Читайте также:
|
При диагностике ряда инфекционных болезней используются глобулиновые препараты, которые получают из сыворотки крови гипериммунизированных животных путем удаления из нее балластных белков, не участвующих в иммунном ответе организма.
Кровь состоит из жидкой части - плазмы и форменных элементов: эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов.
Плазма крови, лишенная белка фибриногена и форменных элементов, называется сывороткой крови.
Белки плазмы, которые остались после удаления фибриногена, называются сывороточными белками. Известно около 100 белковых компонентов плазмы. Условно их можно разделить на три группы:
- альбумины
- глобулины
- фибриноген.
Глобулины сыворотки крови делятся на три фракции: α, β, γ- глобулины. Каждая фракция, в свою очередь, делится на подфракции. Разделение основано на их различной электрофоретической подвижности.
Альфа-глобулины (α-глобулин) - фракция глобулинов сыворотки крови, состоящая из гликопротеидов и липопротеидов, обладающая наибольшей электрофоретической подвижностью (в сравнении с другими фракциями); участвует в транспорте липидов.
Бета-глобулины (β-глобулин) - фракция глобулинов сыворотки крови, состоящая из гликопротеидов, липопротеидов и металлопротеидов (трансферрин, церулоплазмин), обладающая средней между фракциями альфа- и гамма-глобулинов электрофоретической подвижностью; участвует в транспорте комплемента и некоторых антител.
Гамма-глобулин (γ-глобулин) - фракция глобулинов сыворотки крови, которая выполняет функцию защитных антител в организме и обладает наименьшей электрофоретической подвижностью.
Впервые выделены из сыворотки крови Тизелиусом А. в 1937 г.
Из белковых фракций сыворотки крови гамма-глобулиновая является самой неоднородной (имеется более 16 подфракций). Однако все подфракции гамма-глобулина очень близки по физико-химическим свой-ствам и электрофоретической подвижности.
По форме частиц гамма-глобулин относится к глобулярным белкам, форма которых приближается к сферической (рис. 18).
Рис. 18. Комплекс «антиген-антитело»
(микроорганизм в центре, вокруг него - иммуноглобулины)
Содержание гамма-глобулина в сыворотке крови животных различно и непостоянно. Особенно изменяется содержание гамма-глобулинов и белкового спектра сыворотки крови, в целом, при различных инфекционных заболеваниях. Этот фактор является одним из диагностических признаков. Значительно увеличивается содержание гамма-глобулина при иммунизации животных под воздействием введенного антигена.
У молодых особей содержание гамма-глобулина значительно ниже, чем у взрослых, а у новорожденных он отсутствует совсем.
Так, например, в плазме новорождённого жеребёнка содержится 3,7 % белка, из них альбумина – 65 %, альфа-глобулина –32 %, бета-глобулина –3 %, а гамма-глобулина –0 %.
Гамма-глобулин отсутствует и в сыворотке крови новорождённого телёнка, однако, через 18-20 часов после дачи молозива его содержание можно обнаружить биохимическими методами.
Гамма-глобулины у поросят попадают в сыворотку крови только из молока матери. Через 3 недели после рождения поросята начинают самостоятельно продуцировать сывороточный гамма-глобулин.
Таблица 2. Содержание белковых фракций в сыворотке крови
| Объект | Белковые фракции, % | |||
| альбумины | Глобулины | |||
| альфа | бета | гамма | ||
| Человек Корова Лошадь Свинья Овца Кролик Морская свинка | 55.2 41.0 32.0 42.0 57.0 60.0 56.0 | 5.3 13.0 14.0 16.0 11.0 7.0 14.5 | 8.7 8.0 24.0 17.0 7.0 12.0 8.0 | 30.0 38.0 30.0 25.0 25.0 21.0 21.5 |
Известно пять классов гамма-глобулинов (иммуноглобулинов):
1. Jg G - доминируют в сыворотке крови при инфекционных болезнях. Относятся к поздним микроглобулинам. Молекулярная масса - 150 тыс. Д, период полужизни – 12-20 дней. На долю Jg G от всех классов иммуноглобулинов приходится 85%. В сыворотке крови Jg G - 10-25%. Особенно активны против грамотрицательных бактерий и токсинов. Единственные иммуноглобулины, проходящие через плаценту.
2. Jg M - при заражении появляются в сыворотке крови первыми, на ранних стадиях иммунного ответа. Относятся к ранним макроглобулинам. Молекулярная масса - 970 тыс. Д, период полужизни – 5 дней. В сыворотке крови животных - 6%. Эволюционно старейшие антитела, лизируют антигены совместно с комплементом.
3. Jg А - сывороточный и секреторный. Основной класс антител в секретах. Секреторный Jg А препятствует проникновению возбудителей инфекционных болезней в организм через слизистые оболочки, ингибирует колонизацию эпителия бактериями. Обеспечивает первую линию защиты. Период полужизни – 6 дней, в сыворотке крови 10-13%.
4. Jg D - найдены у людей, больных красной волчанкой, дифтерией, ревматизмом. Связываются с В-лимфоцитами, выполняет регулирующую функцию. В сыворотке крови до 0, 03%. Короткоживущие иммуноглобулины.
5. Jg E (реагины) - обнаруживают при аллергиях. Связываются с тучными клетками и базофилами, стимулируют их дегрануляцию. В сыворотке крови до 0, 001%.
Иммуноглобулины по химическому составу относятся к гликопротеидам с молекулярной массой 150-900 кД, содержат около 10 % углеводов, состоят из 18 аминокислот (рис. 19).
Рис. 19. Строение молекулы Jg G
Электрофоретически гомогенная масса гамма-глобулина сыворотки крови обычно состоит из JgG, JgЕ, JgM, поэтому ее называют общей гаммаглобулиновой или иммуноглобулиновой фракцией сыворотки крови.
Установление связи антител с гамма-глобулиновой фракцией сыворотки кpoви послужило стимулом для разработки методов её выделения с целью применения в клинической практике и изучения физико-химических свойств.
К настоящему времени известно большое число различных методов фракционирования сывороточных белков - химических, физических и физико-химических.
К химическим и физико-химическим методам относятся:
- высаливание нейтральными солями - сернокислым аммонием, хлористым натрием, сернокислым натрием и некоторыми другими;
- изоэлектрическое осаждение;
- разведение с изменением ионной силы раствора;
- фракционирование при помощи органических осадителей - этилового и метилового спирта, ацетона, эфира;
- осаждение при помощи катионов - неорганических и органических (риванол) металлов;
- осаждение при помощи анионов;
- применение ионообменных смол.
К физическим методам относятся:
- ультрафильтрация через полупроницаемые мембраны;
- ультрацентрифугирование;
- разделение белков методом хроматографии;
- электрофоретическое разделение - метод препаративного и квекционного электрофореза.
Существуют также целый ряд комбинированных методов получения иммуноглобулиновых препаратов.
Наиболее простым в применении и недорогим является риваноловый метод получения гамма-глобулина
Риванол впервые был применен для фракционирования сывороточных белков чехословацким исследователем Горжейши в 1952 г. Им было установлено, что при добавлении к сыворотке крови водно-риванолового раствора происходит осаждение альбуминов, бета- и альфа-глобулинов. Основная масса гамма-глобулинов остается в фильтрате.
Выделение гамма-глобулина этим методом проводится следующим образом. К одному объёму сыворотки крови постепенно добавляется три объёма раствора риванола в 0,4 %-ной концентрации, в результате чего в осадок выпадают альбумины и основная масса альфа- и бета-глобулинов. Гамма-глобулин при таких условиях остается в растворе.
Кроме гамма-глобулина в растворе остается риванол, который удаляется активированным углем и фильтрацией через бумажные фильтры в воронках. При этом добавляется 10 г угля на 100 мл раствора. Смесь тщательно перемешивается. Полученный прозрачный раствор гамма-глобулина подвергают лиофильному высушиванию.
Технология получения гамма-глобулина риваноловым методом занимает мало времени, не требует дорогостоящего оборудования, однако имеет некоторые недостатки:
1. Полученная фракция гамма-глобулина содержит примеси бета- и альфа-глобулинов.
2. Необходимо очищать фильтрат от риванола активированным углем с последующей фильтрацией.
3. Необходимо высушивать большие объемы раствора гамма-глобулина, т.к. сыворотка, на первом этапе получения гамма-глобулина, разводится раствором риванола в четыре раза.
4. Невозможно получить другие фракции белков сыворотки, т.к. под воздействием риванола выпавшие в осадок белки денатурируют.
Все вышеизложенное заставило исследователей проводить усовершенствование риванолового метода и предлагать для практики его различные модификации (рис. 20).
Рис. 20. Схема изготовления гамма-глобулина
Дата добавления: 2015-08-27; просмотров: 425 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая страница | | | следующая страница ==> |
| Моноклональные антитела и их получение | | | На показатель преломления и процент белка по Рейссу |