высокая специфичность антисмысловых
РНК по отношению к вирусным последовательностям нуклеотидов сводит к
минимуму возможные цитотоксические и другие побочные действия.
Современные методы генной инженерии позволяют вводить гены
антисмысловых РНК в клетки зародышевой линии животных и растений, что
может обеспечивать наследование этих генов в ряду поколений.
Обнадеживающие результаты были получены в опытах по
ингибированию развития вируса саркомы Рауса (ВСР) в клетках перепелов.
Антисмысловые РНК, комплементарные мРНК белка оболочки ВСР, на 70–80%
предотвращали внутриклеточное развитие ВСР, дефектного по белку оболочки,
в присутствии плазмиды, экспрессирующей этот белок, которая без
антисмысловой РНК комплементировала развитие дефектного вируса.
Были получены трансгенные растения табака, которые содержали
экспрессирующий вектор, направляющий синтез антисмысловой РНК,
комплементарной мРНК белка оболочки вируса мозаики огурцов (ВМО). Такие
растения оказались устойчивыми к ВМО только при низкой множественности
инфекции, а иммунитет к ВМО мог быть преодолен с помощью высоких
концентраций инокулируемого вируса. Аналогичные результаты были получены
с трансгенными растениями табака, экспрессирующими антисмысловые РНК,
комплементарные транскрипту гена белка оболочки X. В этих опытах уровень
экспрессии антисмысловых РНК оказался недостаточным для того, чтобы
обеспечить полную устойчивость растений к вирусной инфекции, что требует
дальнейшей оптимизации условий экспрессии генов антисмысловых РНК в
клетках растений.
9.1.3. Природные антисмысловые РНК
За то время, которое прошло с момента открытия в середине 1970-х
годов антисмысловых РНК и их успешного использования для искусственной
регуляции экспрессии генов, стало ясно, что этот эффектный генно-
инженерный прием уже давно и широко используется самой природой для тех
же целей – модуляции экспрессии генов на молекулярном уровне. В
прокариотических системах антисмысловые РНК участвуют в регуляции
репликации и поддержании плазмид. Так, в случае плазмиды ColEI инициация
ее репликации негативно регулируется с помощью короткой, нетранслируемой
антисмысловой РНК. Антисмысловая РНК I плазмиды ColEI также играет
ключевую роль в обеспечении несовместимости плазмид, принадлежащих к
одной группе совместимости, внутри одной бактериальной клетки (подробнее
см. раздел 4.2.2). Похожие механизмы с участием антисмысловых РНК
используются и для регуляции репликации плазмид группы IncF1 (NR1, R1 и
R6) и IncQ (R1162), а также для регулирования числа копий плазмиды pT181
Staphylococcus aureus. Антисмысловые РНК служат у бактерий для регуляции
экспрессии генов на уровне транскрипции (например гена белка-рецептора
циклического АМР) и трансляции. В последнем случае антисмысловая РНК
micF участвует в подавлении экспрессии белка OmpF внешней мембраны
E. coli.
Экспрессия гена sulA E. coli, кодирующего SOS-индуцируемый ингибитор
деления бактериальных клеток, регулируется нетранслируемой РНК,
комплементарной на протяжении 250 нуклеотидов 3’-концевой части sulA -РНК.
Регуляция на уровне трансляции антисмысловыми РНК имеет место у
колицинового (E1) оперона плазмиды ColEI, а также оперона gvpABC
цианобактерии Calotrix 7601, которые обеспечивают образование газовых
везикул, придающих плавучесть бактериальным клеткам.
Антисмысловые РНК участвуют и в регуляции жизненного цикла
бактериофагов. Например, у бактериофага λ обнаружена короткая
антисмысловая РНК, комплементарная мРНК гена Q и ингибирующая ее
трансляцию. Это приводит к понижению уровня экспрессии поздних генов
бактериофага и ингибированию его литического развития. Другой
антисмысловой РНК фага λ, участвующей в регуляции экспрессии гена сII-
репрессора, является oopРНК. Эта РНК комплементарна 3’-концевой части
транскрипта гена cII и после образования гибрида ингибирует ее трансляцию,
вероятно, вследствие расщепления дуплекса РНКазой III клетки-хозяина.
Небольшая антисмысловая РНК (sarРНК) участвует в регуляции синтеза
антирепрессора фага P22. Та же система регуляции антисмысловых РНК
характерна и для некоторых транспозонов. Антисмысловые РНК природного
происхождения были обнаружены и в клетках эукариот. Так, наличие
небольших ядерных поли(A-)-РНК, комплементарных гену
дигидрофолатредуктазы, характерно для ядер клеток мышей. Геномные локусы
с генами, транскрибируемыми в двух противоположных направлениях, имеются
у мышей, крыс и дрозофилы. Образование антисмысловых РНК отмечено во
время латентной инфекции вирусом простого герпеса, а также в семенах
ячменя. В последнем случае были идентифицированы антисмысловые РНК,
комплементарные мРНК изозимов α-амилазы типов A и B.
Антисмысловые РНК, по-видимому, играют важную роль и в экспрессии
ранних генов вируса полиомы. Геном вируса полиомы представляет собой
небольшую кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК, на которой
транскрипция ранних и поздних генов происходит в противоположных
направлениях с промоторов, расположенных в межгенной регуляторной
области. Соответственно, в результате экспрессии ранних и поздних генов
транскрибируются разные цепи ДНК. Терминация транскрипции поздних генов
происходит неэффективно на поздних стадиях инфекции, что приводит к
образованию в ядрах зараженных клеток гигантских РНК, заключающих в себе
многократно повторяющуюся последовательность всего генома. При этом
последовательности нуклеотидов таких РНК, соответствующие ранним генам
вируса, являются антисмысловыми по отношению к нормальным ранним РНК
вируса как продуктам транскрипции противоположной цепи вирусной ДНК.
Накопление таких антисмысловых РНК приводит к резкому снижению
внутриклеточного уровня ранних РНК, а экспериментальная дестабилизация
антисмысловых РНК с помощью мутаций сопровождается значительным его
повышением in vivo.
Приведенных примеров достаточно, чтобы сделать вывод о широком
распространении антисмысловых РНК в природных условиях, хотя в случае
эукариотических организмов физиологическое значение антисмысловых РНК
непонятно. Расширение исследований в этой области молекулярной генетики
несомненно приведет к открытию новых регуляторных механизмов с участием
антисмысловых РНК. В том случае, если регуляторные функции
антисмысловых РНК, реализуемые через РНК–РНК-гибриды, будут
подтверждены у эукариот, это еще раз укажет на перспективность направления
поисков путей искусственной регуляции экспрессии эукариотических генов с
использованием антисмысловых РНК у животных и растений. Правильность
такого направления уже сейчас подтверждается возможностью получения
фенокопий у высших организмов с помощью антисмысловых РНК, а для
повышения эффективности их действия необходимо просто оптимизировать
условия их биосинтеза в эукариотических клетках. Использование техники
антисмысловых РНК позволяет осуществлять высокоспецифическую
инактивацию функционирования определенных генов in vivo и становится
особенно полезным в тех случаях, когда инактивация соответствующих генов
генетическими методами (с помощью мутаций) невозможна. Тем не менее
значительная вариабельность в уровнях экспрессии антисмысловых РНК в
клетках, содержащих эндогенные антисмысловые гены, а также
некаталитический характер действия антисмысловых РНК, требующий их
высокой внутриклеточной концентрации, накладывают серьезные ограничения
на их применение. В этой связи перспективным направлением представляется
использование рибозимов, фланкированных последовательностями
антисмысловых РНК. Внутриклеточная стабильность таких макромолекул
может быть существенно повышена путем конструирования антисмысловых
РНК с оптимально подобранной пространственной структурой, а также
использованием аналогов нуклеотидов для модификации этих макромолекул.
9.1.4. Антисмысловые РНК и патология: возможный механизм возникновения
доминантных мутаций
Вся совокупность полученных к настоящему времени данных позволяет
предполагать, что антисмысловые РНК могут образовываться не только в
результате реализации нормальных регуляторных механизмов, но и во время
различных патологических состояний организма, выступая одной из причин их
возникновения. Действительно, для того чтобы в клетке начали образовываться
антисмысловые РНК, достаточно возникновения инверсии кодирующей части
экспрессируемого гена, расположенной за промотором, направляющим
транскрипцию этого гена. В таком случае может осуществляться инактивация
самого гена, в котором произошла инверсия, и будет образовываться
антисмысловая РНК, комплементарная нормальной мРНК мутировавшего гена.
К аналогичным результатам будут приводить и транслокации кодирующих
частей генов (с одновременной инверсией) под контроль промоторов других
активно экспрессирующихся генов. По своей природе такого рода мутации,
приводящие к образованию антисмысловой РНК, должны сопровождаться
подавлением экспрессии аллельного гена, расположенного на гомологичной
хромосоме, и даже целого семейства гомологичных генов. Следствием этого
должно быть резкое снижение уровня и даже полное отсутствие в мутантной
клетке белкового продукта мутантного гена с образованием фенокопий. К каким
же последствиям для клетки могут приводить такие мутации?
В качестве одного из примеров, демонстрирующих потенциальную
важность этих мутаций в развитии патологических состояний организма,
рассмотрим возможные последствия инактивации с помощью вышеупомянутого
механизма генов-супрессоров опухолевого роста, называемых также
рецессивными онкогенами или антионкогенами. В настоящее время можно
считать доказанным, что различные формы такого онкологического
заболевания, как ретинобластома, возникают вследствие инактивации в
единственной клетке-предшественнице обеих копий одного гена – RB1. В
случае наследуемых форм ретинобластомы один мутантный аллель гена RB1
наследуется от одного из родителей больного, тогда как другой образуется в
результате соматической мутации в малигнизирующейся клетке-
предшественнице опухоли. При спорадической ретинобластоме инактивация
обоих аллелей гена должна произойти в одной клетке, что является редким
событием. Предлагаемая модель с участием антисмысловых РНК объясняет,
каким образом инактивация обоих аллельных генов RB1 может происходить в
результате одного мутационного события: инверсии части кодирующей
последовательности гена RB1 или одновременной инверсии и транслокации
части гена в новый хромосомный локус под контроль сильного промотора
другого гена. В настоящее время у млекопитающих известны не менее 12
хромосомных локусов, утрата которых в результате делеций сопровождается
малигнизацией клеток и которые содержат другие гены-супрессоры опухолей.
Каждый из этих локусов потенциально может быть инактивирован с помощью
эндогенных антисмысловых РНК. Следовательно, концепция антисмысловых
РНК дает простое объяснение молекулярных механизмов одновременной
инактивации аллельных рецессивных онкогенов в живом организме с
последующей малигнизацией клеток и развитием опухолей.
9.2. Рибозимы и дезоксирибозимы
Регуляция экспрессии генов с помощью антисмысловых РНК
характеризуется высокой специфичностью. Это обусловлено большой
точностью процесса РНК-РНК-гибридизации, основанной на комплементарном
взаимодействии друг с другом протяженных последовательностей нуклеотидов.
Однако сами по себе антисмысловые РНК не инактивируют необратимо мРНК-
мишени, и для подавления экспрессии соответствующих генов требуются
высокие (по крайней мере, эквимолярные по отношению к мРНК)
внутриклеточные концентрации антисмысловых РНК. Эффективность действия
антисмысловых РНК резко повысилась после того, как в их состав были
введены молекулы рибозимов – коротких последовательностей РНК,
обладающих эндонуклеазной активностью. Хотя ниже термин "рибозимы" будет
использоваться почти исключительно в отношении молекул РНК, обладающих
эндонуклеазной активностью, необходимо иметь в виду, что в настоящее время
известно множество других ферментативных активностей, ассоциированных с
РНК. Поэтому рибозимами в широком смысле называют молекулы РНК,
обладающие любой ферментативной активностью. Некоторые из этих
активностей будут рассмотрены в разделе 9.3 при обсуждении возможной роли
РНК в происхождении жизни.
9.2.1. Типы рибозимов
Эндорибонуклеазная активность РНК была впервые обнаружена
Т. Чехом в 1980 г. у интрона группы I предшественника рибосомной РНК
Tetrahymena, осуществляющего аутокаталитическую реакцию сплайсинга
(аутосплайсинга), в результате которой происходит вырезание из молекулы
предшественника рРНК последовательности этого интрона и образование
зрелой молекулы рРНК. (Молекулярный механизм реакции аутосплайсинга уже
был рассмотрен в первой части книги в разделе 3.3.2.) С тех пор
аутокаталитические реакции расщепления были выявлены у многих молекул
РНК (рис. II.25). Наиболее перспективными для использования в составе
антисмысловых РНК оказались рибозимы, образующие пространственную
структуру типа "головки молотка" (hammerhead – HH) (см. рис. II.25, а). Такие
РНК были найдены у сателлитных РНК вирусов растений, вироидов, а также
среди транскриптов сателлитных ДНК тритонов. У РНК подобного типа была
определена минимальная каноническая последовательность, необходимая для
появления ферментативной активности, длиной в 27 нуклеотидов, из которых
высококонсервативны 13 нуклеотидов, а также последовательность из трех
нуклеотидов, в пределах которой происходит расщепление фосфодиэфирной
связи (см. рис. II.25, а).
Рис. II.25. Особенности вторичной структуры рибозимов разных
типов
а – "головка молотка", б – шпилька, в – рибозим вируса гепатита δ, г –
рибозим Neurospora VS. Стрелки обозначают точки расщепления РНК;
нуклеозид N может быть A, U, G или C, H – A, U или C, Y – любой
пиримидин; приведены общепринятые обозначения элементов вторичных
структур рибозимов
Другими примерами рибозимов являются РНК, образующие структуры
типа шпилек, а также РНК вируса гепатита δ (ВГД) и сателлитная РНК Варкуда
(Varcud satellite – VS) нейроспоры (см. рис. II.25, б,в,г соответственно).
(Структура и механизм действия рибозимов в составе интронов групп I, II и III
были подобно рассмотрены в разделе 2.2.3.) Рибозимы со структурами типа
шпилек были впервые обнаружены у вироидов и вирусоидов растений,
рибозимы ВГД были идентифицированы среди сателлитных РНК вируса
гепатита В человека, а рибозимы VS – среди сателлитных РНК природных
изолятов Neurospora. В связи с рибозимами следует вспомнить и о РНКазе Р
E. coli, состоящей из небольшого полипептида и РНК длиной в 375 нуклеотидов,
о которой уже упоминалось в разделе 2.2.1. Именно РНК обеспечивает этому
ферменту эндонуклеазную активность, необходимую для процессинга
предшественников тРНК.
Хотя у природных РНК сайт расщепления и последовательность
нуклеотидов рибозима расположены на одной молекуле (in cis по отношению
друг к другу), HH-рибозимы могут действовать и на сайты расщепления,
расположенные in trans, т.е. на других молекулах РНК. Именно это свойство
рибозимов данного класса позволило использовать их для создания
высокоспецифичных эндорибонуклеаз на основе антисмысловых РНК, которые
обладают способностью расщеплять in trans молекулы РНК, содержащие
тринуклеотидные сайты расщепления. Для создания высокоспецифического
рибозима, функционирующего по этому принципу, последовательность
рибозима заключают в последовательность антисмысловой РНК таким
образом, чтобы при образовании гибрида с РНК-мишенью в контакте с
активным центром рибозима оказывалась тринуклеотидная
последовательность сайта расщепления.
9.2.2. Свойства рибозимов
Стабильность рибозимов в биологических жидкостях.
Нестабильность РНК является одним из основных ограничений,
препятствующих эффективному их использованию in vivo в качестве
лекарственных средств. Поскольку рибозимы представляют собой короткие
молекулы, которые можно получать в результате химического синтеза,
химические модификации этих олигонуклеотидов рассматриваются как одна из
перспективных возможностей повышения их устойчивости к нуклеазам. Было
установлено, что введение 2’- O- Me-модифицированных нуклеотидов вместо
обычных во все, кроме пяти, положения HH-рибозима позволило повысить его
стабильность, по крайней мере, в 1000 раз без существенной потери
каталитической активности. Другие модификации нуклеотидов в определенных
положениях: введение 2'-О-аллильных групп, фосфоротиоатных связей вместо
фосфодиэфирных, замена пиримидинов их 2’-амино- или 2’-
фторпроизводными, использование различных 2’-производных сахаров в
сахарофосфатном остове РНК и т.п., как правило, приводили к снижению
активности рибозимов, но сопровождались повышением их стабильности.
Улучшенные конструкции рибозимов с модифицированными сахарами
обладали каталитической активностью, свойственной рибозимам дикого типа,
со временем полужизни в сыворотке крови человека 5–8 ч. Кроме того,
введение на 3’-конец рибозима остатка dT, соединенного связью 3’-3’,
сопровождалось увеличением времени его полужизни в сыворотке до 3 дней.
Адресная доставка искусственных рибозимов. Существуют два
основных подхода к адресной доставке олигонуклеотидов. При одном из них
синтезированные молекулы рибозимов объединяют химическими методами или
физически с макромолекулами, например липидами или лигандами
рецепторов. В зависимости от природы молекул, находящихся в комплексе с
рибозимом, его доставка будет либо неспецифической (в составе липосом),
либо более специфической, которая может обеспечиваться, например
эндоцитозом, опосредованным рецепторами. Другая группа методов
использует экспрессирующие векторы, содержащие ген рибозима,
транскрипция которого сопровождается внутриклеточным биосинтезом его
молекул.
В ходе исследований по оптимизации адресной доставки рибозимов
были изучены многие конструкции липидных носителей. Такие конструкции
позволяют инкапсулировать большое количество молекул рибозимов как в
водном окружении, так и растворенными в липидном бислое. Соединение
липосом с молекулами соответствующих антител или других лигандов может до
некоторой (хотя и небольшой) степени обеспечивать тканеспецифическую
доставку рибозимов и их проникновение в клетки требуемых типов, например
пораженных вирусами. Циркулирующие липосомы быстро удаляются из
кровотока макрофагами ретикулоэндотелиальной системы. Химическая
модификация липидного бислоя или покрытие липосом оболочкой из
полиэтиленгликоля ослабляют неспецифическую сорбцию белков сыворотки, а
следовательно, и неспецифическое распознавание липосом макрофагами.
Для создания альтернативных гидрофобных комплексов молекул
рибозимов с носителем иногда используют катионные липиды. Такие липиды
содержат длинные цепи жирных кислот (обычно C16 или C18), соединенные с
полиамином. Полагают, что комплексы катионных липидов с
олигонуклеотидами не образуют липосомоподобных структур. Результаты,
полученные при исследовании возможностей адресной доставки рибозимов с
помощью липосом и другими аналогичными методами, вселяют оптимизм.
Однако до сих пор эти методы остаются чисто эмпирическими и должны
разрабатываться индивидуально для каждого нового рибозима и типа клеток, в
которые предполагается его доставлять.
Для адресной доставки генов рибозимов в составе экспрессирующих
векторов используют те же приемы, что и при генотерапии (подробнее см.
раздел 10.4). Особенно часто для этой цели применяются ретровирусы.
Включение в состав рибозима сигнальной последовательности этих вирусов,
обеспечивающей упаковку их РНК в вирусные частицы, на 90% снижает титр
соответствующих ретровирусов. При этом рибозим не оказывал влияния на те
же мишени, локализованные в цитоплазме.
Аденоассоциированные вирусы (ААВ), способные доставлять свою ДНК в
клетки многих типов, также часто используются в качестве носителей для
векторов, экспрессирующих рибозимы. Недавно сконструирован вектор,
который из всех последовательностей ААВ содержал только концевые
последовательности. С использованием этого вектора получена экспрессия
антисмысловых РНК гена tar вируса иммунодефицита человека, которая
блокировала его размножение. С помощью аденовирусов можно не только
направленно осуществлять доставку экспрессирующихся генов, но и
переносить большие молекулы декстранов, белков и плазмид, связанных с
лигандами, способными и неспособными к независимой репликации. Например,
удается транспортировать гены к дыхательному эпителию в составе
комплексов аденовирус–полилизин–ДНК. Адресная доставка векторов к
требуемым клеткам или тканям может быть осуществлена также
непосредственно в виде аэрозоля (эпителий легких) или ex vivo в случае клеток
костного мозга, который далее повторно вводят в организм больного.
Исследование функционирования рибозимов in vivo. Для
доказательства возможности использования рибозимов как лекарственных
средств необходимо было прежде всего продемонстрировать, что
осуществляемое ими расщепление мРНК сопровождается ожидаемыми
физиологическими и биохимическими изменениями в организме. В одних из
первых опытов использовали рибозимы, направленные против мРНК
хлорамфениколацетилтрансферазы (ХАТ), ген которой экспрессировался в
клетках животных. Рибозимы, синтез которых обеспечивался
экспрессирующими векторами, специфически на 60% подавляли
внутриклеточный синтез ХАТ. Кроме того, было показано направленное
действие рибозимов против 28S рРНК и ее предшественников, а также мРНК α-
лактальбумина, но не других родственных РНК, находящихся в клетках. В
результате в настоящее время считается признанным, что принцип действия
рибозимов подтвержден на клеточном уровне.
Для доказательства эффективности действия рибозимов in vivo с
помощью этих агентов была предпринята попытка индуцировать диабет у
мышей путем воздействия на мРНК глюкокиназы β-клеток поджелудочной
железы с помощью специфически экспрессирующегося в них трансгена
рибозима. Оказалось, что у экспериментальных мышей активность глюкокиназы
снижена в три раза именно в β-клетках, что приводило к нарушению секреции
ими инсулина и ответа на глюкозу. При этом рибозим не оказывал влияния на
функционирование клеток печени. Тем не менее уровень глюкозы в крови таких
трансгенных мышей оставался прежним, что позволило сделать вывод о
важности дефицита по глюкокиназе печени, а не только поджелудочной железы
для развития симптомов заболевания. Эти опыты продемонстрировали
возможность использования рибозимов для исследования физиологии у
интактных животных.
Эффектные результаты с рибозимами удалось получить и на дрозофиле.
Были созданы трансгенные яйца мух, содержащие ген рибозима, действующего
на мРНК гена fushi tarazu (ftz), находящегося под контролем температурно-
чувствительного промотора. Этот гомеозисный ген уже упоминался в связи с
обсуждением регулирующих его экспрессию факторов транскрипции в первой
части книги. Индуцируя рибозим в определенные фазы эмбрионального
развития дрозофилы, установили, что вначале нарушение функционирования
Дата добавления: 2015-08-29; просмотров: 15 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |