расходятся из точки репликации, образуя Y-подобную структуру, называемую
репликативной вилкой. Именно в окрестностях этой точки разветвления и
локализован функционирующий репликативный комплекс. Современные
представления о строении репликативной вилки E. coli схематически
изображены на рис. I.46, а. В соответствии с этой моделью, ДНК-хеликаза
перемещается в репликативной вилке впереди ДНК-синтезирующего белкового
комплекса и расплетает цепи родительской ДНК, причем SSB-белок
связывается с образующимися одноцепочечными участками, облегчая процесс
расплетения.
Рис. I.46. Схема функционирующей репликативной вилки E. coli и
эукариот и основных этапов репликации ДНК
а – репликативная вилка с основными белками репликации, в которой
димер ДНК-полимеразы синхронно реплицирует обе цепи ДНК; б – этапы
репликации (1–8) отстающей цепи ДНК. Этап 7 у эукариот является
гипотетическим
Из-за антипараллельности и комплементарности цепей ДНК механизм
репликации этих двух цепей существенно различается. Действительно, ДНК-
полимераза обладает способностью синтезировать ДНК только в одном
направлении: от 5’-конца к 3’-концу, перемещаясь вдоль ДНК-матрицы в
направлении 3’→5’. В то же время комплементарные цепи ДНК противоположно
направлены (антипараллельны), и в силу своих свойств ДНК-полимераза не
может реплицировать молекулу ДНК, просто перемещаясь от одного конца
матричного дуплекса к другому. Для разрешения этого противоречия
репликативный комплекс использует изящный механизм. На одной цепи ДНК
синтез новой цепи происходит непрерывно, и образующаяся цепь называется
ведущей, тогда как синтез другой цепи осуществляется прерывисто в виде
коротких фрагментов, получивших название фрагментов Оказаки в честь
ученого, впервые их открывшего. Эта вновь синтезируемая цепь ДНК
называется отстающей. И хотя фрагменты Оказаки также синтезируются в
направлении 5’→3’, перемещение работающей ДНК-полимеразы вдоль
матричной цепи ДНК при синтезе каждого индивидуального фрагмента Оказаки
должно быть противоположным тому, которое имеет место в случае синтеза
ведущей цепи. Образующиеся фрагменты Оказаки отстающей цепи далее
соединяются друг с другом с помощью ДНК-лигазы.
Репликативный комплекс, который осуществляет синтез ведущей цепи
ДНК, включает в себя минимальный (кор-) фермент ДНК-полимеразы III (белок
43 в случае фага Т4), подвижный связывающий β-белок с молекулярной массой
41 кДа ("sliding clamp", белок 45 у фага Т4) и белки γ-комплекса, состоящего из
пяти полипептидов γδδ‘χψ (скрепляющие белки – brace proteins).
Функциональным аналогом белков γ-комплекса у бактериофага Т4 служит
комплекс белковых продуктов генов 44/62. При облучении клеток E. coli УФ-
светом в них индуцируется синтез укороченного β*-белка (26 кДа), который
является продуктом того же гена, что и β-субъединица холофермента ДНК-
полимеразы III. По-видимому, функциональная роль β*-белка заключается в
обеспечении репликации ДНК на матрице, поврежденной УФ-светом.
При синтезе ведущей цепи ДНК репликативный комплекс E. coli
функционирует весьма эффективно с высокой процессивностью. Напомним,
что мерой процессивности является длина фрагмента вновь синтезированной
макромолекулы, которую комплекс (или индивидуальные ферменты) способен
образовывать в одном цикле, не диссоциируя от матрицы. Установлено, что
холофермент ДНК-полимеразы III, в состав которого входят минимальный
фермент (субъединицы α, θ и ε), β-белок, белки γ-комплекса и τ-белок,
синтезирует __________ведущую цепь ДНК длиной в 50000 нуклеотидов со скоростью >500
нуклеотидов в секунду в одном цикле, ни разу не диссоциируя от ДНК-матрицы.
Точность репликации ДНК холоферментом ДНК-полимеразы III поражает
воображение. Частота ошибочных включений нуклеотидов не превышает 10-9–
10-10 на нуклеотид за один раунд репликации. В то же время очищенные
каталитические субъединицы реплицируют ДНК с пониженной точностью. В
частности, изолированная α-субъединица допускает ошибки в опытах in vitro с
частотой ∼6 10-1 на нуклеотид за один раунд репликации. Частота ошибок,
возникающих в ДНК, облученной УФ-светом, одна и та же в ведущей и
отстающей цепях вновь синтезируемой ДНК in vivo.
Роль γ-комплекса заключается в распознавании РНК-затравок
(праймеров) на матричной ДНК. γ-Комплекс связывается с единственным
праймером ведущей цепи ДНК или с каждым из праймеров фрагментов Оказаки
отстающей цепи, что, в свою очередь, делает возможным присоединение к
промаркированным таким образом праймерам минимального фермента ДНК-
полимеразы и β-белка (см. рис. I.46, б).
Две молекулы β-белка входят в состав репликативного комплекса вслед
за белками γ-комплекса, связываясь с ДНК позади белков γ-комплекса и
оставляя 3’-конец праймера доступным для ДНК-полимеразы. Димер β-белка
образует кольцо вокруг молекулы ДНК и стимулирует АТРазную активность
белков γ-комплекса. Как уже упоминалось выше, функциональный аналог β-
белка – продукт гена 45 бактериофага Т4, образует такую же пространственную
структуру, охватывающую молекулу ДНК тремя молекулами. Молекулярная
масса белка 45 составляет 2/3 от таковой β-мономера, и их аминокислотные
последовательности негомологичны друг другу. Тем не менее, четвертичные
структуры этих полипептидов и механизмы их функционирования обладают
большим сходством.
β-Белки и белки γ-комплекса, будучи связанными с дуплексом праймер–
матрица, обеспечивают присоединение к этому комплексу минимального
фермента ДНК-полимеразы. Затем ДНК-полимераза при наличии доступных
четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, используя праймер для
инициации синтеза ДНК, с высокой эффективностью синтезирует цепь ДНК,
комплементарную ДНК-матрице. Те же самые белки участвуют и в синтезе
отстающей цепи ДНК. В этом случае прерывистый синтез ДНК многократно
инициируется на большом количестве праймеров, и ДНК синтезируется в виде
фрагментов Оказаки длиной ~1000 нт. Синтез затравок, представляющих собой
короткие последовательности РНК, обеспечивает продукт гена dnaG (белок 61
фага Т4). ДНК-полимераза начинает элонгацию цепей ДНК, присоединяя
первый дезоксирибонуклеозидмонофосфат к 3’-концевому нуклеотиду РНК-
затравки. В процессе элонгации участвуют β-белок и белки γ-комплекса,
которые перемещаются вдоль молекулы ДНК вместе с каталитической
субъединицей ДНК-полимеразы.
Ведущая и отстающая цепи ДНК реплицируются координированно, что
обеспечивается димеризацией ДНК-полимеразных комплексов. В таком
димере, который образуется при участии τ-белка, один ДНК-полимеразный
комплекс осуществляет непрерывный синтез ведущей цепи ДНК, а другой –
фрагментов Оказаки отстающей цепи. Для димеризации ДНК-полимеразы III
E. coli необходим τ-белок, в то время как продукт гена 43 бактериофага Т4, по-
видимому, изначально находится в виде димера. Другое различие
репликативных комплексов E. coli и фага Т4 заключается в том, что
холофермент ДНК-полимеразы E. coli (субъединицы αεθ·γδδ‘·χψ·τ·β)
сохраняется в виде стабильного комплекса и в отсутствие ДНК, тогда как
холофермент Т4-ДНК-полимеразы существует только в присутствии матрицы.
Необычность ситуации во время синтеза ДНК в репликативной вилке
заключается в том, что один и тот же белковый комплекс осуществляет как
высоко процессивный непрерывный синтез ведущей цепи ДНК, так и
прерывистый синтез фрагментов Оказаки отстающей цепи, претерпевая во
втором случае периодическую диссоциацию от матрицы для инициации синтеза
ДНК с каждого нового праймера. Для объяснения такого парадокса
предположили, что холофермент ДНК-полимеразы способен узнавать 5’-конец
каждого РНК-праймера, встречающегося после завершения синтеза очередного
фрагмента Оказаки во время образования отстающей цепи ДНК в процессе
репликации. Недавно с помощью оригинального экспериментального подхода
удалось решить этот вопрос. В участок полипептидной цепи β-белка,
контактирующий с минимальным ферментом ДНК-полимеразы III, методами
генной инженерии ввели аминокислотную последовательность, узнаваемую и
фосфорилируемую протеинкиназой. Измеряя скорость фосфорилирования этих
сайтов в условиях избытка протеинкиназы во время синтеза ДНК in vitro,
определили кинетику ассоциации и диссоциации комплексов β-белок–ДНК-
полимераза по изменению уровня защищенности сайтов фосфорилирования от
действия протеинкиназы. Полученные результаты интерпретировали таким
образом, что во время связанного с синтезом фрагментов Оказаки
перемещения минимального фермента ДНК-полимеразы и γ-комплекса вдоль
одноцепочечной ДНК-матрицы, покрытой SSB-белком, оба белка прочно
связаны с β-белком и матрицей. При встрече репликативного белкового
комплекса с дуплексом, образованным матричной ДНК и РНК-затравкой, β-
белок остается связанным с вновь синтезированной ДНК, а у отделившихся
ДНК-полимеразы и белков γ-комплекса появляется возможность вступить в
новый цикл синтеза фрагмента Оказаки путем взаимодействия с очередным
дуплексом РНК-затравка–матрица. При этом вхождение ДНК-полимеразы в
новый репликативный комплекс облегчается наличием в нем β-белка и белков
γ-комплекса, ассоциированных с очередным РНК-праймером. Таким образом,
холофермент ДНК-полимеразы III обладает способностью распознавать
молекулярное окружение, создаваемое матричной ДНК, осуществлять
терминацию синтеза ДНК при наличии сигнала в виде дуплекса ДНК–затравка и
реинициировать синтез ДНК на следующем праймере. В итоге одна и та же
молекула ДНК-полимеразы III в составе реплицирующего комплекса способна
проводить синтез всех фрагментов Оказаки отстающей цепи реплицируемой
ДНК, последовательно осуществляя инициацию, терминацию и реинициацию
синтеза каждого из них.
После очередной терминации синтеза ДНК отстающей цепи 3’-конец
вновь синтезированной ДНК оказывается вплотную приближенным к 5’-концу
праймера следующего фрагмента Оказаки. Для соединения двух фрагментов с
помощью ДНК-лигазы необходимы предварительное удаление РНК-праймера и
достройка цепи ДНК в образующейся бреши. РНК-затравка удаляется с
помощью РНКазы H, нуклеазы, специфически расщепляющей РНК в ДНК–РНК-
гибридах, и(или__________) с участием 5’→3’-экзонуклеазы ДНК-полимеразы I. Во втором
случае одновременно с удалением праймера происходит застройка
образующейся бреши той же ДНК-полимеразой. В итоге два соседних
фрагмента Оказаки вплотную приближаются друг к другу и оказываются
отделенными лишь одноцепочечным разрывом, который может репарироваться
ДНК-лигазой. В настоящее время остается открытым вопрос о механизмах
координации удаления РНК-праймеров из фрагментов Оказаки с самим
процессом репликации ДНК.
Кроме вышеупомянутых дуплексов праймеры–ДНК, холоферменты
бактериальных и фаговых ДНК-полимераз, по-видимому, способны адекватно
реагировать на другие стерические препятствия, возникающие на пути
следования вдоль реплицируемой молекулы ДНК. В частности, ДНК-
полимераза фага Т4 в процессе репликации может расходиться с
транскрибирующими ту же ДНК молекулами РНК-полимеразы, не диссоциируя
из репликативного комплекса и не вытесняя РНК-полимеразу с матрицы. Кроме
того, репликативный комплекс может распознавать повреждения ДНК,
возможно, маркированные специфическими белками, и прекращать
репликацию соответствующего участка, останавливаясь или диссоциируя от
матрицы. Репликация таких участков ДНК возобновляется после ликвидации
повреждений ферментами репаративной системы. Для диссоциировавшей
ДНК-полимеразы это становится возможным благодаря тому, что 3’-конец
вновь синтезированной цепи ДНК в месте остановки репликации остается
связанным с β-белком, который облегчает повторное вхождение
диссоциировавшей ДНК-полимеразы в репликативный комплекс.
4.1.3. Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
Механизмы репликации ДНК у высших эукариот менее изучены из-за их
большей сложности. Основные результаты получены на модельной системе с
ДНК вируса SV40, в которой процесс репликации исследовали в зараженных
клетках человека, культивируемых in vitro. В этой системе вирусный белок,
называемый Т-антигеном, выполняет многие функции, необходимые для
репликации вирусной ДНК. Во-первых, он является белком-инициатором,
необходимым для инициации репликации; во-вторых, он обладает ДНК-
хеликазной активностью, т.е. расплетает цепи реплицируемой ДНК перед
работающей ДНК-полимеразой, и, в-третьих, Т-антиген необходим для
правильного взаимодействия с ДНК ферментного комплекса, синтезирующего
праймеры (праймосомы). Тем не менее, вирус SV40 использует для репликации
ДНК своей небольшой хромосомы и многие белки клетки-хозяина, что
позволяет исследовать функционирование репликативного комплекса клеток
человека в такой относительно простой системе.
У эукариот обнаружены шесть ДНК-полимераз, три из которых – α, δ и ε –
непосредственно участвуют в репликации хромосомной ДНК (табл. I.17).
Аминокислотные последовательности этих трех ферментов гомологичны друг
другу и последовательности продукта гена 43 бактериофага Т4.
Эукариотическая ДНК-праймаза в отличие от аналогичного белка прокариот
образует постоянный комплекс с ДНК-полимеразой α, роль которого, по-
видимому, ограничивается синтезом праймеров при репликации обеих цепей
ДНК.
Белок PCNA и фактор репликации C (RFС) также образуют стабильный
комплекс с ДНК-полимеразой δ, а в определенных условиях стимулируют и
активность ДНК-полимеразы ε. Во многих отношениях PCNA и RFС являются
функциональными аналогами соответственно β-белка и белков γ-комплекса
E. coli (см. рис. I.46, б), и их роль в синтезе ведущей и отстающей цепей ДНК
вируса SV40 хорошо известна. Механизмы репликации ДНК прокариот и
эукариот существенно различаются в том отношении, что во втором случае
синтез ведущей и отстающей цепей ДНК
Таблица I.16
Эукариотические ДНК-полимеразы и их функциональные гомологи у
прокариот
ДНК-
полимер
аза
Ген
дрожжей
Гомолог
E. coli
Молекулярные
массы
субъединиц,
кДа
Биологические функции
α POL1? 160–185 Синтез ведущей цепи геномной
ДНК в репликативной вилке; в
комплексе с праймазой
обеспечение синтеза праймеров
на обеих цепях ДНК
β Pol I 40 Заполнение брешей при
эксцизионной репарации ДНК,
участие в рекомбинации
γ MIP1 − 140 (человек)
116 (дрожжи)
Репликация митохондриальной
ДНК
δ POL 3 Pol III 125 Синтез отстающей цепи геномной
ДНК в репликативной вилке
ε POL 2 Pol II (?) 210–230 Репарация ДНК, регуляция
клеточного цикла (?)
ζ REV3 и
REV7
Pol IV
(DinB/P)
173 и 29 Синтез ДНК на поврежденной
матрице при SOS-ответе
η RAD30 DinB,
UmuC
70 Синтез ДНК на поврежденной
матрице, с включением остатков
А напротив тиминовых димеров
Примечание.? − гомологи неизвестны.
осуществляют разные ДНК-полимеразы (α и δ соответственно), тогда как у
E. coli обе цепи ДНК синтезируются димером ДНК-полимеразы III. ДНК-
полимераза α проводит инициацию синтеза ведущей цепи в точках начала
репликации, а ДНК-полимераза δ осуществляет циклические реинициации
синтеза фрагментов Оказаки, по-видимому, распознавая наличие 5’-концевого
нуклеотида очередного праймера с последующей диссоциацией от матричной
ДНК и присоединением к ней для реинициации синтеза следующего фрагмента
Оказаки. Созревание фрагментов Оказаки у эукариот требует удаления РНК-
затравок с помощью 5’→3’-экзонуклеазы (белковые факторы FEN-1 или MF-1) и
РНКазы H1, а также ковалентного соединения фрагментов друг с другом под
действием ДНК-лигазы I.
Роль ДНК-полимеразы ε в настоящее время не ясна. Возможно, этот
фермент непосредственно участвует в репликации или в сопряженной с
репликацией репарации повреждений ДНК, а также в регуляции клеточного
цикла.
ДНК-полимераза ζ обнаружена в 1996 г. у дрожжей S. cerevisiae. При
исследовании белков Rev3 и Rev7, которые необходимы для мутагенеза,
индуцируемого в ответ на повреждения ДНК, оказалось, что их комплекс
обладает ДНК-полимеразной активностью. Эта полимераза способна
эффективно использовать в качестве матрицы ДНК, содержащую
циклобутановые димеры. В таких условиях активность ДНК-полимеразы α
составляет лишь 1% от активности ДНК-полимеразы ζ.
ДНК-полимераза η, так же как и предыдущий фермент, участвует в SOS-
ответе дрожжей на генотоксические воздействия. В присутствии всех четырех
дезоксирибонуклеозидтрифосфатов она осуществляет включение в
строящуюся цепь ДНК напротив тиминовых димеров только правильных
нуклеотидов (А). Подробнее о функциях бактериальных гомологов двух
последних ДНК-полимераз в SOS-мутагенезе см. в разделе 5.1.2.
4.2. Регуляция репликации ДНК
Подробное рассмотрение молекулярных механизмов регуляции
репликации ДНК выходит за рамки книги, поэтому ограничимся несколькими
замечаниями по данному вопросу и более детально обсудим лишь механизм
регуляции репликации у E. coli, в том числе и бактериальных плазмид, что
имеет непосредственное отношение к функционированию плазмидных
векторов в бактериальных клетках.
Синтез ДНК тесно связан с другими процессами, подготавливающими
деление клеток, так как передача необходимой генетической информации
родительских клеток дочерним является для клеток-потомков жизненно важной.
Наличие избыточной генетической информации отрицательно сказывается на
жизнеспособности клеток, тогда как недостаток ее, возникающий вследствие
недорепликации ДНК, приводит к летальному эффекту из-за отсутствия
жизненно важных генов. Однако процесс передачи генетической информации
от родительских клеток дочерним у эукариот не ограничивается простой
редупликацией ДНК хромосом. Так, для насекомых многих видов характерно
наличие гигантских политенных хромосом, которые возникают в результате
множественных раундов репликации ДНК исходных хроматид, не
сопровождающейся их расхождением.
Политенизация хромосом представляет обширный класс генетических
явлений, связанных с избирательной избыточной репликацией
(мультипликацией) или недорепликацией отдельных генетических локусов
эукариот. Ярким примером такого рода является изменение числа генов
рибосомных РНК у животных. Амплификация генов рРНК в ооцитах амфибий
происходит путем образования их внехромосомных (экстрахромосомных) копий
в виде кольцевых молекул рибосомных (р) ДНК, которые далее реплицируются
по механизму "катящегося кольца". При этом в каждой клетке амплифицируется
только по одному из сотен повторов рДНК, так что амплификация рДНК на
одном повторе каким-то образом подавляет процесс амплификации на других,
и все образовавшиеся повторы одного ооцита идентичны, но отличаются от
наборов амплифицированных рДНК других ооцитов. Строгая стадие- и
тканеспецифичность, а также избирательная амплификация только одного
повтора рДНК указывают на наличие тонких регуляторных механизмов
процесса репликации и в этом случае.
Характерными примерами возрастания числа генов вследствие их
избирательной репликации являются магнификация генов рРНК и изменение
числа генов, определяющих устойчивость клеток к лекарственным препаратам.
В первом случае утрата части генов рРНК у дрозофилы в результате делеции
сопровождается постепенным восстановлением их числа, тогда как во втором
случае у клеток, находящихся в условиях селективного действия токсичного
для них лекарственного препарата, возрастает число копий генов, необходимых
для его нейтрализации. В частности, это характерно для гена
дигидрофолатредуктазы в присутствии метотрексата. Высказывается
предположение, что в основе изменения числа копий таких генов лежит
механизм неравного кроссинговера.
Репликация хромосом бактерий тесно сопряжена с метаболизмом клеток.
Например, частота инициаций новых раундов репликации зависит от скорости
роста бактериальных клеток, и в клетках быстро растущих бактерий могут
содержаться хромосомы с несколькими работающими репликативными
вилками, хотя для репликации одной бактериальной хромосомы их требуется
только две, инициированные в единственной области начала репликации (ori) и
расходящиеся в противоположных направлениях. Это позволяет бактериям при
благоприятных условиях затратить для генерации меньше времени, чем для
полной репликации бактериальной хромосомы. Очевидно, что для
поддержания строго упорядоченного характера репликации должны
существовать тонкие механизмы регуляции репликации на уровне инициации
новых раундов. Такие механизмы, действительно, существуют.
Наиболее хорошо изученными в настоящее время являются механизмы
регуляции синтеза ДНК у E. coli, в том числе механизмы контроля числа копий у
небольшой плазмиды E. coli ColE1, которые будут рассмотрены ниже более
подробно из-за важности этих явлений для генной инженерии.
4.2.1. Инициация репликации ДНК у E. coli и ее регуляция
Репликация хромосомной ДНК у бактерий играет ключевую роль в их
жизненном цикле. В ходе этого процесса микроорганизмы редуплицируют свой
геном, а образовавшиеся дочерние геномы далее переходят в дочерние клетки.
Высокая точность, с которой бактерии осуществляют такие процессы,
указывает на наличие специальных механизмов их координации и контроля.
Структура области начала репликации oriC. Хромосома E. coli
содержит единственную область начала репликации (origin), названную oriC,
на которой происходит инициация репликации (рис. I.47, а). Размер
минимальной области начала репликации, обеспечивающей автономную
репликацию хромосомы, составляет 258 п.о. (положение 11–268 на рис. I.47).
Сравнение первичных структур областей начала репликации различных
энтеробактерий показало, что их последовательности представлены короткими
консервативными участками, которые перемежаются дивергировавшими
сегментами ДНК, длины которых, однако, высококонсервативны.
Консервативные участки оказались сайтами связывания регуляторных белков,
разделенных спейсерными последовательностями. OriC содержит пять
консенсусных 9-нуклеотидных сайтов связывания инициатора DnaA
(непалиндромные повторы), названных DnaA-боксами. У всех энтеробактерий
области начала репликации содержат 9–14 сайтов GATC, положение восьми из
которых консервативно.
В левой части oriC находится AT-богатая область, содержащая три
похожих последовательности длиной в 13 нуклеотидов, каждая из которых
начинается с GATC. Здесь же локализован AT-кластер, который вместе с левой
13-нуклеотидной последовательностью образует область нестабильной
спирали ДНК (ДНК-расплетающий элемент). Этот участок ДНК может быть
заменен без потери функции на аналогичный по нуклеотидному составу, но с
другой последовательностью нуклеотидов.
OriC содержит сайты связывания белков, изгибающих ДНК, IHF
(integration host factor) и FIS (factor for inversion stimulation). Оба белка, по-
видимому, помогают __________инициатору DnaA раскручивать ДНК.
Димерный белок IciA, состоящий из субъединиц с молекулярной массой
33 кДа, специфически связывается с AT-богатыми 13-мерными повторами.
Функция этого белка неизвестна, так же как и функция белка Rob, который
специфически взаимодействует с 26-нуклеотидным сайтом в правой части
DnaA-бокса R4. ДНК вблизи Rob-сайта обнаруживает изгиб, который более ярко
выражен у молекул, полностью метилированных Dam-метилтрансферазой (см.
ниже). С такими полностью метилированными ДНК взаимодействует
гистоноподобный белок H-NS, сайт связывания которого перекрывается с Rob-
сайтом. Это взаимодействие оказывает влияние на функционирование oriC.
Рис. I.47. Структура области начала репликации хромосомы E. coli (а)
и схема инициации ее репликации (б)
HobH – белок, взаимодействующий с метилированной по одной цепи ДНК
области начала репликации (hemimethylated origin binding)
Функции белка DnaA. Белок DnaA играет ключевую роль в сборке
реплисомы – многокомпонентного белкового комплекса, осуществляющего
двунаправленный синтез ДНК. Белок распознает область начала репликации и
привлекает к месту сборки остальные белковые компоненты реплисомы.
Этапы инициации синтеза ДНК на oriC. Сборка исходного комплекса
начинается с взаимодействия белка DnaA с DnaA-боксами R1–R4 и M (см.
рис. I.47, б). Для успешного прохождения последующих этапов сборки
реплисомы белок DnaA должен находиться в комплексе с ATP и
взаимодействовать с сверхспирализованным oriC. С помощью электронного
микроскопа исходный комплекс обнаруживается в виде компактной
эллипсоидной структуры, содержащей ∼20 мономеров DnaA, которая закрывает
oriC. Исходный комплекс обладает высокоупорядоченной структурой.
В присутствии ATP в высокой концентрации (5 мМ) исходный комплекс
превращается в открытый комплекс. В этом комплексе происходит частичное
расплетение АТ-богатых 13-нуклеотидных повторов, расположенных в левой
части oriC. При 37ｰ или выше единственный белок DnaA может обеспечивать
расплетение ДНК. Для образования открытого комплекса при более низких
температурах требуется участие структурирующего белка HU или
интеграционного фактора бактерии-хозяина IHF. В открытом комплексе
обнаруживают небольшие участки расплетенной ДНК в правой части oriC
между DnaA-боксами R2 и R4, которые рассматривают как места посадки
хеликазы.
Белок DnaB является хеликазой репликативной вилки и входит в
открытый комплекс с образованием препраймирующего комплекса I,
взаимодействуя с одноцепочечными участками частично расплетенной ДНК.
Такие участки подготавливаются белком DnaA, который вытесняет SSB-белок с
соответствующих сайтов. DnaB входит в препраймирующий комплекс I в виде
гексамеров, образовавших комплекс с шестью мономерами DnaC, каждый из
которых связывает одну молекулу ATP. В этом комплексе хеликазная
активность белка DnaB блокирована. Освобождение DnaC из комплекса
происходит в результате гидролиза ATP. Следствием этого является активация
хеликазы DnaB и ее правильное расположение в комплексе. Совокупность этих
событий превращает препраймирующий комплекс I в препраймирующий
комплекс II.
Хеликаза должна начать функционировать в месте старта репликативной
вилки в правой части oriC вблизи DnaA-боксов R2, R3 и R4. Для этого она
должна быть транслоцирована от места ее первоначального вхождения в
комплекс к точке начала репликации. Предполагается, что транслокация
ассоциирована с ATP-зависимым освобождением из комплекса белка DnaC, что
сопровождается активацией хеликазы.
В праймирующем комплексе хеликаза DnaB взаимодействует с DnaG-
праймазой, которая играет ключевую роль в обеспечении инициации
репликации именно на oriC. Оба этих фермента обеспечивают сопряжение
Дата добавления: 2015-08-29; просмотров: 17 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |