Замедленная флуоресценция и фосфоресценция.

Измерение времен жизни возбужденных состояний в ряде фотолюминесцирующих объектов позволило выявить тип вторичного свечения, спектральные характеристики которого указывали на то, что это – флуоресценция, а величина времени жизни возбужденного состояния излучающих молекул – на то, что это триплетные возбуждения. Далее было показано, что вклад этого типа вторичного свечения в общую интенсивность флуоресценции нарастает по мере увеличения температуры образца. На основании этих данных было предположено, что подобный вид вторичного свечения связан с тем, что часть электронов с триплетного уровня Т₁ (см. рис. 15) попадает не на основной синглетный уровень S₀, а на возбужденную синглетную орбиталь S₁, откуда и осуществляется излучательный переход. Иными словами, электронные переходы в молекуле люминофора при рассматриваемом типе фотолюминесценции могут быть описаны следующей схемой:

В этой схеме DЕ – величина энергии, которую должен затратить электрон при переходе с Т₁ на S₁, поскольку триплет-синглетный переход (интеркомбинационная конверсия) требует от электрона изменения спина, а в данном случае – еще и попадания на наиболее высокий колебательный подуровень орбитали Т₁. Последнее обстоятельство объясняет тот факт, что вклад данного вторичного свечения в общую интенсивность флуоресценции образца возрастает с ростом температуры.

Рассмотренный тип фотолюминесценции носит название замедленная флуоресценция. Как и в случае фосфоресценции, интенсивность замедленной флуоресценции в обычных условиях (в жидких растворах и в присутствии кислорода) очень мала, поскольку большая часть триплетно-возбужденных молекул люминофора в такой ситуации инактивируется безизлучательно.

У большинства способных к фотолюминесценции соединений в замороженных растворах при низкой температуре (например, при 77^о К) помимо флуоресценции выявляется более длинноволновая полоса вторичного свечения (рис. 24). Эта полоса связана с излучательным электронным переходом с триплетной орбитали Т₁ на основной синглетный уровень S₀ (рис. 15). Обусловленная таким переходом фотолюминесценция, как уже указывалось выше, носит название фосфоресценция. Её характерной особенностью является относительно медленное затухание после прекращения возбуждения молекул в объекте. В некоторых случаях регистрируемая фосфоресценция может сохраняться в течение нескольких секунд.

Поскольку переход Т_1® S₀ требует от электрона преодоления энергетического барьера, связанного с необходимостью изменения спина, строго говоря, он является запрещенным. Поэтому молекулы с электроном, находящимся на триплетном уровне, могут пребывать в возбужденном состоянии достаточно долго. Например, истинное время жизни триплетно-возбужденных молекул триптофана составляет около 4 секунд (для сравнения истинное время жизни синглетных возбуждений у этой аминокислоты – 10^-9 секунды).

Из-за большого истинного времени жизни триплетных возбуждений с ростом температуры вероятность безизлучательного их тушения растет намного быстрее, чем у синглетных. Соответственно, квантовый выход фосфоресценции в обычных условиях очень мал. При 20-25^оС лишь изредка в молекулах крупных белков можно зарегистрировать фосфоресценцию ароматических аминокислотных остатков в виде «плеча» на длинноволновом склоне полосы флуоресценции с помощью флуориметров обычного типа.

J

Рисунок 24. Спектры возбуждения фотолюминесценции (1), флуоресценции (2) и фосфоресценции (3) триптофана. J – регистрируемая интенсивность вторичного свечения.

Публикуется с модификациями по: Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: «Дрофа», 2006, с. 77.

Поскольку времена затухания вторичного свечения после прекращения генерации новых возбужденных состояний у флуоресценции и фосфоресценции сильно различаются, для измерения параметров фосфоресценции удобно применять специальные оптические приборы – фосфороскопы (рис. 25). Принцип работы этих устройств состоит в том, что фотолюминесценция образца в них регистрируется после перекрывания возбуждающего излучения.

Рисунок 25. Схема устройства фосфороскопа. 1 – кювета с образцом; 2 – вращающийся цилиндр с прорезями; 3 – фотодетектор; J₀ – возбуждающее излучение; J_фс – фосфоресценция образца.

Публикуется с модификациями по: Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: «Дрофа», 2006, с. 78.

Фосфороскоп позволяет регистрировать спектры фосфоресценции при комнатной температуре, несмотря на ее низкую интенсивность. Особенно значимы оказались измерения характеристик этого вида фотолюминесценции у мембранных белков, которые, как оказалось, являются весьма чувствительны к состоянию мембранных структур.

Поскольку в большинстве случаев реальное время жизни у триплетно-возбужденных молекул при низких температурах (порядка 77^о К) достаточно велико, проводить измерение этого показателя значительно проще, чем в случае синглетного возбуждения: удается прямо регистрировать кинетики затухания фосфоресценции после прекращения возбуждения в режиме реального времени. Лишь в некоторых случаях приходится прибегать к специальным приемам. Например, при определении величины t у порфиринов (она составляет порядка 10^-4 с) возбуждение молекул образца осуществлялось короткой вспышкой высокоинтенсивного излучения, а для регистрации затухания свечения применялись быстродействующие осциллографы. В таблице 3 приведены величины времен жизни фосфоресценции для некоторых белков при разной температуре.

Таблица 3. Времена жизни фосфоресценции ряда белков (в секундах) в буферном растворе при разной температуре.

Публикуется с модификациями по: Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: «Дрофа», 2006, с. 84.

Температура, ^оС	Рибонуклеаза Т1 (фосфоресцируют остатки тирозина)	Лактатдегидрогеназа (фосфоресцируют остатки триптофана)	Щелочная фосфатаза (фосфоресцируют остатки триптофана)
	0,093	1,40	3,3
	0,050	0,97	2,61
	0,031	0,59	1,76
	0,025	0,29	1,22
	-	0,15	0,75

Обратите внимание на то, что измерения величины t для фосфоресценции этих протеинов осуществлялись при достаточно высоких температурах. Это оказалось возможным вследствие применения высокочувствительных фосфороскопов и благодаря тому, что ароматические аминокислотные остатки располагаются в этих белках внутри белковых глобул, где их подвижность и доступность для тушителей снижены.

Сопоставление величины t для триплетных возбуждений в разных белках позволило установить, что микровязкость окружения ароматических аминокислотных остатков внутри белковых глобул сильно (в пределах от 0,1 до 10⁶ Па´с) варьирует. Оказалось также, что изменение конформации белковых молекул (например, вследствие связывания субстрата с активным центром у ферментов) весьма сильно сказывается на величине t фосфоресценции остатков ароматических аминокислот в их составе.

Следует заметить, что в живых клетках фосфоресценция ароматических аминокислотных остатков в цитоплазматических протеинах значительно ослаблена из-за наличия кислорода. Для кислорода триплетное состояние является основным, поэтому его молекулы очень эффективно тушат триплетно-возбужденные молекулы других веществ. Основной вклад в регистрируемую клеточную фосфоресценцию клеток вносят поэтому мембранные белки, доступ кислорода к ароматическим аминокислотным остаткам которых ограничен.

Дата добавления: 2015-07-25