последовательности нуклеотидов ДНК для дальнейших исследований. В ряде
случаев, когда нет необходимости в скрининге большого числа клонов,
гибридизацию с зондами можно заменить ПЦР. При таком подходе в качестве
источника матричной ДНК используют суспензию бактериальных клеток или
фаговых частиц отдельных клонов без специальной очистки матричных
нуклеиновых кислот.
Часто бывает, что первичная структура искомого гена неизвестна. Тогда
применяют один из следующих способов. Во-первых, можно очистить
небольшое количество белка, кодируемого клонируемым геном, и определить
последовательность его нескольких N-концевых аминокислот. На основании
этих данных с учетом вырожденности генетического кода и частоты
встречаемости аминокислотных остатков у исследуемого организма
синтезируют олигонуклеотидные зонды, которые также используют для
гибридизации in situ, аналогично тому как было описано выше. Во-вторых,
клонотеку генов или кДНК получают с использованием экспрессирующих
векторов. В этом случае если 5'-концевая часть клонируемого гена будет
находиться близко от промотора вектора или его кодирующая часть будет
соединена в одной рамке считывания с инициирующим ATG-кодоном, то в
бактериальных клетках или фаговых лизатах можно обнаружить появление
специфического белкового продукта или ферментативной активности. Если
рекомбинантный белок неактивен и представляет собой лишь часть
полипептидной цепи нативного фермента, его обнаруживают
иммунохимическими методами. В ряде случаев отбор нужных клонов может
проводиться с помощью генетических методов с использованием специально
сконструированных векторных плазмид.
Рассмотренные способы не исчерпывают всех методических подходов,
используемых для идентификации определенных последовательностей
нуклеотидов в клонотеках генов. Но и эти часто применяемые методы дают
представление о том, каким путем сегодня можно выделить индивидуальный
ген и добиться его экспрессии в новом генетическом окружении.
7.4. Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов,
основанные на культурах клеток
Выделение любого нового рекомбинантного гена описанными выше
методами неизбежно заканчивается попытками получения его полноценной
экспрессии в искусственных генетических системах. Только на первый взгляд
экспрессия рекомбинантных генов в бактериальных клетках под контролем
хорошо изученных регуляторных элементов бактерий представляется наиболее
простой задачей. На практике, как уже обсуждалось ранее, экспрессия
эукариотических генов в бактериях происходит крайне неэффективно из-за
образования нерастворимых телец включения и отсутствия необходимых
посттрансляционных модификаций рекомбинантных полипептидных цепей. Для
преодоления этих затруднений в последнее время широко используются
культивируемые клетки животных и растений, в геном которых рекомбинантные
гены вводятся с помощью трансфекции.
Однако эффективный синтез рекомбинантных белков зависит не только
от используемых клеточных линий. Основное влияние на этот процесс
оказывают конструкция экспрессирующего вектора, а также сам метод
введения рекомбинантных ДНК в эукариотические клетки. В последнем случае
низкая эффективность доставки рекомбинантных молекул в клетки и
неоптимальная локализация сайтов их интеграции в геном могут свести на нет
все достоинства клеточных линий и экспрессирующих векторов. Для
повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов, стабильно
интегрированных в геном культивируемых клеток, разработаны методы их
селективной амплификации. С использованием одного из таких подходов
получены мутантные сублинии клеток яичников китайских хомячков CHO, в
которых амплификация происходит в присутствии селектирующего агента,
например метотрексата. Другие системы амплификации основаны на
подавлении экспрессии жизненно важных ферментов, например
глутаминсинтетазы или аденозиндезаминазы, под действием специфических
ингибиторов: метионинсульфоксимина или 2’-дезоксикоформицина
соответственно. Механизмы амплификации генов под действием ингибиторов
ферментов будут подробнее рассмотрены ниже на примере метотрексата (см.
раздел 7.4.1). Клеточные линии и клоны, стабильно продуцирующие
рекомбинантные белки, как правило, получают путем отбора из пула
гетерогенных клеток. И, наконец, еще одним существенным условием успешной
экспрессии рекомбинантных генов является оптимизация самого процесса
культивирования клеток, включая тщательный подбор культуральных сред.
Для получения рекомбинантных белков кроме вышеупомянутого метода
стабильно трансфецированных линий клеток используют еще два современных
подхода. С целью наработки небольшого количества рекомбинантных белков и
контроля функциональной целостности генно-инженерных конструкций часто
применяют временно экспрессирующиеся векторы, которые обладают
способностью к репликации в культивируемых клетках COS во внехромосомном
состоянии. В этом случае источником рекомбинантных белков являются
супернатанты клеток. При другом подходе рекомбинантные белки синтезируют
в культивируемых клетках насекомых после их заражения векторами на основе
генома бакуловирусов. Последний подход становится все более популярным,
так как допускает стабильную экспрессию многих рекомбинантных генов,
продукты которых могут находиться как внутри клеток, так и в ассоциированном
с поверхностью клеток состоянии, или они могут секретироваться в
культуральную жидкость.
Недавно швейцарскими исследователями (С. Гайссе с соавт., 1996 г.)
было проведено сравнительное изучение эффективности экспрессии гена
цитокина человека – фактора, ингибирующего лейкозы (leukemia inhibitory factor
– huLIF) в разных эукариотических системах. Фактор huLIF представляет собой
белок среднего размера, полипептидная цепь которого содержит несколько
потенциальных сайтов N-гликозилирования и в процессе фолдинга образует
три дисульфидные связи. Поскольку __________полученные результаты представляют
большой практический интерес для генной инженерии и биотехнологии, так как
иллюстрируют многие основные принципы функционирования рекомбинантных
генов в гетерологичных системах экспрессии, они будут кратко рассмотрены
ниже.
7.4.1. Клетки яичников китайских хомячков (линия CHO)
Эта линия клеток и ее многочисленные производные часто используются
для синтеза рекомбинантных белков после предварительной эндогенной
амплификации соответствующих рекомбинантных генов, введенных в клетки с
помощью трансфекции. Спонтанная амплификация генов в нормальных клетках
животных является редким событием, а в трансформированных (опухолевых)
клетках она происходит с частотой 10-4–10-6 за клеточную генерацию. Частота
амплификации определенных генов может быть повышена в результате
некоторых экзогенных воздействий, включая инкубацию клеток с
гидроксимочевиной, афидиколином, канцерогенами, а также под действием
ультрафиолетового света или γ-излучения и в условиях гипоксии.
Амплификация гена обычно начинается с его вырезания из хромосомы в
составе протяженного сегмента ДНК, сопровождаемого образованием
кольцевой структуры, которая продолжает существовать в виде
внехромосомного элемента (двойной минихромосомы (double-minutes – DM)),
способного к автономной репликации. Предполагают, что DM является
промежуточным продуктом амплификации, образующимся в условиях низкого
давления селектирующего фактора окружающей среды. На более поздних
стадиях амплифицирующаяся ДНК после повторной интеграции в геном
обнаруживается преимущественно в составе удлиненного участка хромосомы
(extended chromosomal region – ECR), иначе называемого гомогенно
окрашивающейся областью (homogeneously staining region – HSR). На этой
стадии амплифицированный участок генома клеток, а следовательно, и их
фенотип становятся более стабильными.
Для биотехнологических целей в системе амплификации
рекомбинантных генов в качестве селектируемого маркера часто используют
ген дигидрофолатредуктазы (ДГФР), интегрированный в экспрессирующий
вектор. ДГФР катализирует превращение фолиевой кислоты в
тетрагидрофолат, необходимый для синтеза эукариотическими клетками
глицина, тимидинмонофосфата и пуриновых оснований. В этой связи клетки
CHO, в которых ген ДГФР инактивирован под действием мутации, не растут на
средах без нуклеозидов и приобретают эту способность после трансфекции
геном ДГФР. Растущие трансфектанты далее отбираются по признаку
амплификации гена ДГФР на фоне увеличивающихся концентраций
метотрексата – ингибитора ДГФР, в питательной среде, так как увеличение
числа копий гена будет придавать клеткам устойчивость к ингибитору в
больших концентрациях. После проведения множественных раундов селекции
получают популяцию клеток, содержащих до нескольких сотен копий гена
ДГФР.
Рис. II.13. Кассеты генов в экспрессирующих векторах,
использованные для получения фактора, ингибирующего лейкозы, в
культурах клеток
а – кДНК huLIF (черные стрелки), включающая лидерные
последовательности (незаштрихованные прямоугольники), была
интегрирована в экспрессирующий вектор pXMT3 под контроль гибридного
промотора, расположенного между точкой начала репликации вируса
SV40 и основным поздним промотором аденовируса (SV40/AdMLP), ДГФР,
amp, neo – гены дигидрофолатредуктазы и устойчивости к ампициллину и
неомицину соответственно, VA – трансляционный энхансер; pA – сайт
полиаденилирования;
б – вектор pSV2neo-Ig-huLIF, сконструированный __________на основе
транскрипционных и трансляционных регуляторных элементов генов
тяжелой (IgH) и легкой (IgL) цепей иммуноглобулинов. Транскрипция
кассеты контролируется мышиным промотором гена IgL κ и энхансером
гена IgH. Транскрипт, содержащий последовательность huLIF, в
результате сплайсинга объединяется с экзоном 2 гена IgL, кодирующего
лидерную последовательность, которая обеспечивает секрецию зрелого
huLIF клетками;
в – вектор pGES-LIF, прямоугольники 1–4 – регуляторная область кластера
глобиновых генов, короткая черная стрелка – промотор β-глобинового
гена, ломаной линией отмечены последовательности, удаляемые
сплайсингом. Во всех случаях стрелки указывают направление
транскрипции
Размер амплифицированного геномного локуса значительно больше
размера селектируемого гена и может составлять несколько сотен тысяч пар
оснований. Трансфекция клеток геном ДГФР и исследуемым рекомбинантным
геном, заключенными в один экспрессирующий вектор, сопровождаемая их
интеграцией в геном, будет приводить к их совместной амплификации на фоне
метотрексата и усилению синтеза требуемого рекомбинантного белка, как
следствие увеличения дозы его гена. Данные о возможности сохранения
высокого уровня экспрессии гена в отсутствие селектирующего агента, т.е.
генетической стабильности продуцентов, противоречивы. Результат зависит от
генотипа конкретных клонов клеток, в том числе и локализации сайта
интеграции экспрессирующего вектора в геном клеток CHO. Эффективным
экспрессирующим вектором, используемым в описываемой системе, является
двухцистронная молекула ДНК, в которой исследуемый рекомбинантный ген
находится под контролем сильного промотора перед геном ДГФР, что
обеспечивает высокое сопряжение синтеза рекомбинантного белка с уровнем
устойчивости клеток к метотрексату (рис. II.13, а).
7.4.2. Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
Клетки миеломы находят широкое применение для получения гибридом
– линий клеток, производящих моноклональные антитела определенной
специфичности. Поскольку эти клетки осуществляют эффективную секрецию
рекомбинантных белков, они хорошо изучены в отношении экспрессии в них
соответствующих рекомбинантных генов, введенных с помощью трансфекции.
Кроме того, такие клетки способны расти в суспензионной культуре (без
прикрепления к поверхности субстрата), что облегчает их культивирование при
необходимости крупномасштабной наработки.
Линия клеток мышиной миеломы Sp2/0 Ag14, утративших способность
синтезировать или секретировать иммуноглобулины, часто используется для
производства рекомбинантных белков. Клетки этой линии легко
трансфецируемы рекомбинантными ДНК и могут выращиваться в больших
количествах на питательной среде без дорогостоящей сыворотки. Клетки Sp2/0
экспрессируют эндогенный ген ДГФР, что делает невозможным их прямое
применение для амплификации рекомбинантных ДНК с использованием
метотрексата. Это затруднение обычно преодолевают путем введения в
экспрессирующий вектор мутантного гена ДГФР, в котором точковая мутация,
сопровождаемая заменой T→G, приводит к замещению Leu→Arg в положении
22 полипептидной цепи ДГФР, следствием чего является понижение сродства
фермента к метотрексату в 270 раз. Благодаря этому после трансфекции может
быть проведен отбор клеток, содержащих мутантный ген ДГФР вместо
нормального, путем постепенного увеличения концентрации метотрексата в
среде. При умеренных концентрациях ингибитора эндогенный ген ДГФР
полностью инактивируется, тогда как мутантный ген остается активным и может
быть амплифицирован в результате описанного выше механизма после
повышения концентрации метотрексата в среде. Однако уровень
амплификации гена ДГФР и ассоциированного с ним рекомбинантного гена в
такой системе как правило ниже, чем в обычной, так как меньшее число
внутриклеточных копий мутантного гена требуется для обеспечения
необходимого уровня устойчивости клеток к ингибитору. Кроме того, было
показано, что высокий уровень внутриклеточной экспрессии рекомбинантных
генов, введенных в клетки Sp2/0 с помощью трансфекции, может
обеспечиваться после инкубации с метотрексатом за счет увеличения скорости
их транскрипции, а не в результате их амплификации. Такой результат может
быть получен в результате введения множественных копий гена ДГФР при
трансфекции. Структура одного из векторов, пригодного для использования с
миеломными клетками Sp2/0, представлена на рис. II.13, б). Транскрипция
трансгенов в этом векторе обеспечивается промоторно–энхансерными
элементами гена иммуноглобулина с участием эндогенных регуляторных
факторов клеток миеломы.
7.4.3. Клетки селезенки мышей (линия MEL)
Обе системы экспрессии, описанные выше, базируются на
амплификации трансгенов, обеспечивающей высокий уровень
внутриклеточного синтеза кодируемых ими рекомбинантных белков в
отобранных клонах клеток. Тем не менее, в природе уникальные гены (т.е.
присутствующие в виде одной копии на гаплоидный геном) могут
экспрессироваться с очень высокой эффективностью. Примером этого
являются, например иммуноглобулины, секретируемые плазматическими
клетками, или глобины, синтезируемые в больших количествах клетками
эритроидного ряда. Высокий уровень транскрипции глобинового локуса
становится возможным не только благодаря функционированию эффективных
промотора и энхансера, но и в результате присутствия так называемой
доминантной регуляторной области (dominant control region – DCR),
изменяющей пространственную структуру хроматина всего локуса. DCR
расположена за ~50 т.п.о. перед кластером глобиновых генов и вначале была
идентифицирована благодаря присутствию в ней нескольких сайтов,
гиперчувствительных к ДНКазе. Путем комбинирования последовательностей
нуклеотидов, окружающих сайты, удалось сконструировать небольшую
искусственную DCR, обладающую всеми основными свойствами исходной.
Рекомбинантные гены, объединенные в векторе с такой DCR,
экспрессировались с высокой эффективностью в клетках эритроидного ряда
независимо от места их интеграции в геном и не требовали для этого
предварительной амплификации. Таким образом, рассматриваемая система
позволяет избежать отрицательного влияния эффекта положения у
рекомбинантных генов, что избавляет от необходимости скрининга большого
числа трансфецированных клеток для получения высокопродуктивных
продуцентов рекомбинантных белков.
Для биотехнологических целей в настоящее время часто используется
линия клеток MEL-E9, которая является производной линии клеток MEL-NP5,
полученных из селезенки мышей NFS, зараженных дефектным по репликации
вирусом, образующим фокусы селезенки (spleen focus forming virus – SSFV).
Эти клетки не образуют вирусных частиц, но вызывают возникновение опухолей
после инъекции сингенным мышам. Они не претерпевают спонтанной
дифференцировки, однако под действием экзогенных факторов
(диметилсульфоксида, гемина или гексаметиленбисацетамида)
дифференцируются в клетки, содержащие гемоглобин.
На рис. II.13, в изображена схема экспрессирующего вектора,
применяемого с этой линией клеток. В нем область DCR соединена с
промотором, экзоном 2, интроном 2 и экзоном 3 β-глобинового гена, поскольку
показано, что присутствие последовательностей нуклеотидов интрона 2
абсолютно необходимо для эффективной экспрессии генов, направляемой
этим промотором. Рекомбинантный ген может быть встроен справа или слева
от интрона 2. После успешной трансфекции этот экспрессирующий вектор
обеспечивает независимую от эффекта положения и числа копий
тканеспецифическую экспрессию рекомбинантных генов в клетках
эритроидного ряда.
7.4.4. Клетки африканской зеленой мартышки (линия COS)
Получение временной экспрессии генов в клетках COS часто
используется для быстрой наработки рекомбинантных белков и ДНК. При
конструировании клеток COS клетки зеленой мартышки CV-1 были
трансформированы вирусом SV40 с дефектной областью начала репликации. В
результате были получены три линии клеток (COS-1, 2 и 7), конститутивно
экспрессирующих большой T-антиген вируса. После проведения трансфекции
клеток экспрессирующими плазмидами, содержащими область начала
репликации вируса SV40, последняя эффективно взаимодействует с
эндогенным T-антигеном, что сопровождается внехромосомной репликацией
плазмиды с образованием большого числа ее копий в цитоплазме клеток. Если
рекомбинантный ген в такой плазмиде находится под контролем подходящего
промотора, то это приводит к внутриклеточному образованию рекомбинантных
белков в больших количествах.
Число копий плазмид, введенных в клетки COS, достигает максимума
через ~48 ч после трансфекции. Далее внутриклеточный уровень плазмидной
ДНК начинает постепенно снижаться из-за ее цитопатического действия и
гибели клеток. В результате системы, основанные на клетках COS, не могут
быть использованы для крупномасштабной наработки рекомбинантных белков
в течение длительного промежутка времени. Максимальное внутриклеточное
содержание рекомбинантных белков в этих системах наблюдают через 72 ч
после трансфекции, и их синтез продолжается в течение последующих 5–10
дней на фоне медленного снижения количества клеток в культуре, что
позволяет все же использовать клетки COS для препаративного синтеза
рекомбинантных белков. С этой целью трансфекции одновременно подвергают
до 108 клеток с последующим их выращиванием на роллерах или
микроносителях, сопровождаемым многократным сбором культуральной
жидкости. Такой подход позволяет получать до нескольких миллиграммов
рекомбинантного белка из вышеописанного пула трансфецированных клеток.
Эффективность системы экспрессии, основанной на клетках COS,
зависит, в первую очередь, от природы рекомбинантного белка, которая
определяет его чувствительность к внутриклеточным протеиназам, а также
метода трансфекции, соотношения числа клеток и молекул рекомбинантных
плазмид, используемых для трансфекции, и состава питательной среды.
Пример экспрессирующей кассеты генов, используемой в этой системе,
представлен __________на рис. II.13, а. Такой фрагмент ДНК может быть интегрирован в
подходящую коммерческую плазмиду, в частности в экспрессирующий вектор
pXMT3.
7.4.5. Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
Многочисленное семейство бакуловирусов, размножающихся в клетках
беспозвоночных, обладает геномом в виде двухцепочечной кольцевой
ковалентно замкнутой ДНК длиной в 80–220 т.п.о. Круг хозяев бакуловирусов
ограничен главным образом членистоногими. Клетки млекопитающих могут
быть заражены бакуловирусами только при высокой множественности
инфекции. При этом вирус проникает в клетки, но в них не воспроизводится, не
экспрессирует рекомбинантные гены с промоторов насекомых и не способен
находиться (персистировать) в клетках животных длительное время.
Интерес к бакуловирусам как потенциальным переносчикам
рекомбинантных генов и системам, обеспечивающим их экспрессию, стал
возникать после того, как была обнаружена их способность к синтезу большого
количества вирусных белков на поздних стадиях инфекции. В частности, это
касается вирусных полиэдрина и белка p10, гены которых находятся под
контролем сильных поздних промоторов и которые могут быть удалены без
ущерба для размножения вирусов. Поэтому замещение указанных генов
рекомбинантными сопровождается усиленной экспрессией последних.
Первоначально использование бакуловирусов с культурами клеток
вызывало большие затруднения из-за экзотичности объекта исследования.
Однако с ростом интереса к этим системам экспрессии были разработаны
многочисленные варианты рекомбинантных вирусов и векторов на их основе,
включая челночные векторы для клеток дрожжей и бактерий. Кроме того, успех
этой системы связан с получением удобных линий клеток насекомых. В
настоящее время наиболее часто используемыми клеточными линиями
остаются IPLB-Sf-21-AE (получена из Spodoptera frugiperda), ее клональная
производная Sf9, а также BTI-TN-5B1–4 и TN368 из Trichopsula ni. Современные
клеточные линии насекомых выращивают в виде суспензионных культур на
роллерах и в ферментерах на питательных средах, не содержащих фетальной
сыворотки.
Для проявления в полной мере биологической активности многих
рекомбинантных белков требуются посттрансляционные модификации их
полипептидных цепей. Оказалось, что клетки насекомых обладают
способностью производить большое число таких модификаций, включая
гликозилирование, фосфорилирование, ацилирование остатками жирных
кислот и амидирование. Рекомбинантные белки могут претерпевать в них
адекватный протеолитический процессинг путем удаления сигнальных
последовательностей аминокислот и переноситься в соответствующие
клеточные компартменты. Были проведены интенсивные исследования
механизмов N-гликозилирования в клетках насекомых, которые показали, что
хотя оно и происходит, но не соответствует в полной мере таковому клеток
млекопитающих.
7.4.6. Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
Проведено сравнение эффективности рассмотренных выше систем
экспрессии эукариотических рекомбинантных генов с использованием гена
huLIF в качестве модели. In vivo этот белок с молекулярной массой 32–67 кДа в
зависимости от источника получения синтезируется под контролем уникального
гена, содержащего три экзона. Фрагмент кДНК, кодирующий зрелый
процессированный huLIF, клонировали в составе трех векторов, структура
которых изображена на рис. II.13, а–в. Для трансфекции клеток COS и CHO
использовали одну и ту же конструкцию (см. рис. II.13, а). Оказалось, что все
пять исследованных линий клеток обладали способностью к синтезу
рекомбинантного huLIF, обладающего биологической активностью. В клетках
линий CHO, Sp2/0 и MEL после проведения электрофореза продукт
обнаруживали в виде отчетливой, хотя и широкой полосы. В то же время
рекомбинантный белок в клетках, зараженных бакуловирусами, был
представлен дискретными фракциями меньшей молекулярной массы, что
указывало на его неполное гликозилирование. Рекомбинантный материал в
клетках COS был представлен дисперсной фракцией с молекулярной массой
20–40 кДа, что интерпретировалось в пользу ограниченной способности этих
клеток осуществлять процессинг сильно гликозилированных полипептидных
цепей.
Стабильные клетки-продуценты, созданные на основе амплификации
рекомбинантных генов, позволяют получать рекомбинантные продукты в более
высоких титрах по сравнению с клетками, адаптированными к "быстрой"
кратковременной экспрессии рекомбинантных белков (клетки MEL или COS).
Для получения высокого уровня экспрессии рекомбинантных белков во всех
обсуждаемых системах необходимо, прежде всего, учитывать особенности
структуры белка, который должен быть синтезирован, и конструировать
экспрессирующие векторы в соответствии с требованиями, предъявляемыми
теми или иными клетками. В ряде случаев предварительные исследования
такого рода бывает удобнее провести в бесклеточных белоксинтезирующих
системах, которые позволяют иногда получать даже препаративные количества
рекомбинантных белков.
7.5. Бесклеточные белоксинтезирующие системы
Среди искусственных систем биосинтеза белка важное место занимают
бесклеточные системы. Любая бесклеточная система создается, прежде всего,
для моделирования конкретных биохимических процессов, происходящих в
живом организме, и во время функционирования воспроизводит некоторые
существенные особенности жизнедеятельности клетки. В генной инженерии
бесклеточные белоксинтезирующие системы часто используются для
исследования кодирующего потенциала и механизмов экспрессии
клонированных генов in vitro, а также на промежуточных этапах
конструирования рекомбинантных генов для идентификации мРНК или
фрагментов ДНК по кодируемым белкам.
Большим преимуществом бесклеточных систем перед целыми клетками
является доступность их отдельных компонентов для экспериментальных
воздействий. Такие системы позволяют исследовать влияние различных
экзогенных факторов на их функционирование (ионные условия, рН,
ингибиторы и активаторы и т.п). Кроме того, в бесклеточной системе можно
легко заменять отдельные компоненты или непосредственно воздействовать на
них в изолированном состоянии и затем по реакции системы познавать их
функциональную значимость. Большинство результатов, полученных с
помощью бесклеточных систем, невозможно было бы иметь при использовании
живых клеток, так как последние при нарушении гомеостаза нередко гибнут.
При этом бывает трудно определить, какой же компонент оказался
критическим. К сожалению, перечисленные достоинства бесклеточных систем
одновременно являются их слабым местом, поскольку после разрушения
клеток безвозвратно исчезают те многочисленные взаимодействия между их
компонентами, благодаря которым можно без труда отличить живую клетку от
бесклеточного экстракта.
Бесклеточные белоксинтезирующие системы представляют собой одни
из самых сложных и многокомпонентных систем in vitro, используемых в
биохимии. Это связано с необходимостью воспроизведения в пробирке всех
этапов биосинтеза белка, включая транскрипцию, аминоацилирование тРНК и
трансляцию мРНК рибосомами. Тем не менее, уже более 30 лет удается
успешно осуществлять процесс биосинтеза белка in vitro и использовать такие
системы по трем основным направлениям: для анализа кодирующего
потенциала нуклеиновых кислот, исследования механизмов биосинтеза белка и
препаративной наработки некоторых рекомбинантных белков и пептидов.
По природе компонентов, которые определяют способность
бесклеточных систем осуществлять трансляцию определенных мРНК, принято
различать прокариотические и эукариотические системы. Естественно, что
наиболее эффективная трансляция мРНК происходит в гомологичных
Дата добавления: 2015-08-29; просмотров: 22 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |