радикалами кислорода, удавалось обнаруживать в ДНК одну такую молекулу
среди 104 обычных остатков дезоксигуанозина. Аналогичные аптамеры могут
быть потенциально использованы для мониторинга мутагенных последствий
окислительного стресса в эукариотических клетках.
Перспективы использования аптамеров. Новейшие результаты,
полученные с использованием аптамеров, указывают на возможность их
применения в ближайшем будущем в биотехнологии для регулируемой
экспрессии генов, а также для диагностики и терапии. Одним из наиболее
интересных достижений в этой области исследований является создание
рибозимов с аллостерическими свойствами. В таких конструкциях
каталитический домен рибозима соединяют с последовательностями
аптамеров-рецепторов, взаимодействующих с регуляторными молекулами. В
присутствии низкомолекулярных регуляторов может происходить
специфическая активация или ингибирование ферментативной активности
рибозима. Такие гибридные конструкции получили название аптазимов.
Недавно полученный аптазим, обладающий РНК-лигазной активностью,
активировался в 105 раз в присутствии специфических низкомолекулярных
эффекторов. При аналогичном подходе были сконструированы ATP-зависимые
рибозимы.
Исключительно важные результаты могут быть получены при скрининге
in vitro аптамеров среди пула фрагментов природных РНК. В этом случае
библиотеки природных последовательностей могут быть использованы для
поиска доменов нуклеиновых кислот, специфически взаимодействующих с
известными молекулами биогенного происхождения, например белками
ретровирусов, для которых неизвестны РНК-мишени клетки-хозяина. Не
исключено, что в ходе такого рода исследований у РНК или их фрагментов
будут обнаружены новые внутриклеточные функции, связанные с
метаболизмом важных биологических кофакторов, включая ATP, GTP, FAD и
NAD+.
9.4. Молекулы РНК у истоков жизни
Большинство современных теорий происхождения жизни рассматривает
молекулы РНК, обладающие активностями рибозимов, в качестве первичных
самореплицирующихся молекул, давших начало развитию жизни на Земле.
Результаты исследования двух гипотетических групп рибозимов лежат в основе
современных представлений о происхождении жизни. Прежде всего, это РНК-
репликазы, построенные исключительно из рибонуклеотидов, т.е. молекулы
РНК, способные самореплицироваться. Такое предположение кажется
особенно привлекательным, поскольку древние молекулы РНК, с одной
стороны, могли бы хранить генетическую информацию, а с другой – обладать
ферментативной активностью, необходимой для воспроизведения этой
информации. Подобное сочетание свойств в молекуле РНК позволяет
объяснить, каким образом каталитические функции, выполняемые
современными белковыми молекулами, а также функции хранения и передачи
генетической информации возникли одновременно и могли присутствовать в
одной молекуле-предшественнике прародителей современных клеток. При
переходе от первоначального мира самореплицирующихся молекул РНК к
современному живому миру, повсеместно использующему белковый катализ,
предполагают возникновение молекул рибозимов, способных осуществлять
синтез белка из абиотически возникших его предшественников – аминокислот.
Теории происхождения жизни, основанные на первоначальном участии
молекул РНК в создании самореплицирующихся и самоусложняющихся систем,
нашли прочную поддержку в связи с открытием аутосплайсинга и рибозимов.
Как будет видно из дальнейшего изложения, механизм аутосплайсинга не
сильно отличается от комплекса химических реакций, необходимых для
репликации нуклеиновых кислот. Кроме того, в настоящее время все больше
утверждается точка зрения, в соответствии с которой именно современные
рибосомные РНК составляют каталитическую сердцевину рибосомы и могут
быть потомками рибозимов, самостоятельно осуществлявших синтез
полипептидов. В этой связи представляют интерес некоторые гипотетические
схемы молекулярных механизмов экспрессии предшественников современных
генов.
9.4.1. Молекулы РНК в качестве РНК-репликаз
Для первоначального появления рибозимов необходим абиотический
синтез олигорибонуклеотидов длиной 30–70 оснований. Долгое время это
требование было камнем преткновения в разработке теории происхождения
жизни, основанной на РНК. Недавно было показано, что после спонтанной
иммобилизации на твердой поверхности коротких олигонуклеотидов в
присутствии свежих порций активированных мономеров их длина может
самопроизвольно удлиняться до 55 остатков. Значительным осложнением для
обоснования теории было также то, что мономеры в спонтанно образующихся
олигонуклеотидах соединены друг с другом смешанными 2’–5’- и 3’–5’-связями.
Такая гетерогенность олигонуклеотидов должна затруднять их последующую
матричную активность. Оказалось, однако, что олигоцитидилаты, содержащие
смешанные связи, могут служить матрицами для спонтанной полимеризации
мономеров, активированных имидазолом, с образованием олигогуанилатов.
Таким образом, вышеупомянутые возражения в настоящее время едва ли
существенны для обсуждаемой теории.
Для того чтобы репликация РНК самими молекулами РНК имела место,
необходимо одновременное присутствие в одном микрообъеме, по крайней
мере, двух молекул рибозима-репликазы или же репликазы и комплементарной
ей цепи РНК, которая служила бы матрицей для репликазы. В таком случае
цикл воспроизводства молекулы репликазы можно представить следующим
образом. После разделения цепей синтезированной репликазы и матрицы с
последней соединяется олигонуклеотидный праймер, который
последовательно удлиняется рибозимом-репликазой, образовавшейся в
результате фолдинга второй цепи. Предполагается, что неорганические
поверхности, обладающие большим сродством к одноцепочечным РНК,
способствуют __________разделению цепей после завершения акта репликации. При этом
должна существовать определенная компартментализация таких молекул
(например обеспечиваемая силами адсорбции), препятствующая слишком
далекому расхождению разделившихся цепей РНК. И, наконец, синтез РНК,
осуществляемый древней репликазой, должен характеризоваться
определенным уровнем точности.
Выше уже были рассмотрены механизмы реакций аутосплайсинга и
транс- сплайсинга, осуществляемые рибозимами интронов группы I
Tetrahymena. В основе этих процессов лежит основанная на переэтерификации
аутокаталитическая реакция объединения (лигирования) двух
полирибонуклеотидных последовательностей (экзонов), сопровождающаяся
удлинением акцепторной последовательности, которое можно рассматривать
как прототип реакции полимеризации. В настоящее время экспериментально
подтверждена возможность участия в таких реакциях более коротких
олигонуклеотидов. В частности, благодаря этим реакциям пентамеры
цитидиловой кислоты (С5) превращались в гетерогенную популяцию олиго(С),
содержащую даже 30-членные олигонуклеотиды. Вскоре было показано, что и
динуклеотиды GpC могут выступать в качестве доноров мононуклеотидов при
элонгации С5 с образованием С10 в реакции удлинения праймера (C5 + 5GpC →
C10 + 5G). Частота ошибок в такой реакции в условиях насыщения GpC-
субстратами составляла ~35% и была слишком большой для того чтобы
обеспечивать саморепликацию молекул РНК.
Альтернативой реакции удлинения праймера на один нуклеотид за цикл
может быть зависимая от матрицы реакция элонгации праймера
олигонуклеотидами, которая также была продемонстрирована
экспериментально. Здесь донорами выступали триплеты
олигорибонуклеотидов и, как уже упоминалось выше, крайним известным
случаем такой реакции является объединение экзонов. При этом рибозимы
Tetrahymena в качестве матриц для сборки олигонуклеотидов могут
использовать различные внутренние последовательности нуклеотидов. Так,
олигонуклеотиды длиной 8–12 остатков недавно были применены для сборки
полной цепи, комплементарной последовательности самого рибозима.
Низкий выход продуктов полной длины в экспериментах, упомянутых
выше, позволял предполагать, что с этой задачей успешнее могли бы
справиться более короткие и активные рибозимы, которые пока еще в природе
неизвестны. В связи с этим была разработана система отбора in vitro,
позволившая повысить эффективность реакции лигирования путем получения
более коротких производных известного рибозима sunY. Приблизительно 2⋅1013
вариантов нуклеотидных последовательностей рибозима в виде единого пула
были подвергнуты нескольким циклам все более строгого отбора вариантов
рибозима на повышенную способность к лигированию с последующей
амплификацией последовательностей в конце каждого цикла отбора. Такие
варианты рибозимов с более короткой полинуклеотидной цепью вскоре были
получены. Они обладали способностью эффективно осуществлять из 18
олигонуклеотидов полную сборку цепи РНК, комплементарной своей
собственной полинуклеотидной цепи. Наиболее интересной находкой в ходе
такого рода экспериментов по отбору из пула случайных последовательностей
оказался рибозим длиной в 100 нуклеотидов, получивший название лигазы
класса I. Этот рибозим осуществлял образование 3’–5’-фосфодиэфирных
__________связей, и его эффективность была сопоставима с таковой фермента –
природной ДНК-лигазы (kкат >1 с-1). Недавно было продемонстрировано, что
лигаза класса I может выполнять функции РНК-полимеразы, осуществляя
элонгацию праймера путем использования рибонуклеозидтрифосфатов в
качестве субстратов. Основным ограничением этой реакции является то, что
поскольку комплекс рибозим–матрица удерживается комплементарными
взаимодействиями, элонгация праймера прекращается, как только 3’-конец
образующегося продукта достигает конца матрицы. В реакции не только
используются все четыре рибонуклеозидтрифосфата, но и достигается
большая точность синтеза РНК (92%). Дальнейшее ее повышение хотя бы в 10
раз позволило бы этой искусственной РНК-полимеразе воспроизводить свою
собственную последовательность нуклеотидов. Полагают, что полное
превращение рибозима в РНК-полимеразу произойдет после того, как матрица
будет связываться с ним некомплементарными взаимодействиями.
Условия отбора, использованные для получения эволюционирующих in
vitro молекул лигазы класса I, были отработаны на современных субстратах
(рибонуклеозидтрифосфатах). Не исключено, что изменение этих условий
позволит получить рибозимы с новыми активностями. Недавно был описан
рибозим, осуществляющий реакцию, аналогичную кэпированию акцепторного
олигонуклеотида, которая завершалась присоединением к его 5’-концу
молекулы аденозинмонофосфата посредством 5’–5’-фосфодиэфирной связи.
Полагают, что, используя в качестве субстратов высокоактивированные
рибонуклеозидмонофосфаты, можно будет получить рибозимы,
непосредственно полимеризующие мононуклеотиды.
9.4.2. Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами РНК
Вскоре после открытия рибозимов в литературе стала активно
обсуждаться гипотеза о каталитической (а не только структурной) функции
рРНК в рибосомах. Первые экспериментальные данные в пользу возможной
каталитической функции рРНК были получены с ингибиторами биосинтеза
белка. Оказалось, что устойчивость к некоторым из них вызывается мутациями
в генах рРНК, но не рибосомных белков. Х.Ф. Ноллером и соавторами (1992 г.)
было установлено, что удаление из рибосомы большого числа рибосомных
белков не инактивирует ее пептидилтрансферазную функцию. Подобного рода
данные указывают на то, что именно 23S рРНК является
пептидилтрансферазой, однако окончательный вывод мешают сделать
оставшиеся рибосомные белки, присутствие которых необходимо для
проявления пептидилтрансферазной активности такой ослабленной в
структурном отношении рибосомы.
Функциональная связь между рРНК и интронами группы I недавно
открылась с неожиданной стороны, когда установили, что аминогликозидные
антибиотики, блокирующие биосинтез белка, ингибируют и аутосплайсинг
интронов группы I. Это открытие нашло дальнейшее развитие в связи с
обнаружением у интронов группы I слабой аминоацилэстеразной активности.
Было сделано предположение, что интроны группы I и рибосомная РНК могут
обладать общими структурными (и функциональными) доменами. Кроме того,
мутантные рибозимы, полученные путем отбора in vitro по критерию
ускоренного переноса фосфодиэфирных связей, оказались способными, хотя и
в слабой степени, расщеплять амидные связи. На основании такого рода
данных Ноллер и соавторы сделали предположение о том, что первые
примитивные рибосомы образовались из молекул РНК, родственных интронам
группы I, которые были в состоянии осуществлять перенос ацильных групп,
необходимый для образования пептидных связей. Таким образом, все эти
данные в совокупности позволяли предполагать, что функция рРНК в
биосинтезе белка является каталитической, а некоторые РНК сегодняшнего
дня, имеющие отношение к обсуждаемым процессам – это "молекулярные
ископаемые".
При наличии активированных аминокислот синтез пептидов не
представляется трудной задачей. Активированные аминокислоты
конденсируются даже в водных растворах с образованием коротких пептидов, а
цепи длиной до 50 аминокислот образуются на минеральных поверхностях.
Абстрактная схема биосинтеза белка в примитивных системах с участием
каталитических РНК представлялась следующим образом. Примитивные РНК,
аминоацилирующие сами себя активированными аминокислотами по
аутокаталитическому механизму, могут выступать донорами и акцепторами
аминокислот в реакциях переноса ацильных групп, катализируемых
рибозимами. Для признания РНК в качестве молекул, осуществлявших в
примитивных системах синтез белков, необходимо показать возможность
выполнения ими следующих функций: узнавание аминокислот,
аминоацилирование тРНК, перенос ацильных групп, активация аминокислот и
синтез пептидов. Рассмотрим реальность каждого из этих предположений.
Молекулы РНК могут распознавать аминокислоты. По крайней мере,
у двух природных РНК (как и у обсуждавшихся выше искусственных аптамеров)
обнаружены структурные элементы, способные связывать аминокислоты.
Интроны группы I связывают аргинин в области спирали Р7 (см. рис. I.15, а).
Вторым примером является трансактивируемый район (trans -activating region –
TAR) ВИЧ, который специфически взаимодействует с белком-трансактиватором
tat во время вирусной инфекции. Этот участок ВИЧ-РНК также обладает
способностью взаимодействовать с аргинином. Кроме того, известно, что
редактирующая функция аминоацил-тРНК-синтетаз (разрушение связи между
ошибочно соединенными аминокислотой и тРНК) включает опосредованное
РНК распознавание аминокислот. Предполагается, что в процессе
редактирования имеют место непосредственные контакты РНК с
аминокислотами. Более того, в системах с искусственным отбором РНК из пула
молекул со случайными последовательностями удалось получить четыре
различных аргининсвязывающих структурных элемента (аптамера) с разным
уровнем специфичности. С помощью того же подхода были выделены
акцептирующие цитруллин аптамеры, а также другие молекулы РНК,
взаимодействующие с более гидрофобными аминокислотами – валином и
триптофаном.
Спонтанное аминоацилирование РНК. Процесс аминоацилирования
тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами in vivo происходит в два этапа: вначале
фермент активирует соответствующую аминокислоту с образованием 5’-
аминоациладенилата, который затем атакуется 2’(3’)-концом тРНК, что
сопровождается возникновением соответствующей ковалентной связи между
аминокислотой и тРНК. Нагруженные таким образом молекулы тРНК далее
используются рибосомами в качестве субстратов при образовании пептидных
связей. Недавно тем же методом селекции из пула случайных РНК,
представленного 1,7ｷ1014 молекулами, были получены рибозимы, способные
__________при наличии активированных аминокислот спонтанно аминоацилироваться. Пул
РНК инкубировали при 0о с химически синтезированным фенилаланил-5’-
аденилатом в присутствии ионов Mg2+ и Ca2+. Аминоцилированные РНК
обнаруживали по появлению свободной α-аминогруппы фенилаланина.
Молекулы РНК, меченные такими гидрофобными группами, очищали с
помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в
обращенной фазе. После 11 циклов отбора были получены спонтанно
аминоацилирующиеся РНК со скоростью, в 105 раз превышающей скорость
реакции в контроле. Распознавание аминокислоты рибозимом было слабым,
поскольку образование специфических комплексов рибозима с субстратом
обнаружить не удалось.
Перенос ацильных групп, катализируемый РНК. Повсеместное
использование аминоациладенилатов и аминоацилированных тРНК при
трансляции в природных условиях указывает на возможную роль РНК в ранних
системах трансляции. Действительно, способность рибозимов к спонтанному
аминоацилированию позволяет предполагать и возможность их участия в
следующем этапе биосинтеза белка – переносе аминоацильной группы с
донорной молекулы на свою собственную акцепторную, т.е. в осуществлении
аминоацилтрансферазных реакций. Такая активность была обнаружена среди
1015 молекул РНК случайной структуры, подвергнутых искусственному отбору
на протяжении нескольких циклов. В этой системе отбора в качестве донора
аминоацильной группы был использован гексануклеотидный фрагмент РНК,
содержащий на 2’(3’)-конце активированный остаток N-биотинилированного
метионина. С помощью стрептавидин-агарозы отбирали молекулы РНК,
способные переносить ацильную группу на свою собственную 5’-гидроксильную
группу. Подобные рибозимы, среди которых доминировали однотипные
молекулы, были получены после 11 циклов отбора.
Анализ первичной структуры таких рибозимов обнаружил вблизи 3’-
концов наличие высококонсервативной внутренней матрицы, которая обладала
способностью связывать и приводить в контакт друг с другом 2’(3’)-конец
донорной молекулы и акцепторный 5’-конец своей собственной
полинуклеотидной цепи. Рибозимы оказались не просто матрицей. Они
действительно катализировали перенос ацильных групп, ускоряя этот процесс
в 103 раз (kкат = 9,4ｷ10-2 мин-1) по сравнению с системами, в которых была
задействована только матрица. Интересно, что два неправильно спаренных
основания G–U в месте стыковки дуплексов донор–матрица и акцептор–
матрица оказались необходимыми для функционирования рибозимов,
стимулируя реакцию переноса ацильной группы в 10 раз.
Образование амидных связей, опосредованное рибозимами.
Рибозимы, конструирование которых было описано выше, катализировали
реакцию трансэтерификации карбоксиэфиров. Для проверки возможности
образования этими рибозимами амидных связей их 5’-концевые гидроксильные
группы заменяли на аминогруппы. Оказалось, что такие рибозимы с высокой
эффективностью осуществляют перенос биотинилированного метионина с
2’(3’)-конца гексануклеотида-субстрата на свою собственную 5’-концевую
аминогруппу. Константа скорости первого порядка реакции образования
амидной связи (0,58 мин-1) была лишь в 15 раз ниже таковой (8 мин-1),
осуществляемой природной пептидилтрансферазой рибосом с использованием
фрагмента аминоацилированной тРНК.
РНК-центрический взгляд на происхождение трансляции и самой
жизни. Получение __________аптамеров, способных специфически распознавать
аминокислоты, и рибозимов, аминоацилирующих самих себя, явилось
серьезным аргументом в пользу ключевой роли РНК в происхождении
трансляции. Если предположить, что РНК могут мобилизовать энергию
макроэргических связей ATP, то в скором времени будут обнаружены и
рибозимы, активирующие аминокислоты путем синтеза соответствующих
аминоациладенилатов. Следуя тем же аргументам, можно надеяться на скорое
получение рибозимов, способных синтезировать пептиды. Если все основные
стадии синтеза белка будут осуществляться рибозимами, то, по мнению
А. Хагер и соавторов (1996 г.), можно предположить следующие этапы
эволюционирования системы трансляции. Вначале синтез пептидов
выполняется рибозимами, не обладающими высокой специфичностью по
отношению к своим субстратам – донорам и акцепторам аминоацильных групп.
Некоторые пептиды могли начать синтезироваться после приобретения
рибозимами специфичности в отношении выбора субстратов. Хотя этот
громоздкий механизм для образования каждой пептидной связи в
синтезируемом пептиде требует собственного рибозима, однако он не кажется
абсурдным, так как до сих пор бактерии используют такой принцип для синтеза
некоторых своих пептидов (например молекулы грамицидина) с помощью
специфического набора ферментов. Активность рибозимов могла быть
повышена с помощью коротких РНК, объединяющих субстраты друг с другом.
После эволюционного возникновения таких кофакторных РНК требования к
специфичности рибозимов, синтезирующих пептиды, будут снижаться, и в
конце концов появится истинная пептидилтрансфераза в виде 23S рРНК. Как
известно, рРНК функционирует в тесной связи с матрицей мРНК, которая
специфически сближает донорные и акцепторные аминоацил-тРНК.
Все рассмотренные аргументы подчеркивают важную, если не
исключительную, роль РНК в происхождении жизни на Земле. Большинство
современных ферментов являются белками, а все известные рибозимы
действуют на РНК-субстраты. Уже одно это показывает, что цепь событий,
приведшая к такому повороту развития эволюционных преобразований живых
систем, остается до конца не понятой. Лабораторные методы, позволяющие
моделировать эволюционирование рибозимов in vitro, дают возможность
продолжить экспериментальное исследование глобального вопроса о
происхождении жизни.
ГЛАВА 10. ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ И РАСТЕНИЯ
Методические достижения генной инженерии микроорганизмов,
разрушившие межвидовые барьеры в передаче генов, подготовили
благоприятную почву для введения рекомбинантных ДНК в многоклеточные
организмы. Действительно, идея введения чужеродных генов в геном
многоклеточного организма ничем существенно не отличается от блестяще
реализованных идей генетической трансформации бактериальных клеток
гетерологичными последовательностями нуклеиновых кислот. Поэтому
неудивительно, что с развитием генной инженерии появление трансгенных
животных и растений не заставило себя долго ждать.
10.1. Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
Многоклеточный организм высших животных и растений является
продуктом онтогенетического развития, при котором из одной клетки (зиготы),
образовавшейся в результате слияния двух половых клеток родителей (гамет),
путем большого числа дроблений образуется вся совокупность
высокодифференцированных клеток органов и тканей организма. Поскольку
любая соматическая клетка или клетка зародышевого пути, в конечном счете,
берет свое начало от двух объединившихся родительских клеток, она, как
правило, заключает в себе всю (или большую часть) генетическую информацию
родительских организмов. Несмотря на то что эта схема является упрощенной
и по мере развития дифференцированного состояния соматических клеток их
генетический материал часто претерпевает необратимые перестройки
(например эритроциты человека вообще лишены ядер), такая картина
подчеркивает преемственность генетического материала в рядах клеточных
поколений соматических клеток организмов.
Почти все гены зигот имеют хорошие шансы быть представленными в
большинстве соматических клеток организма и принять участие в
формировании их генотипа и фенотипа. Предпосылки такого рода привели к
мысли о возможности изменения фенотипа многоклеточных организмов путем
введения новых рекомбинантных генов в геном зигот, еще не претерпевших
дробления в раннем эмбриональном развитии. В случае объединения с
геномом зиготы новые гены должны распространиться в ряду клеточных
поколений соматических клеток и экспрессироваться в большинстве этих
клеток. Поскольку, с известными ограничениями, весь многоклеточный
организм можно рассматривать как клон соматических клеток, произошедших
от единственной клетки, распространение рекомбинантных генов, введенных в
зиготу, в соматических клетках организма допустимо рассматривать как
разновидность молекулярного клонирования последовательностей ДНК.
Такой молекулярно-генетический подход к изменению генотипа и
фенотипа многоклеточных организмов был реализован экспериментально в
середине 1970-х годов. Заражение мышиных эмбрионов на
предимплантационной стадии развития вирусом лейкоза мышей (MuLV)
приводило к образованию взрослых особей, содержащих вирусную ДНК,
интегрированную в геном как соматических клеток, так и клеток зародышевого
пути, и эта ДНК передавалась из поколения в поколение. Гены, искусственно
введенные в геном многоклеточных организмов и передающиеся от родителей
потомству, получили название трансгенов, процесс такого введения и
передачи генов обозначили трансгенозом, а животные или растения,
содержащие трансгены в геноме своих клеток, стали называть трансгенными.
Развитие техники создания трансгенных животных и растений привело к
возникновению нового быстро развивающегося направления молекулярной
генетики. Были получены уникальные знания об особенностях экспрессии генов
и биосинтезе белков в онтогенезе многоклеточных организмов, а также о
возможности изменения фенотипа трансгенных организмов, в том числе и
коррекции мутантного фенотипа, и использования трансгенных организмов для
решения задач биотехнологии, связанных с биосинтезом рекомбинантных
белков.
Для получения трансгенных животных в настоящее время применяют три
основных метода. Во всех методах рекомбинантные гены в составе векторных
молекул вводятся в клетки эмбрионов на ранних стадиях их развития.
Наиболее популярным и эффективным методом является прямая
микроинъекция нескольких сотен копий линеаризованных молекул
рекомбинантной ДНК в пронуклеусы оплодотворенных яйцеклеток. Для этого
мышей-самок скрещивают с самцами-производителями и через 12 ч после
спаривания вскрывают их яйцеводы, выделяют оплодотворенные
одноклеточные яйца и помещают их в культуральную жидкость. В пронуклеусы
оплодотворенных яиц с помощью микроманипулятора вводят очищенную ДНК,
и прооперированные яйца пересаживают в яйцеводы псевдобеременных
реципиентных самок. Некоторая часть жизнеспособных трансплантированных
яиц проходит в организме мышей полный пренатальный цикл развития, после
чего развившиеся детеныши рождаются естественным путем или с
использованием кесарева сечения. Трансгенных животных идентифицируют в
помете гибридизацией по Саузерну высокомолекулярной ДНК тканей хвостов с
соответствующими зондами, далее трансгенные животные скрещивают друг с
другом для получения чистых линий и анализируют экспрессию трансгенов.
Приблизительно у 70% трансгенных мышей экзогенная рекомбинантная ДНК
имеется во всех соматических клетках и клетках зародышевого пути. Это
свидетельствует о том, что у них интеграция рекомбинантной ДНК в хромосомы
прошла до прохождения первого цикла их репликации в оплодотворенной
яйцеклетке. У остальных 30% трансгены содержат лишь часть соматических
клеток, т.е. они являются мозаиками, причем у некоторых трансгенных
животных клетки зародышевого пути становятся дефектными, а сами животные
– бесплодными. Как правило, трансгены стабильно передаются из поколения в
поколение без существенных изменений. Однако в ряде случаев отмечены их
Дата добавления: 2015-08-29; просмотров: 19 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |