олигонуклеотидами, содержащими чувствительные к облучению светом
защитные химические группы. На каждом этапе синтеза маску, которая на
схеме обозначена серыми прямоугольниками, помещают над большей частью
микроматрицы, а остающиеся открытыми химические группы активируют
светом. Затем происходит соединение 5’-гидроксильных групп
фосфорамидитных производных добавляемого нуклеотида с активированным
сегментом микроматрицы.
Защищая поверхность микроматрицы от света дискретными участками в
различных простых комбинациях, удается синтезировать, как это показано на
схеме (рис. II.38), за 4ｷ3 = 12 отдельных этапов все теоретически возможные
последовательности тринуклеотидов в количестве 34 = 81. В общем случае для
синтеза всех возможных последовательностей длиной в N нуклеотидов
требуется 4N синтетических стадии. Длина цепи олигонуклеотида, который
может быть синтезирован на микроматрице, лимитируется выходом готового
продукта на каждой стадии, который составляет ∼95%. Так, суммарный выход
25-звенного олигонуклеотида будет составлять всего ∼(0,95)25 = 28%. В этой
связи рассмотренный метод обычно используют для синтеза олигонуклеотидов,
длина которых не превышает 20–25 оснований.
При альтернативном подходе микроматрицы олигонуклеотидов
синтезируют на подложке с использованием технологии струйных принтеров. В
этом случае головка принтера движется вдоль подложки и, в соответствии с
заложенной программой, наносит на необходимые участки небольшие
количества раствора с фосфорамидитными производными нуклеотидов из
индивидуальных резервуаров. Этапы снятия защитных групп и промывания
789
производятся так же, как и при обычном твердофазном синтезе
олигонуклеотидов. Эффективность каждого этапа синтеза в этом случае может
превышать 99%, что позволяет синтезировать олигонуклеотиды длиной до 40
оснований с суммарным выходом ∼67% (40 этапов с выходом 99% на этап).
Еще одной разновидностью методов создания микроматриц является
синтез индивидуальных олигонуклеотидов, их очистка и нанесение с помощью
микроробота на поверхность подложки с адгезивным покрытием. Однако
создание этим способом микроматриц, содержащих тысячи индивидуальных
элементов, – очень трудоемкий процесс.
При конструировании микроматриц, элементы которых содержат
индивидуальные кДНК, для нанесения на подложку микропятен чаще всего
используют микророботы. В этом случае применяют растворы рекомбинантных
кДНК длиной 0,5–1,0 т.п.о., очищенных из бактериальных клеток, которые перед
применением как правило, амплифицируют с помощью ПЦР. Поверхность
стеклянной подложки покрывают тонким слоем полилизина или обрабатывают
аминосиланом с целью создания на ней положительного заряда, что
обеспечивает возможность электростатического взаимодействия подложки с
отрицательно заряженными молекулами кДНК. Недостатком этого способа
является неспецифичность электростатических взаимодействий, в которые
вовлечены многие участки кДНК, что уменьшает эффективность
взаимодействия кДНК с последовательностями анализируемых образцов. Для
преодоления этих затруднений с помощью асимметричной ПЦР синтезируют
производные кДНК, которые далее ковалентно соединяют с сиалированным
стеклом с помощью боргидрида.
Разрабатываются и альтернативные конфигурации микроматриц, в
которых на поверхности стекла фиксируют сами фрагменты ДНК,
анализируемой с помощью олигонуклеотидных зондов. Такой подход был
использован, в частности для поиска мутаций в гене белка p53. Дальнейшим
расширением этого подхода является нанесение на поверхность стекла
кусочков тканей с последующим анализом содержащихся в них ДНК или РНК
гибридизацией in situ.
790
11.3.2. Ограничения в использовании микроматриц ДНК
Помимо самой достаточно сложной технологии производства
микроматриц, к числу факторов, ограничивающих их широкое применение,
относятся кинетические параметры гибридизации, а также точность и
чувствительность обнаружения в гибридах ошибочно спаренных нуклеотидов.
Кинетика гибридизации. Гибридизация в гетерогенных смесях
нуклеиновых кислот происходит медленно. При использовании
олигонуклеотидов в качестве зондов для ее завершения обычно требуется
несколько часов, тогда как в случае зондов кДНК процесс продолжается в
течение 6–24 ч при высокой температуре. Поиск зондом своей
иммобилизованной мишени происходит двумя путями. Во-первых, может
произойти прямая гибридизация непосредственно из раствора, эффективность
которой в первом приближении не зависит от размера зонда. Во-вторых, зонд
вначале может неспецифически связаться с поверхностью подложки,
диссоциировать из комплекса и, диффундируя вдоль поверхности, достичь
мишени. Скорость гибридизации по второму механизму резко возрастает, когда
длина зонда становится меньше 1000 нуклеотидов. С учетом этого время,
необходимое для гибридизации, может быть уменьшено путем укорачивания
молекулы зонда, повышения его концентрации в гибридизационных смесях и
сокращения расстояния, которое необходимо преодолеть зонду до мишени
путем диффузии.
Поскольку концентрация зондов в гибридизационных смесях ограничена
их химическими свойствами, основным фактором, с помощью которого можно
уменьшать время гибридизации и объем наносимого образца с зондом,
становится плотность расположения пятен ДНК-мишеней (элементов) в
микроматрицах. Размеры индивидуальных элементов микроматриц,
получаемых современными фотолитографическими методами, лежат в
пределах 5–10 мкм при общей их максимальной плотности на подложке
∼106/см2. Плотность элементов в обычно используемых микрочипах,
полученных с помощью фотолитографии, составляет 104–105/см2. При
использовании микророботов для нанесения кДНК на поверхность подложки
плотность расположения элементов достигает лишь ∼103/см2. И в том, и в
другом случае зондам для гибридизации необходимо диффундировать к
791
мишени, находящейся в индивидуальном элементе микроматрицы, общие
размеры которой как правило составляют 1 х 1 см. Поскольку время диффузии
зонда пропорционально квадрату расстояния до мишени, общее время
гибридизации можно понизить путем увеличения плотности расположения
элементов на микрочипе. Кроме того, одним из подходов к уменьшению
времени гибридизации является придание молекулам зондов направленности
перемещения к мишеням в электрическом поле, когда микроматрицу
располагают на электроде.
Чувствительность метода. Чувствительность метода специфического
обнаружения последовательностей ДНК с использованием технологии
микроматриц определяется отношением количества зонда, связавшегося со
специфической мишенью, к количеству неспецифически связавшегося зонда.
Чем выше это отношение, тем больше чувствительность метода.
Неспецифическое связывание зонда может происходить как с самой
подложкой, так и с гомологичными зонду последовательностями нуклеотидов
ДНК-мишени с образованием неправильно спаренных оснований. В последнем
случае могут быть получены ложноположительные результаты. Поскольку
площадь пятна специфической мишени значительно меньше доступной зонду
поверхности микрочипа, при малых временах гибридизации количество
неспецифически сорбированного зонда будет значительно превышать
количество зонда, находящегося в правильных гибридах. Эту ситуацию
улучшают путем увеличения времени гибридизации до достижения процессом
стационарной фазы. В этой связи интерпретация картин гибридизации требует
постановки адекватных контролей для оценки эффективности
неспецифического связывания зонда поверхностью микрочипа. Кроме того, для
количественной оценки гибридизации необходимо использовать количества
зонда, не насыщающие мишени микрочипа во время отжига.
Эффективность детекции флуоресценции как таковой является одним из
самых сильных факторов, сдерживающих развитие технологии микрочипов
ДНК. По мере уменьшения размеров элементов микроматриц все меньшее
количество молекул ДНК-мишени становится доступным зонду. Современные
методы позволяют обнаруживать ДНК-мишени в аттомолярных концентрациях
(10-18 М) при плотности в одну молекулу ДНК на 1 мкм2. Для этой цели чаще
всего используются системы, основанные на конфокальной сканирующей
792
лазерной микроскопии. При определении альтернативных состояний
гомологичных последовательностей ДНК-мишеней, в частности, аллельного
(нормального или мутантного) состояния конкретного гена, применяют
двухцветные системы. В таких системах один из зондов, например
специфичный в отношении аллеля дикого типа, метят флуоресцентным
красителем одного цвета (красным), а другой (мутантный) – флуорофором
другого цвета (зеленым). Зонды одновременно гибридизуют с анализируемым
микрочипом, который далее сканируется при обеих длинах волн, что позволяет
обнаруживать тот или иной зонд, сохранившийся в гибриде, и на этом
основании делать вывод об аллельном состоянии гена.
11.3.3. Использование микроматриц ДНК в фундаментальных и
прикладных исследованиях
Определение первичной структуры и картирование ДНК являются
основными направлениями использования микроматриц олигонуклеотидов в
настоящее время. Прямое секвенирование генов с помощью
олигонуклеотидных микрочипов сдерживается необходимостью применения
мягких условий гибридизации, при которых происходит внутреннее спаривание
нуклеотидов как в зондах, так и в анализируемых частях генов, что часто
является причиной неправильной интерпретации получаемых данных. Тем не
менее, на основании результатов гибридизации продуктов ПЦР-амплификации
частей клонов геномных библиотек с микроматрицами олигонуклеотидов
удается осуществлять достаточно эффективное упорядочивание клонов друг
относительно друга. Продемонстрирована возможность осуществления
биохимических манипуляций с ДНК, иммобилизованных на микрочипах, с
использованием ДНК-полимераз и эндонуклеаз рестрикции. Такие воздействия
применяют параллельно с гибридизацией для получения дополнительной
информации об анализируемых ДНК.
Исследование генетического полиморфизма ДНК. Более
информативными оказываются результаты использования микроматриц ДНК
для оценки генетического полиморфизма родственных геномов. Способность
зондов гибридизоваться с ДНК микроматриц сильно изменяется при наличии
даже единственного неспаренного нуклеотида в гибридах зонд–мишень. Это
позволяет с высокой эффективностью осуществлять поиск полиморфизмов в
793
сравниваемых геномах даже на уровне различий в отдельных нуклеотидах.
Например, путем гибридизации геномной ДНК двух штаммов дрожжей с
микроматрицами олигонуклеотидов удалось картировать на участке ДНК
длиной в 57 т.п.о. полиморфные локусы, детерминирующие множественную
лекарственную устойчивость. Детальное сравнение экзона 11 гена BRCA1
человека с гомологичными последовательностями семи других биологических
видов позволило обнаружить отдельные полиморфные нуклеотиды с
замечательной точностью (99,5–99,9%).
Такого рода результаты дали возможность разработки на основе
микроматриц ДНК нескольких ДНК-диагностикумов, с помощью которых
обнаруживают полиморфизмы на уровне отдельных нуклеотидов в геноме
вирусов, бактерий, дрожжей и высших эукариот. С применением этого подхода
были идентифицированы мутации в геноме человека, ассоциированные с
различными заболеваниями, включая рак молочной железы, муковисцидоз, β-
талассемию, а также диагностирована ВИЧ-инфекция. В недавно проведенном
исследовании участка генома человека длиной в 2,3ｷ106 п.о. было обнаружено
∼2000 полиморфизмов на уровне отдельных нуклеотидов, что позволяет
представить себе масштабы генетической изменчивости в популяциях
человека.
Исследование экспрессии генов с использованием микроматриц
ДНК. Технология микрочипов ДНК позволяет осуществлять одновременный
мониторинг за экспрессией большого числа генов (expression profiling). С этой
целью для генов с известными последовательностями нуклеотидов создается
микроматрица сегментов кДНК длиной 0,5–1,0 т.п.о. Из анализируемых
образцов (например опухоли и здоровой ткани) выделяют суммарную мРНК,
которую с помощью обратной транскрипции превращают в кДНК, метят
флуоресцентными красителями и используют для последующей конкурентной
гибридизации с зондами, нанесенными на микроматрицу. Интенсивность
флуоресценции отдельных элементов микроматрицы после образования
гибридов позволяют качественно характеризовать различия в уровнях
экспрессии конкретных генов в анализируемых образцах. Например, отсутствие
конкуренции за образование гибридов со стороны кДНК нормальной ткани
может говорить о транскрипции в опухоли новых генов, не экспрессирующихся
в нормальных клетках.
794
Такой подход успешно использовали для характеристики ответа клеток в
культуре или in vivo по изменению уровней экспрессии генов на различные
внешние стимулы, включая тепловой шок, воспалительные реакции и
канцерогенные воздействия. Помимо известных генов в мониторинг иногда
включают и случайные клоны кДНК, что позволяет идентифицировать новые
гены, экспрессия которых ассоциирована с патологическими состояниями
органов и тканей. С использованием микроматриц кДНК в современный анализ
могут быть одновременно включены до 10000 экспрессирующихся генов.
Микроматрицы олигонуклеотидов также применяют для определения
профилей экспрессии генов. В этом случае для повышения эффективности
мониторинга одновременно в разных элементах матрицы используют несколько
олигонуклеотидов, комплементарных __________различным частям анализируемых кДНК.
С помощью этого подхода недавно был определен профиль экспрессии 6800
генов в культивируемых клетках фибросаркомы в присутствии γ-интерферона.
Функциональная геномика. Эффективное использование результатов
мониторинга за экспрессией большого числа генов требует лучшего понимания
функций анализируемых генов. Решением проблемы определения функций
новых генов занимается раздел генетики, получивший название
функциональной геномики. Лишь немногие заболевания возникают в
результате повреждения отдельных конкретных генов. В большинстве случаев
приходится говорить о предрасположенности к заболеванию в связи с
наличием в геноме конкретной мутации. Сопоставление генетической
информации, получаемой при использовании микроматриц ДНК, с
результатами статистического анализа возникновения, протекания и исхода
заболеваний может дать ключ к правильной интерпретации результатов
генетического скрининга генома человека обсуждаемыми методами.
Возможность одновременного наблюдения за изменением экспрессии очень
большого числа генов в строго контролируемых условиях открывает новые
перспективы функционального исследования генома как единого целого.
В заключение можно сказать, что микроматрицы ДНК уже сегодня
находят применение в фундаментальных исследованиях, промышленности и
клинике в качестве инструментов анализа экспрессии большого числа генов,
определения генетической предрасположенности организма к различным
патологическим состояниям, скрининга новых фармакологических препаратов.
795
Критическими моментами, препятствующими широкому распространению этих
технологий, являются ограниченные чувствительность обнаружения
гибридизационных сигналов и специфичность гибридизации, трудности в
количественной оценке сигналов и обработке большого количества получаемых
данных с целью их интерпретации, а также высокая стоимость микрочипов ДНК.
Однако микроматрицы ДНК даже в современном виде успешно используются и
будут применяться для решения многих задач биологии и медицины.
796
ГЛАВА 12. КАРТИРОВАНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ
СТРУКТУРЫ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА
После краткого рассмотрения основных методов, наиболее часто
используемых в молекулярной генетике для исследования структуры и
механизмов функционирования генов, представляется целесообразным на
примере генома человека подробнее познакомиться с практическим
применением этих методов и их модификаций для изучения больших геномов.
В целях всестороннего исследования генома человека, этого колоссального по
объему хранилища его генетической информации, недавно была разработана и
воплощается в жизнь специальная международная программа "Геном
человека" ("Human Genome Project"). Основной задачей программы является
построение исчерпывающих генетических карт большого разрешения каждой из
24 хромосом человека, которое, в конечном счете, должно завершиться
определением полной первичной структуры ДНК этих хромосом. В настоящее
время работы по проекту идут полным ходом. В случае успешного его
завершения (а это по планам должно произойти в 2003 г.) у человечества
появятся перспективы досконального изучения функциональной значимости и
механизмов функционирования каждого из его генов, а также генетических
механизмов, управляющих биологией человека, и установления причин
большинства патологических состояний его организма.
12.1. Основные подходы к картированию генома человека
Решение основной задачи программы "Геном человека" включает три
основных этапа. На первом этапе необходимо специфическим образом
разделить каждую индивидуальную хромосому на части меньшего размера,
позволяющего их дальнейший анализ известными методами. Вторая стадия
исследований предполагает определение взаимного расположения этих
индивидуальных фрагментов ДНК друг относительно друга и их локализации в
самих хромосомах. На завершающем этапе необходимо произвести собственно
определение первичной структуры ДНК каждого из охарактеризованных
фрагментов хромосом и составить полную непрерывную последовательность
их нуклеотидов. Решение задачи не будет полным, если в найденных
797
последовательностях нуклеотидов не удастся локализовать все гены организма
и определить их функциональное значение. Прохождение трех
вышеперечисленных этапов требуется не только для получения
исчерпывающих характеристик генома человека, но и любого другого генома
большого размера.
12.1.1. Генетические карты сцепления
Генетические карты сцепления представляют собой одномерные схемы
взаимного расположения генетических маркеров на индивидуальных
хромосомах. Под генетическими маркерами понимают любые наследуемые
фенотипические признаки, различающиеся у отдельных особей.
Фенотипические признаки, отвечающие требованиям генетических маркеров,
весьма разнообразны. Они включают в себя как особенности поведения или
предрасположенность к определенным заболеваниям, так и морфологические
признаки целых организмов или их макромолекул, различающихся по
структуре. С развитием простых и эффективных методов исследования
биологических макромолекул такие признаки, известные под названием
молекулярных маркеров, стали наиболее часто использоваться при построении
генетических карт сцепления. Прежде чем перейти к рассмотрению методов
построения таких карт и их значения для исследования генома, необходимо
напомнить, что термин "сцепление" употребляется в генетике для обозначения
вероятности совместной передачи двух признаков от одного из родителей
потомству.
При образовании половых клеток (гамет) у животных и растений на
стадии мейоза, как правило, происходит синапсис (конъюгация) гомологичных
хромосом. Сестринские хроматиды гомологичных хромосом соединяются по
всей длине друг с другом, и в результате кроссинговера (генетической
рекомбинации между хроматидами) происходит обмен их частями. Чем дальше
два генетических маркера располагаются друг от друга на хроматиде, тем
больше вероятность того, что разрыв хроматиды, необходимый для
кроссинговера, произойдет между ними, и два маркера в новой хромосоме,
принадлежащей новой гамете, окажутся отделенными друг от друга, т.е. их
сцепление нарушится. Единицей сцепления генетических маркеров является
морганида (единица Моргана, М), которая содержит 100 сантиморганид (сМ). 1
798
сМ соответствует физическому расстоянию на генетической карте между двумя
маркерами, рекомбинация между которыми происходит с частотой 1%.
Выраженная в парах оснований 1 сМ соответствует ∼1 млн п.о. (м.п.о.) ДНК.
Генетические карты сцепления правильно отражают порядок
расположения генетических маркеров на хромосомах, однако полученные при
этом значения расстояний между ними не соответствуют реальным физическим
расстояниям. Обычно данный факт связывают с тем, что эффективность
рекомбинации между хроматидами на отдельных участках хромосом может
сильно различаться. В частности, она подавлена в гетерохроматиновых
участках хромосом. С другой стороны, в хромосомах часто встречаются
"горячие точки" рекомбинации. Использование частот рекомбинации для
построения физических генетических карт без учета этих факторов будет
приводить к искажениям (соответственно занижению или завышению) реальных
расстояний между генетическими маркерами. Таким образом, генетические
карты сцепления являются наименее точными из всех имеющихся типов
генетических карт, и их можно рассматривать только в качестве первого
приближения к реальным физическим картам. Тем не менее, на практике
именно они и только они позволяют локализовать сложные генетические
маркеры (например ассоциированные с симптомами заболевания) на первых
этапах исследования и дают возможность их дальнейшего изучения.
Необходимо помнить, что в отсутствие кроссинговера все гены, находящиеся
на индивидуальной хромосоме, передавались бы от родителей потомству
вместе, поскольку они физически сцеплены друг с другом. Поэтому
индивидуальные хромосомы образуют группы сцепления генов, и одной из
первых задач построения генетических карт сцепления является отнесение
исследуемого гена или последовательности нуклеотидов к конкретной группе
сцепления. В табл. II.4 перечислены современные методы, которые, по данным
В.А. МакКьюзика, наиболее часто использовались для построения генетических
карт сцепления до конца 1990 г.
799
Таблица II.4
Современные методы построения генетических карт
сцепления
Метод
Число
картированных
локусов
Гибридизация соматических клеток 1148
Гибридизация in situ 687
Семейный генетический анализ сцепления 466
Определение эффекта дозы 159
Рестрикционное картирование 176
Использование хромосомных аберраций 123
Использование синтении 110
Сегрегация генов, индуцированная
облучением
18
Другие методы 143
Всего 3030
800
Гибридизация соматических клеток. Одним из наиболее популярных
методов отнесения генетического маркера (функционально активного гена) к
конкретной группе сцепления является гибридизация (слияние друг с другом)
соматических клеток разных биологических видов организмов, один из которых
– исследуемый. У межвидовых гибридов соматических клеток в процессе
культивирования происходит утрата хромосом преимущественно одного из
биологических видов. Потеря хромосом носит, как правило, случайный
характер, и образующиеся клоны клеток содержат оставшиеся хромосомы в
разных сочетаниях. Анализ клонов, содержащих разные наборы хромосом
исследуемого вида, позволяет определить, с какой из этих оставшихся
хромосом ассоциирована экспрессия исследуемого маркера, и, следовательно,
локализовать ген на конкретной хромосоме.
Гибридизация in situ. Метод гибридизации in situ также широко
используется для картирования последовательностей нуклеотидов на
хромосомах. С этой целью препараты фиксированных хромосом гибридизуют
(инкубируют при повышенной температуре с последующим охлаждением) с
исследуемыми последовательностями нуклеотидов, меченными
радиоактивной, флуоресцентной или иной меткой. После отмывания
несвязавшейся метки оставшиеся меченые молекулы нуклеиновых кислот
оказываются ассоциированными с участками хромосом, содержащими
последовательности, комплементарные исследуемым меченым
последовательностям нуклеотидов. Полученные гибриды анализируют с
помощью микроскопа либо непосредственно, либо после авторадиографии.
Для этой группы методов характерна более высокая разрешающая
способность, чем для гибридизации соматических клеток, поскольку они
позволяют локализовать изучаемые последовательности нуклеотидов на
хромосомах. По мере выполнения программы "Геном человека" в руках
исследователей появляется все больше изолированных последовательностей
нуклеотидов, которые можно использовать в качестве зондов для гибридизации
in situ. В связи с этим данные методы по частоте использования в последнее
время прочно выходят на первое место. Наиболее популярной оказывается
группа методов, получивших название флуоресцентной гибридизации in situ
(fluorescence in situ hybridization – FISH), при проведении которой используются
полинуклеотидные зонды, содержащие флуоресцентную метку. В частности, в
801
1996 г. было опубликовано >600 работ, в которых описано использование этого
Дата добавления: 2015-08-29; просмотров: 40 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |