отдельными генами и их фрагментами как в пределах геномов, так и между
различными геномами и организмами – обычное явление. В результате этих
событий переносимые гены не только сохраняют свою способность к
экспрессии в новом генетическом окружении, но и могут значительно менять ее
уровень, что часто сопровождается характерным изменением фенотипа
организмов.
Образование новых сочетаний генов и их частей в природных условиях,
по-видимому__________, не носит целенаправленного характера, и лишь жесткая проверка
естественным отбором может оценить жизненную значимость таких
преобразований геномов. Однако сознательное использование в лабораторных
условиях основных генетических принципов, лежащих в основе природных
перемещений генов, позволило разработать более эффективные системы
передачи генетической информации между организмами и приступить к
беспрецедентным по информативности исследованиям генетических явлений
на молекулярном уровне. У нас на глазах произошло рождение нового
направления в молекулярной биологии – генной инженерии, значение которого
не ограничивается результатами тех или иных фундаментальных и прикладных
исследований. Несомненно, именно с этого момента начался новый этап
эволюции биосферы Земли, все последствия которого мы в настоящее время
не в состоянии предвидеть.
Необходимость манипулирования генами диктуется конкретными
задачами фундаментальных и прикладных исследований. Для понимания
молекулярных механизмов функционирования отдельных генов и
взаимосвязанных генетических систем большое значение имеет работа с
изолированными генами. Такие исследования позволяют определить границы
генов, выделить их в чистом виде и идентифицировать элементы структуры,
существенные для функционирования. Доказательством функциональной
значимости выделенного участка генома может быть только его нормальная
экспрессия в модельной генетической системе. Поэтому следующим этапом
исследования выделенного гена всегда является перемещение его в такую
генетическую систему, где экспрессия гена легко обнаруживается. Результаты
экспрессии оценивают либо по появлению белкового продукта, кодируемого
исследуемым геном, либо по изменению функций биологической системы
вследствие появления в ней новой ферментативной или другой активности,
например по компенсации присутствующей в этой системе мутации. Таким
образом, в результате исследования структуры конкретного гена и
моделирования его экспрессии в искусственной генетической системе можно
понять особенности его функционирования в живом организме. Подобный
подход может быть успешно применен как к известным генам, которые
выделяются целенаправленно, так и к неидентифицированным ранее
последовательностям нуклеотидов, функциональную значимость которых
определяют лишь после выделения их в чистом виде. Последний подход
реализуется в так называемой обратной генетике.
В настоящее время с помощью методов генной инженерии получены
данные о структуре и функционировании генов разнообразных организмов, что
дало возможность перейти на качественно новый уровень генетических
исследований. Это, во-первых, возможность переноса гена в новое для него
генетическое окружение с дальнейшей его экспрессией, что ведет к изменению
свойств организма, в геном которого вводится ген (например создание
продуцентов биологически активных веществ или трансгенных животных), а
также осуществление генотерапии наследственных и приобретенных
заболеваний путем искусственного замещения мутантных аллелей. Во-вторых,
стало реальным конструирование новых генов путем объединения in vitro как
известных, так и новых, искусственно синтезированных последовательностей
нуклеотидов. Этот подход используется в белковой инженерии для
исследования функциональной значимости отдельных аминокислот и доменов
в полипептидных цепях ферментов, а также для создания новых белков. В-
третьих, в современной биотехнологии появилась возможность применять
изолированные гены в составе генно-инженерных конструкций для получения
пищевых продуктов и биологически активных веществ белковой природы.
Поскольку в экспериментальных условиях невозможно работать с одной
копией гена, получение необходимого числа идентичных копий гена или его
частей является первой и одной из основных задач генной инженерии. Для ее
решения используют метод молекулярного клонирования. Сущность метода
заключается в том, что нуклеотидная последовательность, которую необходимо
выделить или размножить, ковалентно встраивается в самореплицирующиеся
молекулы нуклеиновой кислоты, называемые векторами. Далее такая
последовательность нуклеотидов в составе вектора вводится в клетки про- или
эукариотического организма, и эти гибридные клетки в селективных условиях,
обеспечивающих сохранение вектора внутри клеток, выращивают на
питательной среде. В результате образуется клон клеток, теоретически
содержащих идентичные векторные молекулы с одной и той же вставкой
чужеродной последовательности нуклеотидов. Поскольку объединение
молекул клонируемой последовательности нуклеотидов и вектора является не
чем иным, как рекомбинацией in vitro, такие гибридные молекулы называют
рекомбинантными молекулами. В настоящее время разработаны
многочисленные методы, позволяющие выделять определенные
последовательности нуклеотидов из сложной смеси фрагментов хромосомной
ДНК, а также осуществлять обмен между строго определенными фрагментами
генов и другими последовательностями нуклеиновых кислот. Во всех этих
реакциях, как правило, используются высокоочищенные препараты
нуклеиновых кислот и ферментов нуклеинового обмена, особенности
использования которых будут кратко рассмотрены ниже.
Большинство ферментов, применяемых для молекулярного
клонирования нуклеиновых кислот, участвует в метаболизме нуклеиновых
кислот in vivo. Это означает, что генная инженерия в своем развитии опирается
на достижения исследований ферментных систем метаболизма нуклеиновых
кислот и существует благодаря возможности получения таких ферментов в
высокоочищенном состоянии. В то же время сам процесс клонирования и
исследования клонированных последовательностей нуклеотидов сводится в
основном к последовательному проведению in vitro определенных
ферментативных реакций с использованием очищенных ферментов и их
субстратов – нуклеиновых кислот.
При очистке ДНК и РНК в основном используются одни и те же приемы.
Различия в методах их фракционирования определяются значительно большей
чувствительностью молекул РНК к гидролитическому расщеплению из-за
присутствия у рибонуклеотидов, входящих в состав РНК, свободных 2'-ОН
групп, их более низкой молекулярной массой и наличием у одноцепочечных
молекул характерной (компактной) пространственной структуры. Для
выделения нуклеиновых кислот в нативном состоянии необходимо соблюдать,
по крайней мере, две предосторожности: следует использовать мягкие условия
разрушения тканей биологического объекта, содержащего изучаемые
нуклеиновые кислоты, и инактивировать гидролитические ферменты (ДНКазы
или РНКазы) до того, как они успеют гидролизовать молекулы нуклеиновых
кислот. С учетом этого ингибиторы нуклеаз вводятся в буферные растворы до
разрушения клеток или тканей. В качестве ингибиторов нуклеаз используют как
неспецифические денатурирующие агенты (ионные детергенты, гидроокись
ртути, гуанидинхлорид, гуанидинизотиоцианат, фенол, хлороформ и т.п.), так и
специфические ингибиторы, например ингибитор РНКазы из плаценты человека
или ванадиевые комплексы рибонуклеозидов.
Работу двухцепочечной геномной ДНК (особенно ДНК эукариотических
клеток) сильно усложняют значительная молекулярная масса и высокая
жесткость выделяемых молекул. Следствием этого являются большая вязкость
растворов высокомолекулярной ДНК и легкость ее фрагментации в растворах.
В связи с этим при выделении высокомолекулярной ДНК допускается лишь
мягкое перемешивание ее раствора в процессе депротеинизации
(освобождения от белков). Для этого на первых этапах очистки обычно
применяют протеолитические ферменты (протеиназу __________К из Trirachium album или
проназу из Streptomyces griseus), фенол и хлороформ. Поскольку при
освобождении от белков происходит одновременная очистка ДНК и РНК, для
освобождения от примесей РНК применяют высокоочищенные препараты
РНКаз без примесей ДНКаз (чаще всего панкреатическую РНКазу), а в случае
выделения РНК – ДНКаз, не загрязненных РНКазами.
Разделение ДНК и РНК центрифугированием в градиенте плотности
CsCI и сахарозы. Высокоэффективным методом разделения нуклеиновых
кислот, широко используемым при их очистке, является центрифугирование в
градиенте плотности хлористого цезия. В этом случае высокая ионная сила
буферного раствора в центрифужных пробирках способствует диссоциации
комплексов белков и нуклеиновых кислот, и разделение макромолекул
происходит на основании их различий в плавучей плотности. Перемещение
макромолекул во время центрифугирования происходит до тех пор, пока они не
достигнут зоны раствора CsCl с плотностью, равной их плавучей плотности. В
этой зоне происходит их концентрирование. Метод центрифугирования в
градиенте плотности CsCI в присутствии бромистого этидия используется в
генной инженерии для получения векторных плазмид в препаративных
количествах. Он позволяет отделять суперскрученные молекулы ДНК от
релаксированных и линейных, так как их плавучие плотности заметно
различаются из-за разного количества молекул бромистого этидия,
интеркалированного в эти топологические изомеры плазмидной ДНК. В
практической генной инженерии для очистки векторных плазмид
центрифугирование в градиенте плотности CsCI в настоящее время
используется редко. В целях обычного применения рекомбинантных ДНК, в том
числе для молекулярного клонирования, построения рестрикционных карт и
определения последовательности нуклеотидов (секвенирования), разработаны
методы минипрепаративного выделения. В одном из них суперскрученные
молекулы рекомбинантных плазмидных ДНК легко отделяются от линейных
молекул хромосомной и плазмидной ДНК в процессе щелочной денатурации с
последующей быстрой нейтрализацией раствора. При этом в основном
успевают ренатурировать только суперскрученные молекулы ДНК, так как две
их цепи остаются физически связанными друг с другом в процессе
денатурации. Образовавшийся комплекс денатурированной ДНК и белков
отделяется от плазмидной ДНК центрифугированием, а от основной массы РНК
освобождаются переосаждением в присутствии высокой концентрации LiCl.
Широко распространенным методом фракционирования нуклеиновых
кислот по размерам молекул является центрифугирование в градиенте
концентрации глицерина.
Электрофоретическое и хроматографическое разделение
нуклеиновых кислот. Для дополнительной очистки плазмидной ДНК иногда
применяют гель-фильтрацию на Сефакриле S1000 (крупнопористый
синтетический аналог сефадекса), а также электрофорез в агарозном геле.
Следует отметить, что электрофорез в агарозном, полиакриламидном или
смешанном агарозно-полиакриламидном гелях используют для определения
размеров и выделения небольших фрагментов двухцепочечной ДНК,
образующихся под действием эндонуклеаз рестрикции или во время
секвенирования ДНК. Проявление фрагментов в этом случае проводят с
помощью бромистого этидия, интеркалирующего между основаниями ДНК и
флуоресцирующего в ультрафиолетовом свете. Более чувствительными
методами обнаружения фрагментов ДНК в гелях являются окраска серебром,
авторадиография и введение флуоресцентной метки.
Отдельно следует упомянуть метод аффинной хроматографии на
олиго(dТ)-целлюлозе, используемый для специфической очистки
эукариотических мРНК, большинство из которых содержит на 3'-конце поли(А)-
последовательность. В олиго(dТ)-целлюлозе последовательности олиго(dТ)12-18
ковалентно присоединены к молекулам целлюлозы своими 5'-концевыми
фосфатными группами. При использовании этого метода фракцию суммарной
РНК наносят на колонку с олиго(dT)-целлюлозой в условиях, при которых
происходит гибридизация поли(А)-последовательностей мРНК с
комплементарными им последовательностями олиго(dТ)-целлюлозы. После
отмывания несвязавшихся со смолой молекул РНК, большинство из которых
являются рРНК и тРНК, фракцию поли(А)-РНК элюируют, прогревая колонку до
температуры плавления поли(А)•олиго(dТ)-гибридов или разрушая гибриды
понижением ионной силы элюирующего раствора.
Все перечисленные выше способы очистки и фракционирования
нуклеиновых кислот позволяют получать лишь относительно короткие
последовательности нуклеотидов. Однако в настоящее время в арсенале
молекулярной биологии имеются методы, которые дают возможность выделять
в гомогенном состоянии последовательности нуклеотидов, эквивалентные
целым хромосомам. Одним из таких методов является электрофорез в
импульсном электрическом поле (pulsed field gel electrophoresis – PFGE), с
помощью которого удается препаративно разделять ДНК целых хромосом
дрожжей. Другой эффективный метод, с помощью которого можно
фракционировать метафазные хромосомы млекопитающих, – это сортировка
хромосом с помощью проточной цитофлуориметрии. Метод позволяет получать
индивидуальные метафазные хромосомы в количестве, достаточном для
конструирования клонотек генов индивидуальных хромосом.
Все упомянутые выше методы очистки нуклеиновых кислот при
использовании в качестве исходного материала клеток бактерий, животных или
растений дают в руки исследователей сложную смесь генов и некодирующих
последовательностей нуклеотидов. Для выделения конкретных
последовательностей нуклеотидов и работы с ними необходимо использовать
многочисленные ферменты. Свойства некоторых ферментов, широко
используемых в генной инженерии, кратко рассмотрены ниже.
7.1. Основные ферменты, используемые в генной инженерии
7.1.1. Рестриктазы и ДНК-метилазы
Среди ферментов, используемых в генной инженерии для клонирования,
большое значение имеют эндонуклеазы рестрикции – рестриктазы. Эти
ферменты, впервые открытые как часть системы рестрикции–модификации
ДНК у бактерий, специфически гидролизуют молекулы двухцепочечных ДНК
при наличии в них определенных последовательностей нуклеотидов,
называемых сайтами рестрикции. В то же время метилазы используют для
ограничения числа сайтов рестрикции и получения более крупных фрагментов
ДНК с помощью рестриктаз.
Классификация рестриктаз. По механизму действия и молекулярной
структуре различают три типа рестриктаз. Ферменты рестрикции типа I
представляют собой сложные мультимерные комплексы, построенные из трех
субъединиц с молекулярной массой до 300 кДа, которые обладают
рестриктазной, ДНК-метилазной и АТРазной активностями. Рестриктазы типа I
для проявления своей активности требуют присутствия ATP, S-
аденозилметионина __________и ионов Mg2+, они не распознают специфические
последовательности нуклеотидов и в силу этого не находят широкого
применения в генной инженерии. Рестриктазы типа II узнают специфические
последовательности нуклеотидов в точке расщепления ДНК или
непосредственной близости от нее, требуют для проявления активности
наличия в реакционной смеси ATP и ионов Mg2+ и чаще всего используются при
молекулярном клонировании. Ферменты типа III также активны только в
присутствии ATP и ионов Mg2+ и не проявляют абсолютной зависимости от S-
аденозилметионина.
Рис. II.1. Формы разрывов двухцепочечных ДНК, образующихся под
действием рестриктаз
а – 5’-выступающие (1), 3’-выступающие "липкие" (2) и "тупые" (3) концы
ДНК, образующиеся под действием рестриктаз BamH I, Kpn I и Pvu II
соответственно. Стрелками обозначены места разрывов цепей ДНК,
пунктирной линией – ось симметрии сайтов рестрикции;
б – лигирование с потерей сайта рестрикции
Названия рестриктаз складываются из первых букв видовых названий
бактерий, в которых они обнаружены, например Eco – E. coli. В том случае,
когда различные по специфичности действия рестриктазы присутствуют в
клетках разных штаммов одного вида бактерий, в название рестриктазы вводят
дополнительную букву, например рестриктазы Hinc и Hind выделены из
бактериальных клеток Haemophilus influenzae, штаммы с и d. Цифры,
следующие за буквенными обозначениями, отражают последовательность
открытия соответствующих рестриктаз в клетках бактерий одного вида,
например Hae I, Hae II и Hae III из H. aegipticus.
Рестриктазы типа II – основной инструмент генной инженерии.
Большинство рестриктаз типа II специфически узнают на ДНК тетра- и
гексануклеотидные последовательности, а по крайней мере три из них –
октануклеотиды. Чем короче олигонуклеотидная последовательность сайта
рестрикции, узнаваемого рестриктазой, тем чаще он встречается в случайной
последовательности нуклеотидов, в которой каждый из четырех нуклеотидов
представлен с одинаковой частотой (50% А–Т-пар и 50% G–С-пар). Так,
случайная тетрануклеотидная последовательность встречается в среднем
через каждые 256 п.о. (44), а гексануклеотидная – через каждые 4096 п.о. (46).
Однако в природных ДНК распределение нуклеотидов может заметно
отличаться от случайного. Например, для эукариотических ДНК характерна
низкая частота встречаемости динуклеотида CpG и соответственно сайтов
рестрикции, содержащих эти динуклеотиды (рестриктазы Hha I, Hpa II, Taq I, Tha I,
Ava I, Hae II, Hind II, SalI, Sma I, Xho I, Xma I). Существенное отклонение частоты
встречаемости сайтов рестрикции от ожидаемого при случайном их
распределении вдоль ДНК свойственно и хромосомам термофильных бактерий,
которым, напротив, свойственно (хотя и не во всех случаях) обогащение по G–
С-парам. Для большинства сайтов, узнаваемых рестриктазами типа II,
характерно наличие в них симметрии второго порядка, т.е. узнаваемые ими
последовательности представляют собой палиндромы, например у рестриктазы
EcoR I – 5’-GAATTC-3’. Это означает, что нуклеотиды, расположенные в каждой
из цепей на равном расстоянии от оси симметрии, комплементарны друг другу.
Если точки расщепления противоположных цепей ДНК смещены друг
относительно друга в сайте рестрикции, то образующиеся в результате
рестрикции концы ДНК содержат выступающие одноцепочечные участки.
Поскольку такие участки комплементарны сами себе и друг другу и могут между
собой взаимодействовать, их часто называют " липкими" концами. В "липких"
концах выступающим одноцепочечным участком может быть как 5’-, так и 3’-
конец (рис. II.1, а). Формальным признаком образования 5’- или 3’-выступающих
"липких" концов в сайтах рестрикции является расположение точки
расщепления цепей ДНК в последовательности, используемой для
обозначения сайта рестрикции, слева или справа от оси симметрии
соответственно. У некоторых рестриктаз точки расщепления обеих цепей ДНК
расположены непосредственно друг под другом в сайте рестрикции. В этом
случае после расщепления ДНК "липких" концов не образуется, а получаются
так называемые "тупые" концы, в которых нет выступающих одноцепочечных
участков ДНК (см. рис. II.1, а). Имеется одно принципиальное функциональное
различие между 5’- и 3’-выступающими "липкими" концами – последние
невозможно пометить путем их достройки ДНК-полимеразой. Эту особенность
следует иметь в виду при выборе рестриктаз для получения рестрикционных
фрагментов ДНК, которые предполагается использовать в качестве зондов.
При конструировании рекомбинантных молекул полезно помнить, что,
хотя рестриктазы BamH I, Bcl I, Bgl II и Xho II узнают разные сайты рестрикции,
они образуют одни и те же "липкие" концы, GATC. То же характерно и для
группы рестриктаз SalG I, Xho I и Ava I (NCGA). При лигировании (см. ниже)
фрагментов ДНК, образованных рестриктазами одной из таких групп,
происходит их объединение, но при этом исходные сайты рестрикции теряются,
так как в результате образуется новая непрерывная последовательность
нуклеотидов (см. рис. II.1, б). Сайты рестрикции для некоторых рестриктаз II
типа не являются симметричными. Например, рестриктаза Hga I узнает
асимметричную последовательность 5’-GACGC-3’, а одноцепочечные разрывы
вносит в противоположные цепи ДНК, отступя вправо на 5 и 10 нуклеотидов
соответственно:
5’-GACGC(N)5↓
3’-CTGCG(N)5(N)5↓
Последовательности нуклеотидов образующихся "липких" концов
являются уникальными для каждого такого сайта рестрикции. Вследствие этого
рестрикционные фрагменты ДНК, образовавшиеся под действием данной
рестриктазы, в смеси соединяются друг с другом лишь в строго определенной
исходной последовательности, которая задается уникальными
последовательностями нуклеотидов в "липких" концах рестрикционных
фрагментов ДНК. Например, при расщеплении этой рестриктазой
репликативной формы ДНК фага φX174 образуется 14 фрагментов, которые
in vitro объединяются в правильную последовательность с образованием
инфекционной φX174-ДНК.
Универсальные рестриктазы для одноцепочечных ДНК. На основе
рестриктаз, узнающих асимметричные последовательности нуклеотидов,
разработана система, позволяющая расщеплять молекулы одноцепочечной
ДНК в любой заданной точке. С этой целью синтезируется олигонуклеотид, 5’-
концевая часть которого содержит сайт, узнаваемый такой рестриктазой, а
последовательность нуклеотидов 3’-концевой части комплементарна участку
ДНК, в который необходимо внести эндонуклеазный разрыв. В результате
гибридизации олигонуклеотида с одноцепочечной ДНК образуется структура,
изображенная на рис. II.2. При этом фермент взаимодействует с сайтом
узнавания (участок I), а разрывы вносятся по местам, обозначенным стрелками.
Таким образом, положение места эндонуклеазного расщепления будет целиком
зависеть от последовательности нуклеотидов участка II синтетического
олигонуклеотида, комплементарного ДНК-субстрату.
Рис. II.2. Расщепление одноцепочечной ДНК универсальной
рестриктазой
а – синтетический __________олигонуклеотид; б – одноцепочечная ДНК.
После образования шпильки и гибридизации с одноцепочечной ДНК-
мишенью олигонуклеотид образует сайт связывания рестриктазы (участок
I) и сайт расщепления ДНК-ДНК-гибрида (участок II). Стрелки указывают
места эндонуклеазного расщепления ДНК и олигонуклеотида
Изошизомеры. В клетках разных видов бактерий могут содержаться
рестриктазы, узнающие одни и те же сайты рестрикции. Такие рестриктазы
называют изошизомерами. Изошизомеры некоторых рестриктаз с успехом
используются для обнаружения метилированных участков ДНК в геноме. Так,
рестриктазы Hha I и Hpa II расщепляют неметилированные последовательности
GCGC и CCGG соответственно и утрачивают способность к расщеплению, если
хотя бы один из остатков цитозина в этих сайтах метилирован. В то же время
фермент Msp I (изошизомер Hpa II) расщепляет последовательность CCGG
независимо от того, метилированы или неметилированы остатки цитозина в
таком сайте. N-Метилирование остатков аденозина в ДНК можно обнаружить с
помощью изошизомеров Sau 3A (расщепляет как метилированные, так и
неметилированные последовательности GATC), Dpn I (расщепляет только
метилированные последовательности GMeATC) и Mbo I (расщепляет только
неметилированные последовательности).
Изменение специфичности действия рестриктаз в неоптимальных
условиях. Рестриктазы являются высокоспецифическими ферментами. Однако
для поддержания этой специфичности in vitro необходимо соблюдать в
реакционной смеси оптимальные условия для действия ферментов. При
нарушении таких условий у некоторых рестриктаз начинает проявляться
вторичная (так называемая штриховая) активность. Так, рестриктаза EcoR I
расщепляет последовательность GAATTC при pH 7,3, 100 мМ NaCl в
присутствии 5 мМ MgСl2, однако при изменении значений pH, понижении
концентрации NaCl или замене ионов Mg2+ на Mn2+, а также в присутствии
органических растворителей у фермента появляется тенденция к расщеплению
более короткой последовательности AATT (так называемая активность EcoR I).
К рестриктазам, обладающим подобными свойствами, относятся также BamH I,
Bst I, Bsu I, Dde I, Hha I, Pst I, Sal I, Sst I, Xba I.
Действие рестриктаз на необычные субстраты. Помимо
двухцепочечных ДНК многие рестриктазы способны использовать ДНК-РНК-
гибриды в качестве субстрата. Это относится, в частности, к рестриктазам
EcoR I, Hind II, Sal I, Msp I, Hha I, Alu I, Taq I и Hae III. Некоторые рестриктазы,
например Hae III, Hha I и Sfa I, способны расщеплять одноцепочечную ДНК фага
φX174, хотя и со значительно меньшей скоростью, чем соответствующую
двухцепочечную RF-форму. Такая способность была продемонстрирована для
некоторых других рестриктаз, а также ДНК-субстратов. Остается неясным,
узнают ли эти рестриктазы истинные одноцепочечные сайты или же
последовательности нуклеотидов, заключенные в элементы вторичной
структуры.
С развитием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (см. ниже)
часто возникает необходимость расщепления рестриктазами
амплифицированных олигонуклеотидов недалеко от их концов, т.е. в условиях,
когда сайт рестрикции фланкирован с одного из своих концов одним или
несколькими нуклеотидами. В этом случае установлена четкая зависимость
способности определенных рестриктаз расщеплять сайты рестрикции от
количества фланкирующих сайт нуклеотидов. Данное свойство рестриктаз
объясняют, в частности тем, что на самих концах двухцепочечной молекулы
ДНК происходит локальное плавление двойной спирали ДНК с образованием
коротких одноцепочечных участков, захватывающих сайт узнавания
рестриктазами. Частично избежать локальное плавление можно понижением
температуры реакционной смеси во время проведения рестрикции таких
олигонуклеотидов. Поскольку эти данные имеют большое значение для
практической генной инженерии, они суммированы в табл. II.1.
Таблица II.1
Эффективность расщепления коротких последовательностей ДНК
некоторыми распространенными рестриктазами
Процент расщепления
олигонуклеотида после
инкубации в течение
Рестриктаза Последовательность
олигонуклеотидов в
окрестностях сайта
рестрикции
Длина
цепи, нт
2 ч 20 ч
BamH I C GGATCC G
CG GGATCC CG
CGC GGATCC CGC
>90
>90
>90
>90
Bgl II C AGATCT G
GA AGATCT TC
GGA AGATCT TCC
>90
>90
Cla I C ATCGAT T
G ATCGAT C
CC ATCGAT GG
CCC ATCGAT GGG
>90
>90
EcoR I G GAATTC C
CG GAATTC CG
CCG GAATTC CGG
>90
>90
>90
>90
>90
>90
Hind III C AAGCTT G
CC AAGCTT GG
CCC AAGCTT GGG
Дата добавления: 2015-08-29; просмотров: 16 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |