Студопедия
Случайная страница | ТОМ-1 | ТОМ-2 | ТОМ-3
АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатика
ИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханика
ОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторика
СоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансы
ХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника

ЧАСТЬ I

Читайте также:
  1. II. Основная часть
  2. IV. Счастье улыбается Мите
  3. А теперь следующий вопрос (Рассуждения Мэй Касахары. Часть 3)
  4. Б. Экзокринная часть: панкреатические ацинусы
  5. Беседа Х. О счастье.
  6. Буддадхарма безгранична и вечна - как бы она могла влезть в твои рамки счастья и удовлетворения?
  7. Буддадхарма безгранична и вечна – как бы она могла влезть в твои рамки счастья и удовлетворения?

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ

Федеральное государственное бюджетное образовательное

Учреждение высшего профессионального образования

«Национальный исследовательский ядерный университет«МИФИ»

ОБНИНСКИЙ ИНСТИТУТ АТОМНОЙ ЭНЕРГЕТИКИ

Медицинский факультет

 

Ю.В. МИНКИНА

Е.В. ГРОМОВА

 

учебно-методическое пособие для подготовки студентов к практическим занятиям по биологической химии

 

для студентов I курса специальности «Лечебное дело»

 

ЧАСТЬ I

 

 

Рекомендовано к изданию

Редакционно-издательским советом института

 

Обнинск 2013

Составители: Минкина Ю.В., Громова Е.В. Рецензенты Биохимия. Лабораторный практикум для студентов I курса медицинского факультета специальности 060101 – Лечебное дело / Сост. Ю.В. Минкина, Е.В.Громова – Обнинск. 2013. 124 с. Учебное пособие является руководством для выполнения лабораторных работ по биохимии. Оно включает работы, охватывающие основные разделы теоретического курса как статической, так и динамической биохимии. Перед каждой работой дается краткая теоретическая часть, необходимая для понимания эксперимента, приведены формулы и реакции. ВВЕДЕНИЕ Практикум по биохимии разработан в соответствии с рабочей программой дисциплины «Биохимия» для студентов II курса медицинского факультета по специальности «лечебное дело» на основе государственных стандартов. Он включает в себя лабораторные работы, которые охватывают основные разделы изучаемого курса статической и динамической биохимии: простые и сложные белки, ферменты, липиды, витамины, углеводы и продукты их расщепления в организме. Для выполнения лабораторных работ по биологической химии студенты должны обладать определенными экспериментальными навыками: уметь взвешивать на аналитических весах, измерять объемы жидкостей, проводить титрование, работать с приборами, используемыми в физико-химических исследованиях. Студенты должны уметь строить графики и обсчитывать результаты измерения. Тема: КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ1. ЦЕЛЬИзучить качественные реакции, используемые для обнаружения белков и определения их аминокислотного состава. 2. ЗАДАЧИ2.1. Провести биуретовую реакцию.2.2. Провести нингидриновую реакцию.2.3. Провести ксантопротеиновую реакцию.2.4. Провести реакцию на аргинин.2.5. Провести реакцию на тирозин.2.6. Провести реакции на серосодержащие аминокислоты.2.7. Сделать выводы и оформить отчет. 3. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ Белки – это высокомолекулярные органические соединения, состоящие из остатков аминокислот, которые связаны друг с другом при помощи пептидных связей. В состав белков входят 18–20 различных аминокислот. Одни из них организм может синтезировать самостоятельно – это заменимые аминокислоты. Другие, незаменимые, в организме синтезироваться не могут и должны поступать с пищей. Все аминокислоты, входящие в состав белков, являются α-аминокислотами, так как только аминогруппа, стоящая в α-положении, способна образовывать пептидную связь. Все α-аминокислоты, за исключением глицина, имеют ассиметричный углеродный атом и поэтому являются оптически активными соединениями. Они способны вращать плоскость поляризованного луча или вправо, или влево. Первые называются правовращающими и обозначаются знаком (+), вторые – левовращающими (–). Кроме этого, аминокислоты образуют два ряда стериоизомеров – L и D. В состав живых организмов входят L (–) - аминокислоты. Для обнаружения белка применяют цветные реакции. Они делятся на два типа: общие, или универсальные, и специфические. К универсальным реакциям относятся биуретовая (на пептидную связь) и нингидриновая (на α-аминокислоты). При их помощи можно открыть любой белок. К специфическим относятся реакции на отдельные аминокислоты. Это реакции на функциональные группы радикалов аминокислот, входящих в состав белков. При их помощи можно открыть только тот белок, в состав которого они входят.Значение цветных реакций состоит в том, что они дают возможность обнаружить присутствие белка в биологических жидкостях, растворах и установить аминокислотный состав различных природных белков. Эти реакции применяются как для качественного, так и для количественного определения белка и содержащихся в нем аминокислот.Биуретовая реакция (Пиотровского) открывает пептидную связь(−CО−NH−) в белке. В щелочной среде раствор белка, взаимодействуя с ионами меди, приобретает сине-фиолетовый цвет. Продукты неполного гидролиза белка – пептоны дают розовое окрашивание. Биуретовую реакцию способны давать вещества, которые содержат не менее двух пептидных связей. Пептидные связи могут существовать в двух формах: кетоформе и енольной. В щелочной среде они переходят в енольную форму. При прибавлении ионов меди образуется биуретовый комплекс в результате соединения меди с пептидной группировкой белка. Окраска биуретового комплекса зависит от количества пептидных связей, концентрации белка и количества ионов меди в растворе. Она изменяется от синей до красной с преобладанием фиолетовой.Нингидриновая реакция характерна для аминогрупп, находящихся в α-положении и входящих в состав белков, а также полипептидов и свободных аминокислот. В результате взаимодействия α-аминокислоты с нингидрином образуется шиффово основание, которое перегруппировывается, декарбоксилируется и расщепляется на альдегид и аминодикетогидринден. Образовавшийся аминодикето-гидринден конденсируется еще с одной молекулой нингидрина. Образовавшееся соединение превращается в окрашенную енольную форму, получившую название «сине-фиолетовый комплекс Руэмана». Сине-фиолетовый комплекс Руэмана. В присутствии органических растворителей (спирта или ацетона) образовавшееся шиффово основание не распадается, поскольку в соединении нет воды. Конденсируясь с нингидрином, оно содержит в своем составе радикал исходной аминокислоты, который обусловливает различную окраску: голубую, красную, синюю, фиолетовую, а в присутствии иминокислоты пролина – желтую.К специфическим реакциям относятся реакции Мульдера, Миллона, Сакагучи, Фоля.Ксантопротеиновая реакция (Мульдера) происходит только при наличии в белке ароматических аминокислот (тирозин, фенилаланин, триптофан). Реакция обусловлена образованием нитропроизводных циклических аминокислот. При добавлении к таким белкам концентрированной азотной кислоты протекает реакция нитрования с образованием окрашенных в желтый цвет нитросоединений. При добавлении щелочи желтая окраска переходит в оранжевую, так как в щелочной среде нитропроизводные аминокислот образуют соли хиноидной структуры, имеющие оранжевый цвет: тирозин динитротирозин (желтого цвета) С белками, содержащими тирозин, идет также реакция Миллона. Реактив Миллона представляет собой смесь нитратов (HgNO3) и нитритов (HgNO2) ртути (I), растворенных в концентрированной азотной кислоте. При добавлении к раствору белка реактива Миллона его компоненты взаимодействуют с фенольным ядром тирозина. При этом образуется осадок ртутной соли динитротирозина, окрашенный в кроваво-красный цвет. Химизм реакции можно представить в следующем виде: К раствору белка не следует добавлять избыток реактива Миллона, так как он содержит азотную кислоту, которая при взаимодействии с белком может дать желтое окрашивание (ксантопротеиновая реакция), маскирующее реакцию Миллона. Для ускорения появления окраски раствор можно подогреть. Реакция Сакагучи идет с белками, которые содержат аргинин. В присутствии щелочи образуется розово-красное окрашивание с α-нафтолом. Аргинин имеет гуанидиновую группировку (NH2−C−(NH)2), которая в присутствии α-нафтола окисляется гипобромидом в щелочной среде, в результате чего образуется продукт конденсации розово-красного цвета.Химизм реакции следующий: Белки, содержащие сульфгидрильные группы (–SH) можно обнаружить при помощи реакции Фоля. Предварительно проводят щелочной гидролиз белка, при котором отщепляется сульфидная группа, которую обнаруживают при помощи тех или иных реактивов. При проведении реакции Фоля действуют плюмбитом натрия (Na2PbO2), который образуется в результате взаимодействия ацетата свинца Pb(СН3СОО)2 и гидроксида натрия NaOH, в результате чего образуется черный нерастворимый осадок сульфида свинца. Химизм реакции следующий: Метионин хотя и содержит серу, этой реакции не дает, так как сера в нем прочно связана с метильной группой, а не с водородом. 4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ4.1. Биуретовая реакция (Пиотровского)

Ход работы

Загрузка...


Берут пять пробирок: в первую добавляют 5 капель разбавленного яичного белка, во вторую – 5 капель раствора желатина, в третью – 5 капель растительного альбумина, в четвертую – 5 капель раствора казеина, в пятую – 5 капель любой аминокислоты. В каждую пробирку прибавляют 5 капель 10%-ного раствора NaOH и 2 капли 1%-ного раствора сульфата меди. Все пробирки тщательно перемешивают. Наблюдают за изменением окраски в пробирках и отмечают, какой цвет появился в каждой из них. Фиолетовый цвет свидетельствует о наличии пептидных связей в белковых молекулах.Внимание! В пробирки нельзя добавлять избыток сульфата меди, так как синий осадок гидрата окиси меди маскирует характерное фиолетовое окрашивание биуретового комплекса белка.4.2. Нингидриновая реакция

Ход работы

Берут пять пробирок:в первую добавляют 5 капель разбавленного яичного белка, во вторую – 5 капель раствора желатина, в третью – 5 капель растительного альбумина, в четвертую – 5 капель раствора казеина, в пятую – 5 капель любой аминокислоты. В каждую из пробирок прибавляют 5 капель 0,5%-ного водного раствора нингидрина и кипятят 1–2 мин. Наблюдают за изменением окраски и отмечают, какой цвет и почему появился в каждой из пробирок. При протекании реакции в пробирке сначала появляется розово-фиолетовое окрашивание, которое постепенно синеет, так как образуется сине-фиолетовый комплекс Руэмана, свидетельствующий о наличии в растворе α-аминокислот.4.3. Ксантопротеиновая реакция (Мульдера)

Ход работы

Берут пять пробирок: в первую наливают 5 капель раствора яичного белка, во вторую – 5 капель раствора тирозина, в третью – 5 капель раствора желатина, в четвертую – 5 капель растительного альбумина,в пятую – 5 капель раствора казеина. Затем во все пробирки добавляют по 3 капли концентрированной азотной кислоты и осторожно кипятят. Наблюдают за изменением окраски и отмечают, какой цвет и почему появился в каждой из пробирок. Появление осадка желтого цвета свидетельствует о присутствии циклических аминокислот. После охлаждения в каждую пробирку добавляют приблизительно 10–15 капель 20%-ного раствора щелочи NaОН. Желтое окрашивание растворов переходит в оранжевое вследствие образования натриевой соли динитротирозина. После окончания опыта делают вывод, какие из взятых для опыта веществ содержат циклические аминокислоты, а какие – не содержат.4.4. Реакция на тирозин (Миллона)

Ход работы

Берут шесть пробирок: в первую наливают 5 капель раствора яичного белка, во вторую – 5 капель раствора тирозина, в третью – 5 капель раствора желатина, в четвертую – 5 капель растительного альбумина, в пятую – 5 капель раствора казеина,в шестую – 5 капель 0,1%-ного раствора фенола. В каждую пробирку приливают по 3 капли реактива Миллона (раствор ртути в азотной кислоте) и осторожно нагревают. Появление осадка кровавокрасного окрашивания, которое дает ртутная соль динитротирозина, свидетельствует о наличии циклических аминокислот. Наблюдают за изменением окраски в каждой из пробирок. Отмечают, какой цвет появился в каждой из них. Делают вывод о том, какие из белков – содержат, а какие – не содержат циклические аминокислоты.4.5. Реакция на аргинин (Сакагучи)

Ход работы

Берут пять пробирок: в первую наливают 10 капель раствора яичного белка, во вторую – 10 капель 0,01%-ного раствора аргинина, в третью – 10 капель раствора желатина, в четвертую – 10 капель растительного альбумина, в пятую – 10 капель раствора казеина. Во все пробирки добавляют по 10 капель 10%-ного раствора NaOH и по несколько капель 0,2%-ного спиртового раствора α-нафтола. Хорошо перемешивают и прибавляют по 5 капель гипобромида натрия (NaBrO). Опять быстро перемешивают и (немедленно!) добавляют 8–10 капель 40%-ного раствора мочевины для стабилизации быстроразвивающегося розово-красного окрашивания. Наблюдают за изменением окраски в каждой из пробирок и отмечают, какой цвет и почему появился в каждой из них. Делают вывод, какие из белков – содержат, а какие – не содержат аминокислоту аргинин.4.6. Реакция на аминокислоты, содержащие серу4.6.1. Реакция Фоля

Ход работы

Берут пять пробирок: в первую наливают 5 капель раствора яичного белка, во вторую – 5 капель 0,02%-ного раствора цистеина, в третью – 5 капель раствора желатина, в четвертую – 5 капель растительного альбумина,в пятую – 5 капель раствора казеина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель 30%-ного раствора NaОН и по 1 капле 5%-ного раствора ацетата свинца. Интенсивно кипятят и дают постоять 1–2 мин. Наблюдают за изменением окраски в каждой из пробирок и отмечают, какой цвет и почему появился в каждой из них. Делают вывод, в состав каких белков входят серосодержащие аминокислоты.4.6.2. Нитропруссидная реакция

Ход работы

Берут пять пробирок: в первую наливают 5 капель раствора яичного белка, во вторую – 5 капель 0,02%-ного раствора цистеина, в третью – 5 капель раствора желатина, в четвертую – 5 капель растительного альбумина,в пятую – 5 капель раствора казеина. В каждую пробирку добавляют 5 капель 20%-ного раствора щелочи, интенсивно кипятят, охлаждают и приливают 3 капли свежеприготовленного 5%-ного раствора нитропруссида натрия. Наблюдают за изменением окраски в каждой из пробирок и отмечают, какой цвет и почему появился в каждой из них. Делают вывод, в состав каких белков входят серосодержащие аминокислоты. И в первом, и во втором опыте интенсивность окрашивания зависит от количества аминокислот, содержащих серу, и от количества белка в растворе. 5. СОСТАВЛЕНИЕ ОТЧЕТАОтчет составляется с указанием цели, задания, включает уравнения протекания реакций, экспериментальные данные и выводы. Выводы содержат заключение об аминокислотном составе белков и о возможности их обнаружения цветными реакциями. 6. ВОПРОСЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ6.1. Какие вещества называются белками?6.2. Чем обусловлены цветные реакции на белки?6.3. Что вы можете сказать об аминокислотном составе белков, если с раствором одного из них реакции Миллона и ксантопротеиновая положительны, а с раствором другого отрицательны?6.4. Как с помощью цветных реакций обнаружить в белке аргинин?6.5. Как обнаружить в белке цистеин?6.6. Как обнаружить в белке тирозин? Тема: ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ. РЕАКЦИИ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ.1. ЦЕЛЬИзучить физико-химические свойства белков и реакции осаждения белков. 2. ЗАДАЧИ2.1. Определить изоэлектрическую точку белка казеина.2.2. Провести разделение альбуминов и глобулинов яичного белка методом высаливания.2.3. Провести осаждение белков при нагревании2.4. Провести осаждение белков солями тяжелых металлов.2.5. Провести осаждение белков минеральными кислотами.2.6. Провести осаждение белков органическими кислотами2.7. Осаждение белков фенолами2.8. Осаждение белков алкалоидными реактивами

2.9. Осаждение белков органическими растворителями

2.10. Сделать выводы и оформить отчет. 3. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ Белки являются высокомолекулярными соединениями, так как в их состав входят сотни и тысячи атомов. Например, чистый β-лактоглобулин имеет следующий элементарный состав: С1864Н3012О576N418S21. Все белки в зависимости от их строения делятся на две группы: фибрилярные и глобулярные. Фибриллярные белки имеют форму тончайших нитей. Они входят в состав мышц (миозин), сухожилий (коллаген, эластин), кожи, шерсти и т. д. Большинство из них не растворимы в воде. Глобулярные белки имеют округлую форму. К ним относятся альбумины, глобулины, гемоглобин и др. Они растворяются в воде и солевых растворах.Белки состоят из аминокислот и поэтому обладают амфотерными свойствами. При растворении белков в воде ион водорода, появляющийся в результате диссоциации карбоксильной группы, присоединяется к аминогруппе. Поэтому белковые молекулы несут как положительные, так и отрицательные заряды. Величина заряда определяется количеством ионогенных групп. При определенном значении рН суммарный электрический заряд молекулы белка становится равным нулю. Такое значение рН называется изоэлектрической точкой (рJ). В изоэлектрической точке растворы белков имеют минимальную устойчивость, поскольку они лишены основного стабилизирующего фактора – заряда и поэтому легко выпадают в осадок. Определить изоэлектрическую точку белка можно, определив рН, при котором раствор белка имеет наибольшее помутнение. У большинства белков изоэлектрическая точка лежит в слабокислой среде. Растворение белка объясняется его гидратацией, т. е. образованием водной оболочки из ориентированных молекул воды. При этом образуются коллоидные растворы. Такие растворы являются неустойчивыми. При добавлении к ним каких-нибудь водоотнимающих веществ (концентрированных растворов солей, спирта и т. д.) гидратация уменьшается, следовательно, уменьшается и растворимость белка. Белок выпадает в осадок. Процесс выпадения белка в осадок под действием водоотнимающих средств называется высаливанием. При высаливании происходит дегидратация белковых молекул. На процесс высаливания влияет ряд факторов: гидрофильность белка, заряд катиона и аниона соли и т. д. Поэтому различные белки высаливаются при различной концентрации одних и тех же солей. Этим пользуются для разделения белков на различные фракции. Так, глобулины, имеющие относительную массу больше, чем альбумины, осаждаются полунасыщенным раствором сульфата аммония (NH4)2SO4, а альбумины – его насыщенным раствором.

Существует большое количество реакций осаждения белков. Условно их можно разделить на 2 группы: 1) необратимые, при которых белки претерпевают глубокие изменения и не могут вновь растворяться в первоначальном растворителе, т.е. наступает денатурация белков. К необратимым реакциям относятся осаждение белка солями тяжелых металлов, алкалоидными реактивами, минеральными и органическими кислотами и осаждение при нагревании; 2) обратимые, при которых осаждаемые белки не подвергаются глубоким изменениям, поэтому осадки белков могут растворяться в первоначальном растворителе. К обратимым реакциям осаждения следует отнести осаждение белков органическими растворителями (спиртом или ацетоном) и высаливание (осаждение под влиянием концентрированных растворов нейтральных солей: NH4Cl, NaCl, (NH4)2SO4 и др.).

Осаждение белков различными солями зависит от их дегидратирующей способности, в частности хлорид натрия осаждает белки слабее, чем сульфат аммония. Высаливание белков является обратимым процессом, т. е. при высаливании способность белков к растворению не теряется. При прибавлении достаточного количества воды белок снова может раствориться. Денатурация белка, в отличие от высаливания, является необратимым процессом. При денатурации происходит разрушение третичной и частично вторичной структуры белковой молекулы в результате разрыва водородных связей. При денатурации в той или иной мере происходит изменение формы и размеров молекулы, изменение реактивности некоторых химических групп, уменьшение растворимости, уменьшение или полная потеря специфической биологической активности, изменение удельной оптической активности. При денатурации изменяется строение поверхностного слоя белковых частиц, в результате чего на поверхность выходят гидрофобные (не растворимые в воде) группы. Денатурацию вызывают различные физические (нагревание, действие ультрафиолетовых лучей и т. д.) и химические (соли тяжелых металлов, минеральные и органические кислоты и т. д.) факторы. Соли тяжелых металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.) вызывают денатурацию белков даже в очень малых концентрациях. Взаимодействуя с белками, ионы тяжелых металлов адсорбируются на них, образуя соединения, растворимые в избытке солей (за исключением солей AgNO3, HgCl2), но не растворимые в воде. Концентрированные минеральные кислоты тоже вызывают денатурацию белковых молекул. Происходит образование комплексных солей белка с кислотами (за исключением фосфорной кислоты). В избытке всех минеральных кислот (исключая азотную) выпавший осадок белка растворяется. Денатурированные частицы белка способны к агрегации и выпадению в осадок, но коагуляция является вторичным процессом по отношению к денатурации, поэтому денатурация белка не всегда сопровождается выпадением осадка. Так, если проводить нагревание сильно подкисленных или подщелоченных растворов белка, то осадка не образуется. Это объясняется тем, что на молекулах белка появляются одноименные заряды (+ или –), которые препятствуют объединению частиц в агрегаты. Заряд на поверхности белковых молекул является одним из основных стабилизирующих факторов.

Роль реакций осаждения белка заключается в том, что они дают возможность изучить свойства белков, освободить жидкость от присутствия белка при некоторых исследованиях, установить наличие белка (например, в моче) при различных патологических состояниях (заболевания почек, сердечная декомпенсация и др.). Осаждение белков высаливанием с помощью различных концентраций сернокислого аммония или других нейтральных солей позволяет разделить отдельные белковые фракции – альбумины и глобулины.

Некоторые реакции осаждения белков используют в лечебной практике (например, при лечении ожогов, когда белки осаждают таннином или спиртом). При отравлениях солями тяжелых металлов рекомендуется дать пострадавшему выпить раствор яичного белка или молоко, белки которых связывают эти металлы и предупреждают их всасывание. 4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ4.1. Определение изоэлектрической точки белка казеина Изоэлектрической точкой белка (ИЭТ или pI) называется определенная величина рН среды, при которой белок находится в виде нейтральных молекул (в изоэлектрическом состоянии), несущих равные количества положительных и отрицательных зарядов. При других концентрациях ионов водорода в растворе присутствуют преимущественно положительные или отрицательные ионы белка. Растворы белков в изоэлектрической точке наименее устойчивы и легко выпадают в осадок. Для большинства белков эта точка близка к нейтральной среде, но не вполне совпадает с ней (pI белков лежат в области рН 6-8); для многих белков она сдвинута в кислую сторону (альбумины pI = 4,6; пепсин pI = 1,5-2,0), а некоторые имеют изоэлектрическую точку при щелочной реакции среды (гистоны pI = 8,5).

Отыскать изоэлектрическую точку белка можно, определив рН раствора, при котором наблюдается наиболее быстрое и полное выпадение белка в осадок.

Ход работы

0,01 г казеина помещают в пробирку и растворяют при нагревании примерно в 2-3 мл 0,4% раствора соды. При этом образуется сильно опалесцирующий коллоидный раствор, к которому добавляют 10 мл дистиллированной воды.

В шести пронумерованных пробирках приготавливают буферные смеси с различными значениями рН, смешивая 0,2 М раствор уксусной кислоты и 0,2 М раствор уксуснокислого натрия в соотношениях, указанных в таблице 1 (растворы точно отмеривают пипеткой или бюреткой).

 

Приготовление буферных растворов Таблица 1.
Реактивы Пробирки
1 2 3 4 5 6
0,2М СН3СООН, мл 0,1 0,2 0,5 0,8 0,9 0,95
0,2М СН3СООNа, мл 0,9 0,8 0,5 0,2 0,1 0,05
рН смеси 5,7 5,35 4,75 4,15 3,8 3,4
Интенсивность помутнения раствора            

Раствор в пробирках взбалтывают, затем в каждую добавляют по 0,5 мл приготовленного (как указано выше) 0,1% раствора казеина. Содержимое каждой пробирки вновь перемешивают и отмечают в таблице интенсивность помутнения: знаком +++ - наиболее сильное, ++ - менее сильное, + - слабое, - - отсутствие помутнения. Наибольшее помутнение в результате выпадения осадка белка будет наблюдаться в той пробирке, где рН соответствует изоэлектрической точке (рJ) казеина. Результаты работы оформляют в виде таблицы и делают вывод.

4.2. Разделение альбуминов и глобулинов яичного белка методом высаливания Яичный белок состоит из нескольких белков, отличающихся друг от друга по растворимости. При помощи метода высаливания из него можно выделить альбумины и глобулины.

Ход работы

4.2.1. К 20 каплям неразбавленного яичного белка добавляют сухую соль хлорида натрия до насыщения раствора, т. е. до того момента, когда соль перестанет растворяться. Выпадает белый аморфный осадок глобулинов. Через 10–12 мин произойдет их полное осаждение. После этого осадок отфильтровывают через бумажный фильтр. Пробирку с фильтратом кипятят или проводят с ее содержимым биуретовую реакцию. Отрицательная реакция указывает на отсутствие белка, положительная – на его присутствие. Делают вывод о наличии белка в фильтрате.4.2.2. К 20 каплям неразбавленного яичного белка добавляют 20 капель насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. Получается полунасыщенный раствор сульфата аммония, в котором выпадает осадок яичного глобулина. Через 5–10 минут осадок отфильтровывают. В фильтрате остается яичный альбумин. Для его высаливания к фильтрату прибавляют сухую соль сульфата аммония до полного насыщения раствора. Выпавший осадок альбумина отфильтровывают, а фильтрат кипятят или проводят с ним биуретовую реакцию. Отрицательная реакция указывает на отсутствие белка. Делают вывод о высаливающей способности хлорида натрия и сульфата аммония.4.3. Осаждение белков при нагревании в разных средах

Почти все белки при нагревании выше 55°С денатурируют. Механизм тепловой денатурации связан с перестройкой структуры белковой молекулы, в результате которой белок теряет свои нативные свойства, уменьшается его растворимость вследствие разрушения гидратной оболочки. Присутствие нейтральных солей и изменение рН среды имеют важное значение в осаждении белка при нагревании. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в его изоэлектрической точке, т.е. при такой величине рН, когда коллоидные частицы белка наименее устойчивы. Поэтому для полного осаждения белка при нагревании реакция среды должна соответствовать его изоэлектрической точке.

Белки обладающие кислыми свойствами, полнее осаждаются в слабокислой, щелочными свойствами – в слабощелочной среде. В сильнокислых (за исключением осаждения азотной, трихлоруксусной и сульфосалициловой кислот) и сильнощелочных растворах денатурировавший при нагревании белок не выпадает в осадок, так как частицы его перезаряжаются и несут в первом случае большой положительный, во втором – большой отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в растворе за счет электростатических сил отталкивания.

В связи с этим в вышеназванных растворах белки обычно не выпадают в осадок при нагревании. Однако в сильнокислых растворах при нагревании они могут коагулировать, если добавить достаточное количество какой-либо нейтральной соли. Степень влияния ионов нейтральных солей на осаждаемость белка зависит от их способности адсорбироваться на его частицах. Адсорбированные ионы соли нейтрализуют заряд частицы, и наступает момент, когда силы притяжения между молекулами превышают силы отталкивания, вследствие чего белок выпадает в осадок.

Ход работы

В пять пронумерованных пробирок наливают по 5-10 капель 1% раствора яичного белка, который должен быть абсолютно прозрачным.

Содержимое первой пробирки нагревают и наблюдают за появлением опалесценции, которая хорошо видна, если рассматривать раствор на черном фоне и иметь для сравнения пробирку с исходным раствором белка. Усиление опалесценции объясняется укрупнением взвешенных частиц белка. При нагревании раствора усиливается движение белковых частиц и повышается частота их столкновений. По мере сближения частиц начинают действовать силы притяжения, частицы соединяются, образуя агрегаты молекул, что вызывает увеличение рассеивания света.

К раствору яичного белка во второй пробирке осторожно приливают одну каплю 1% раствора уксусной кислоты, нагревают и наблюдают сначала появление опалесценции, а потом выпадение белого хлопьевидного осадка.

К раствору яичного белка в третьей пробирке добавляют 1-2 капли 10% раствора уксусной кислоты и нагревают. Осадок при этом не образуется.

В четвертую пробирку добавляют 1-2 капли 10% уксусной кислоты и 1 каплю насыщенного раствора хлористого натрия, нагревают и наблюдают выпадение осадка белка.

В пятую пробирку вносят 1 каплю 10% раствора едкого натра и нагревают. В данном случае осадок не выпадает.

Все пять пробирок нагревают на водяной бане. Наблюдают за изменениями, которые в них происходят. Определяют, в каких пробирках и в какой последовательности происходит помутнение. Результаты опыта и выводы записывают в таблице 2.Результаты опытов Таблица 2.
№ пробирки Среда Наблюдаемыеизменения Выводы
1 Нейтральная    
2 Слабокислая (1% СН3СООН)    
3 Кислая(10% СН3СООН)    
4 Слабокислая(1% CH3COOH NaCl)    
5 Щелочная(10% NaOH)    
4.4. Осаждение белков солями тяжелых металлов

Осаждение белков солями тяжелых металлов вызывает денатурацию белковой молекулы и обусловлено адсорбцией тяжелого металла на поверхности белковой молекулы с образованием нерастворимых в воде солеобразных и комплексных соединений.

Ход работы

В три пробирки вносят по 5 капель 1% раствора яичного белка и по 1 капле:

в первую пробирку – 7% раствора сульфата меди,

во вторую – 5% раствора уксуснокислого свинца,

в третью – 5% раствора нитрата серебра.

Во всех пробирках образуется осадок. Затем в каждую из пробирок добавляют по 5-10 капель соответствующего раствора соли тяжелого металла. При этом в двух первых пробирках наблюдается растворение осадка, в третьей осадок не растворяется.

Делают вывод о том, в избытке каких солей осадок растворяется.

4.5. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами

Осаждение белка из раствора концентрированными минеральными кислотами обусловлено его дегидратацией и последующей денатурацией. При длительном воздействии избытка серной и соляной кислот выпавший осадок денатурировавшего белка растворяется вследствие частичного гидролиза. При избытке азотной кислоты растворения осадка не происходит.

Осаждают белки концентрированными минеральными кислотами наслаиванием на кислоты раствора белка. При этом образуется осадок, который растворяется при смешивании жидкостей.

Реакция наслаивания на кислоту раствора белка очень чувствительна, так как вследствие диффузии жидкостей устанавливается наиболее благоприятная для данной реакции концентрация реагирующих веществ.

Проба Хеллера(осаждение белков азотной кислотой) используется для определения наличия белка в моче. Эта качественная реакция лежит в основе количественного определения белка в моче по методу Робертса-Брандберга-Стольникова.

Ход работы

Берут три пробирки:

в первую пробирку наливают 10-20 капель концентрированной азотной кислоты,

во вторую – столько же концентрированной соляной кислоты,

в третью – такое же количество концентрированной серной кислоты.

Затем, наклонив пробирку, осторожно по ее стенке пипеткой наслаивают равный объем 1% раствора яичного белка, следя за тем, чтобы обе жидкости не смешивались. В области соприкосновения жидкостей образуется белый аморфный слой белка. В каждую пробирку добавляют избыток соответствующей кислоты. Наблюдают растворение осадка в избытке серной кислоты.

4.6. Осаждение белков органическими кислотами

Органические кислоты вызывают необратимое осаждение белков. Чаще всего используют растворы трихлоруксусной и сульфосалициловой кислот. Названные кислоты специфичны к белку и широко используются для определения наличия его в моче, экссудатах и других жидкостях организма человека. Сульфосалициловая кислота широко используется в клинике для обнаружения малых количеств белка в моче и других биологических жидкостях. Кроме белков она осаждает также продукты их распада – высокомолекулярные пептоны и полипептиды.

Трихлоруксусная кислота (ТХУ) способна осаждать только белки и не осаждает продукты их распада. В связи с этим она широко используется в клинике для получения безбелковых фильтратов крови, например, для определения остаточного (небелкового) азота или среднемолекулярных пептидов.

Ход работы

В две пробирки наливают по 10 капель 1% раствора яичного белка.

В одну из них добавляют 2-3 капли свежеприготовленного 10% раствора трихлоруксусной,

В другую – 1 каплю 10% раствора сульфосалициловой кислоты, наблюдая за выпадением осадка.

4.7. Осаждение белков фенолами

Ход работы

В пробирку наливают 10 капель раствора белка и добавляют при взбалтывании фенол до появления мути или осадка. При стоянии пробирки осадок увеличивается.

4.8. Осаждение белков алкалоидными реактивами

К группе алкалоидных реактивов принадлежат танин, пикриновая кислота, железосинеродистая кислота, фосфорновольфрамовая, фосфорномолибденовая кислота и др. Механизм осаждения белков алкалоидными реактивами связан с образованием нерастворимых солеобразных соединений с основными азотсодержащими группами белка. В этих соединениях белок является катионом, а алкалоид – анионом.

Для сообщения белку положительного заряда рекомендуется слабое подкисление его раствора уксусной кислотой. Протамины и гистоны, несущие положительный заряд, хорошо осаждаются алкалоидными агентами в нейтральной среде без подкисления. Алкалоиды нашли применение при лечении ожогов. Обработка ими пораженной области приводит к денатурации белков и образованию защитного слоя, препятствующего обезвоживанию тканей и проникновению инфекции.

Ход работы

В три пробирки наливают по 5 капель 1% раствора яичного белка, по 1 капле 1% раствора уксусной кислоты и по 2-3 капли:

в первую пробирку – 10% раствора пикриновой кислоты,

во вторую – насыщенного раствора танина,

в третью – 5 % раствора железосинеродистого калия.

Во всех пробирках белок выпадает в осадок.

4.9. Осаждение белков органическими растворителями

Белки не растворяются во многих органических растворителях (спирте, ацетоне, эфире и др.). В зависимости от природы белка для его осаждения требуются различные концентрации спирта. Органические растворители связывают воду и вызывают дегидратацию мицелл белка, тем самым понижая его устойчивость в растворе. При этом осаждаются белки только из нейтральных и слабокислых растворов, особенно в присутствии электролитов (ионы соли связываются коллоидными частицами белка и снимают заряд).

Кратковременное воздействие органических растворителей сохраняет белок в естественном состоянии; при продолжительном взаимодействии со спиртом он подвергается денатурации.

Ход работы

В пробирку наливают 5 капель 1% раствора яичного белка и 20 капель спирта или ацетона, в результате чего раствор мутнеет. При добавлении нескольких капель насыщенного раствора хлорида натрия выпадает осадок белка. Результаты проведенных опытов записываются в форме таблицы 3.

 

Результаты опытов Таблица 3.

Группа осадителей Реактивы Характер и цвет осадка Чем обусловлена реакция

 

5. СОСТАВЛЕНИЕ ОТЧЕТАОтчет составляется с указанием цели, задания, включая экспериментальные данные, таблицы и выводы. 6. ВОПРОСЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ

6.1. Какие уровни структурной организации белковой молекулы Вы знаете? Какие связи участвуют в их стабилизации?

6.2. Что такое денатурация белка? Какие уровни структурной организации при этом разрушаются?

6.3. Какие денатурирующие агенты Вам известны? Какие связи в молекуле белка они преимущественно разрушают?

6.4. От чего зависит растворимость белка? Какие факторы стабилизируют белок в растворе?

6.5. Что понимают под обратимым и необратимым осаждением белков? Какие реакции осаждения белков являются обратимыми? Какие реакции осаждения белков необратимы?

6.6. Чем обусловлены необратимые реакции осаждения белков? Применение их в медицинской практике.

6.7. Будет ли коагулировать белок из раствора в присутствии избытка кислоты или щелочи? Почему?

6.8. Будет ли происходить осаждение белка при действии: 1) низких концентраций раствора хлорида натрия; 2) высоких концентраций раствора хлорида натрия; 3) низких концентраций раствора хлорида ртути?

6.9. Что такое высаливание белков? Для каких целей используется высаливание в медицине?

6.10. Чем обусловлен заряд белковой молекулы в растворе?

6.11. Дайте определение изоэлектрической точке белка. Как можно определить ИЭТ белка?

6.12. Определите направление движения белка с pI = 4,6 при фракционировании методом электрофореза в буферном растворе с рН = 8,2.

Тема: ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

1. ЦЕЛЬОпределить общий белок в сыворотке крови 2. ЗАДАЧИ2.1. Количественное определение общего белка в сыворотке крови биуретовым методом 3. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Содержание общего белка в сыворотке (плазме) крови можно характеризовать понятиями нормо-, гипо- и гиперпротеинемия, под которыми подразумеваются состояния, сопровождающиеся нормальной (не выходящей за пределы физиологических колебаний), пониженной или повышенной его концентрацией. Нормальное содержание общего белка в сыворотке крови составляет: у взрослых - 65-85 г/л, у новорожденных - 46-60 г/л, у детей до 2 лет – 51-75 г/л, старше 2 лет - 60-85 г/л.

Изменения уровня общего белка могут быть как абсолютными, так и относительными. Последние обычно отмечаются при увеличении (уменьшении) объема крови. Так, гидремия («водное» отравление), обильные вливания раствора глюкозы и других физиологических жидкостей, анурия, гиперсекреция антидиуретического гормона и альдостерона, которые способствуют задержке воды в организме, приводят к развитию относительной гипопротеинемии; при дегидратации (обезвоживании) вследствие потери жидкости при неукротимой рвоте, профузных поносах, холере, несахарном диабете, усиленном потоотделении (лихорадке), полиурии обнаруживается относительная гиперпротеинемия.

При подавляющем большинстве заболеваний внутренних органов, сопровождающихся сдвигами в белковом обмене, обнаруживается гипопротеинемия, носящая обычно вторичный, приобретенный характер (первичная гипопротеинемия встречается сравнительно редко, является генетически детерминированной и возникает вследствие дефектов генов, кодирующих определенные белки сыворотки, например – анальбуминения, агаммаглобулинемия и др.).

Абсолютная гипопротеинемия выявляется при патологических состояниях, при которых наблюдается снижение биосинтеза, усиление катаболизма или увеличение потерь белка. Наиболее частыми причинами ее являются:

 

1. Недостаточное поступление белка с пищей, наблюдаемое обычно при недоедании, голодании, опухолях, сужении пищевода, нарушении функции желудочно-кишечного тракта (вследствие ухудшения переваривания и всасывания белковых компонентов пищевых продуктов), при продолжительных воспалительных процессах в кишечнике. По мнению А.А. Покровского, даже несбалансированный аминокислотный состав пищи может иногда приводить к гипопротеинемии.

2. Подавление протеосинтетической функции печени, наблюдаемое при паренхиматозных гепатитах, а также интоксикациях, обусловленных длительными нагноительными процессами, злокачественными новообразованиями, действием некоторых химических ядов. Пораженные печеночные клетки, являющиеся местом образования альбуминов, фибриногена и части глобулинов, не в состоянии синтезировать белки плазмы крови в достаточном количестве, вследствие чего развивается гипопротеинемия, обусловленная в основном гипоальбуминемией и гипофибриногенемией.

3. Повышение распада белка в организме, вызванные потребностью в возмещении больших энергетических затрат, связанных с дефицитом пластических ресурсов (ожоговая болезнь, злокачественные новообразования, гипертиреоидизм, гиперкортицизм и т.д.).

4. Потеря белка организмом с кровью при острых и хронических кровотечениях, с мочой при нефротическом синдроме, через поврежденную слизистую кишечника (энтеропатии) и кожу (псориаз, обширные ожоги и др.).

Пониженное содержание белка в плазме крови отмечается и при некоторых физиологических состояниях, например, у женщин в последние месяцы беременности и в период лактации.

Следует отметить, что для обеспечения нормальных процессов жизнедеятельности организм при гипопротеинемии утилизирует прежде всего альбуминовую фракцию белков плазмы крови. При усиленном расходовании альбуминов, обусловливающих в основном онкотическое давление крови, развиваются отеки, которые отмечаются при патологических состояниях, сопровождающихся уменьшением содержания белка в плазме крови ниже 50 г/л. Также хорошо известно, что половина кальция плазмы крови связана с альбумином. Поэтому гипоальбуминемия почти всегда сопровождается гипокальциемией.

При этом происходит уменьшение только связанной с белком (физиологически неактивной) фракции кальция, что не приводит к развитию тетании и судорог. Одной из важных функций альбумина является связывание и транспортировка билирубина, свободных жирных кислот и многих лекарственных препаратов (например салицилатов, пенициллина и сульфаниламидов). Связанные с альбумином лекарственные вещества физиологически и фармакологически не активны. Значительное уменьшение альбумина плазмы, приводя к снижению связывающей способности, может повысить уровень свободных фракций указанных выше веществ, результатом чего могут быть токсические эффекты при обычных дозировках лекарственных препаратов.

Абсолютная гиперпротеинемия - явление сравнительно редкое. Обычно она вызывается усилением биосинтеза глобулинов в клеточных элементах системы фагоцитирующих мононуклеаров (вследствие их инфекционного или токсического раздражения) при длительно текущих хронических воспалительных процессах. Это наблюдается, в частности, при хроническом полиартрите, циррозах печени и некоторых хронических процессах.

Значительная и стойкая гиперпротеинемия - до 120 г/л и выше фиксируется при миеломной болезни (плазмоцитоме), макроглобулинемии Вальденштрема, в результате которых в плоских костях черепа появляются дополнительные очаги образования "ненормальных" или патологических белков - парапротеинов. Поэтому, если у больного обнаружено высокое содержание общего белка в плазме крови, его нужно дополнительно обследовать на выявление этих форм аномальных белков.

Обнаружение аномальных белков в сыворотке крови (парапротеинемия) чаще всего наблюдается при патологических состояниях, в основе генеза которых лежат злокачественные новообразования: миеломатоз, на долю которого приходится большинство случаев злокачественных парапротеинемий; В-клеточные лимфомы, в том числе хронические лимфолейкозы; заболевания, связанные с аномалиями тяжелых цепей иммуноглобулинов, к которым относят редко встречающуюся группу заболеваний, характеризующихся накоплением в плазме крови или моче аномального белка, идентифицируемого с фрагментом Н-цепи.

К группе парапротеинемий относится и криоглобулинемия, при которой в плазме крови больных выявляется присутствие криоглобулинов, к которым относят белки, выпадающие в осадок при охлаждении проб плазмы крови ниже температуры тела человека. Иногда, особенно если концентрация белка высока, внутрисосудистая преципитация может вызвать такие поражения кожи, как пурпура или феномен Рейно.

Из сказанного выше следует, что гипопротеинемия почти всегда связана с гипоальбуминемией, а гиперпротеинемия - с гиперглобулинемией.

При многих заболеваниях часто изменяется процентное соотношение отдельных белковых фракций, хотя общее количество белка в сыворотке крови остается в пределах нормы. Такое состояние носит название диспротеинемии. Так например, благодаря относительно небольшой молекулярной массе, потери значительных количеств альбумина происходят при условиях, для которых характерно повышение проницаемости биологических мембран, отделяющих плазму крови от межклеточной жидкости.

Поэтому при воспалительной реакции организма на повреждение, вследствие увеличения проницаемости сосудистой стенки, происходит «выпотевание» альбуминов в интерстициальную жидкость, что приводит к снижению его концентрации в плазме крови - гипоальбуминемии. Однако при этом в плазме крови резко возрастает доля глобулиновых фракций (прежде всего a-глобулинов, которые включают в свой состав белки-реактанты острой фазы, или g-глобулинов), что как правило не приводит к изменению концентрации общего белка сыворотки. В то же время отмечается резкое изменение соотношения различных белковых фракций плазмы крови.

 

4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ4.1. Количественное определение общего белка в сыворотке крови биуретовым методом

Известные в настоящее время методы количественного определения белков сыворотки крови можно подразделить на колориметрические, основывающиеся на цветных реакциях белков с определенными реактивами; спектрофотометрические, заключающиеся в измерении степени светопоглощения в ультрафиолетовой области и другие. Из колориметрических методов особого внимания заслуживают методы, основанные на биуретовой реакции. Они являются весьма точными, практически доступными и основаны на способности белков реагировать в щелочной среде с сернокислой медью, образуя комплексные соединения фиолетового цвета. При этом различия в интенсивности окрашивания комплексов, образованных альбуминами и глобулинами незначительно, что позволяет использовать данный метод для выявления уровня практически всех белков сыворотки крови.

Ход работы

К 5 мл рабочего раствора биуретового реактива добавляют 0,1 мл сыворотки крови. Через 30 минут пробу колориметрируют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 10 мм при зеленом светофильтре (длина волны 546 нм ) против контроля, который готовят путем прибавления к 5 мл рабочего раствора биуретового реактива 0,1 мл 0,9% NaCI. Расчет ведут по калибровочной кривой.

Построение калибровочной кривой. Из 10% стандартного раствора белка в 0,9% растворе NaCI готовят рабочие стандартные растворы так, как указано в таблице 10 (0,1 мл основного стандартного раствора содержит 0,01 г белка). Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабочего раствора и вносят в пробирки, содержащие 5 мл биуретового реактива. Через 30-60 минут измеряют экстинкцию стандартных проб на ФЭКе против контроля.

Средние значения оптической плотности, соответствующие различным концентрациям, наносят на миллиметровую бумагу. На оси абсцисс откладывают значения концентрации стандартных растворов белка, на оси ординат - соответствующие им величины оптической плотности. Через полученные точки проводят прямую линию.

Данные для построения калибровочного графика для количественного определения концентрации общего белка в сыворотке крови представлены в таблице 4.

Данные для построения калибровочного графика Таблица 4

 

№ пробирки Стандартный раствор белка, мл 0,9% NaCl, мл Содержание белка в пробе, г Концентрация, г%
0,4 0,6 0,04
0,6 0,4 0,06
0,8 0,2 0,08
1,0 - 0,10
5. СОСТАВЛЕНИЕ ОТЧЕТАОтчет составляется с указанием цели, задания, включая экспериментальные данные, таблицы и выводы. Тема: РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВЫХ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ1. ЦЕЛЬИзучить хроматографический метод разделения и определения белковых аминокислот. 2. ЗАДАЧИ2.1. Подготовить носитель.2.2. Провести хроматографию на бумаге отдельных аминокислот.2.3. «Проявить» хроматограмму.2.4. Определить коэффициенты распределения аминокислот.2.5. Провести разделение и определение аминокислот в исследуемом растворе.2.6. Сделать выводы и оформить отчет. 3. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ Для быстрого разделения белковых аминокислот широко используют метод круговой хроматографии на бумаге. Хроматография на бумаге является одной из разновидностей распределительной хроматографии. Распределительная хроматография основана на различной растворимости разделяемых веществ в двух (или нескольких) малосмешивающихся (или несмешивающихся) жидкостях. Одна из жидкостей должна быть полярной, а другая – неполярной.Аминокислоты обладают различной растворимостью. Более гидрофобные лучше растворяются в неполярных растворителях (подвижная фаза), а гидрофильные – в полярных (неподвижная фаза). В качестве носителя неподвижного растворителя применяют чистую целлюлозу в виде специальной фильтровальной бумаги. Хроматографическая бумага должна обладать высокой чистотой и равномерной плотностью. Неподвижной фазой в бумажной хроматографии в большинстве случаев является вода, всегда присутствующая в фильтровальной бумаге. В качестве подвижной фазы выступают различные органические вещества или их смеси, предварительно насыщенные водой. Техника бумажной хроматографии состоит в следующем. На хроматографическую бумагу на место старта наносится капля исследуемой смеси. Бумага высушивается при комнатной температуре и помещается в закрытый сосуд (хроматографическую камеру), в котором она непрерывно смачивается растворителем. Растворитель при этом равномерно распределяется по бумаге в определенном направлении. Вещества, входящие в состав смеси, вместе с ним перемещаются по бумаге в том же направлении, но с различной скоростью, и поэтому концентрируются на разном расстоянии от места старта. Чем меньше растворимость аминокислоты в воде и чем больше ее растворимость в феноле или другом органическом растворителе, тем быстрее она будет двигаться вместе с ним и тем дальше будет концентрироваться от места старта. Наоборот, чем больше растворимость аминокислоты в воде и чем меньше ее растворимость в органическом растворителе, тем медленнее она будет двигаться вместе с ним, концентрируясь вблизи от места старта. Если разделяемые вещества не окрашены, хроматограмму «проявляют», т. е. проводят качественные реакции или обнаруживают их другими методами. Идентификация каждого компонента по окрашенному пятну производится на основании расчета величины коэффициента распределения (Rf). Коэффициент распределения вещества равен отношению расстояния Х (в мм), пройденного веществом от места его нанесения (места старта) до фронта пятна, к расстоянию Y (в мм), пройденному растворителем от места старта до фронта растворителя: Rf = Х/Yгде Х – расстояние, пройденное веществом от места старта до фронта пятна, мм;Y – расстояние, пройденное растворителем от места старта до фронта растворителя, мм. Коэффициент распределения для каждого соединения индивидуален. Он зависит от многих факторов: температуры, состава растворителя, качества бумаги и т. д. Поэтому Rf является постоянной величиной только при данных конкретных условиях. Зная значение Rf отдельных веществ, можно определить состав смеси, идентифицировав входящие в нее вещества. Для этого надо провести хроматографическое разделение смеси в условиях, аналогичных тем, при которых определялись коэффициенты распределения веществ, входящих в ее состав. Радиальную хроматографию на бумаге проводят в чашках Петри. В этом случае растворитель перемещается от центра круга к периферии, перенося с собой аминокислоты, которые концентрируются на различном расстоянии от центра, образуя круги. Их можно обнаружить, проведя нингидриновую реакцию. Хроматография широко применяется для разделения малых количеств веществ, которые близки по своему составу и свойствам, в частности для определения аминокислотного состава белка и различных биологических жидкостей. 4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ4.1. Подготовка носителя Для проведения круговой хроматографии на бумаге носитель готовят из хроматографической бумаги. Для этого вырезают из нее квадрат, сторона которого на 5–10 мм больше диаметра чашки Петри. Затем делают два параллельных разреза приблизительно на расстоянии 3–4 мм друг от друга от середины одной из сторон до центра квадрата. При всех операциях бумагу держат только за углы. Образовавшуюся полоску отгибают перпендикулярно плоскости диска так, чтобы образовался четкий сгиб. Проделывают это, держась пальцами за самый конец полоски. После образования сгиба конец, к которому прикасались пальцы, срезают ножницами.4.2. Проведение хроматографию на бумаге отдельных аминокислот На место сгиба наносят 1 каплю раствора аминокислоты и высушивают на воздухе. В хроматографическую камеру, которая представляет собой закрытый сосуд, образованный двумя одинаковыми по диаметру крышками или донышками чашки Петри, наливают растворитель, который предварительно тщательно перемешивают. Хроматографическую бумагу помещают в хроматографическую камеру так, чтобы отогнутая полоска находилась в растворителе. Постепенно растворитель перемещается по полоске и смачивает бумагу. Когда фронт растворителя на бумаге будет иметь диаметр 80–90 мм, ее достают из камеры и карандашом отмечают границу фронта растворителя. После этого бумагу сразу же помещают в сушильный шкаф при температуре 70–80ºС на 8–10 мин для удаления растворителя и фиксации аминокислот. Внимание! Достав бумагу из камеры, ее нужно как можно быстрее поместить в сушильный шкаф, так как ее подсушивание при комнатной температуре может привести к неправильным результатам.4.3. «Проявление» хроматограммы В ванночку наливают раствор нингидрина. Высушенную бумагу быстро окунают в него, кладут на грани сухой крышки (или донышка) чашки Петри и сразу же (немедленно!) помещают на 5–6 мин в сушильный шкаф при температуре 90–100°С. После высушивания на диске появляется кольцо соответствующей аминокислоты.4.4. Определение коэффициентов распределения (Rf) индивидуальных аминокислот При помощи линейки измеряют расстояние, которое прошла каждая из аминокислот от места старта (места нанесения аминокислоты) до фронта пятна, и расстояние, которое прошел растворитель. После этого по формуле (1) вычисляют значение коэффициента распределения (Rf) для каждой аминокислот.4.5. Проведение хроматографического разделения аминокислот в контрольном растворе Хроматографическое разделение аминокислот в контрольном растворе проводят аналогично пп. 4.1–4.4. Определяют коэффициенты распределения для всех проявившихся на хроматограмме аминокислот (аналогично п. 4.5). Сравнивают полученные значения Rf со значениями коэффициентов распределения индивидуальных аминокислот и определяют, какие аминокислоты находились в исследуемом растворе.4.6. Делают выводы о разделении и определении аминокислот методом круговой хроматографии на бумаге.5. СОСТАВЛЕНИЕ ОТЧЕТАОтчет составляется с указанием цели, задания, принципа хроматографического метода, включает экспериментальную часть и выводы. В экспериментальной части отражаются этапы проведения работы с кратким их описанием, проводятся расчеты коэффициентов распределения аминокислот и делаются выводы. Полученные хроматограммы с указанием, каким аминокислотам они принадлежат, прикладываются к отчету. 6. ВОПРОСЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ6.1. В чем сущность распределительной хроматографии?6.2. Каковы особенности хроматографии на бумаге?6.3. В чем состоит техника бумажной хроматографии?6.4. Как производится идентификация компонентов в разделяемой смеси?6.5. Что называют коэффициентом распределения?

Тема: ХРОМОПРОТЕИДЫ

1. ЦЕЛЬ

Количественное определение гемоглобина крови гемиглобинцианидным методом

 

2. ЗАДАЧИ2.1. Количественное определение гемоглобина крови гемиглобинцианидным методом2.2. Сделать выводы и оформить отчет. 3. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Белки, которые, кроме аминокислот, содержат небелковые компоненты называются сложными (холопротеинами или протеидами). Небелковую часть таких двухкомпонентных систем называют простетической группой, а белковую – апопротеином. Холопротеин может диссоциировать на компоненты: холопротеин Û апопротеин + простетическая группа. Направление данной реакции зависит от прочности связи этих составляющих холопротеина.

Простетическая группа может быть представлена различными по химической природе соединениями. В зависимости от ее строения и свойств сложные белки подразделяются на: 1) хромопротеины, содержащие в качестве небелковой части окрашенный компонент; 2) гликопротеины, включающие в свой состав углеводы и их производные; 3) нуклеопротеины, простетическая группа которых представлена нуклеиновыми кислотами; 4) липопротеины, представляющие собой комплексы липидов и белков; 5) фосфопротеины, в состав которых входит остаток ортофосфорной кислоты; 6) металлопротеины, имеющие в составе своей молекулы ионы металлов.

 

4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ4.1. Количественное определение гемоглобина крови гемиглобинцианидным методом

Гемоглобин окисляют железосинеродистым калием в метгемоглобин (гемиглобин). Последний образует с ацетонциангидрином окрашенный цианметгемоглобин (гемиглобинцианид), который определяют колориметрически.

Ход работы

В пробирку к 5 мл трансформирующего раствора добавляют 0,02 мл крови (достигая при этом разведения в 251 раз). Содержимое пробирки тщательно перемешивают и оставляют стоять на 10 минут, после чего фотометрируют при зеленом светофильтре (длина волны 500-560 нм) в кювете с толщиной слоя 10 мм против трансформирующего раствора. При тех же условиях измеряют оптическую плотность стандартного раствора.

Расчет содержания гемоглобина производят по формуле:

Hb (г%) = Еопст × С × К × 0,001,

где Еоп и Ест – экстинкция опытной и стандартной проб соответственно; С – концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе, мг% (59,75 мг%); К – коэффициент разведения крови (251); 0,001 – коэффициент для пересчета мг% в г%.

Нормальное содержание гемоглобина в крови у мужчин составляет 13,2-16,4 г% (132-164 г/л), у женщин 11,5-14,5 г% (115-145 г/л).

Снижение концентрации гемоглобина в крови является основным лабораторным симптомом анемии. При этом содержание гемоглобина варьирует в широких пределах в зависимости от формы анемии и ее степени. Так, при наиболее частой железодефицитной анемии у большинства больных отмечается относительно умеренное снижение гемоглобина (85-114 г/л), а более выраженное уменьшение (60-84 г/л) наблюдается реже. Значительное снижение гемоглобина (50-80 г/л) в крови характерно для острой кровопотери, гипопластической анемии, гемолитической анемии в стадии гемолитического криза.

Повышение концентрации гемоглобина в крови может наблюдаться при миелопролиферативных заболеваниях (эритремии) и симптоматических эритроцитозах (уровень гемоглобина повышается при этом до 180-210 г/л), при сгущении крови вследствие дегидратации. Физиологическое увеличение содержания гемоглобина свойственно новорожденным.

 

5. СОСТАВЛЕНИЕ ОТЧЕТАОтчет составляется с указанием цели, задания, экспериментальные данные и выводы. 6. ВОПРОСЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ6.1. Что такое сложные белки? Какие составные части выделяют в сложных белках?

6.2.Как и по какому принципу можно классифицировать сложные белки?

6.3.К какой группе сложных белков относится гемоглобин и из каких компонентов он состоит?

6.4. Где локализуется гемоглобин в организме человека? Какова его биологическая роль?

6.5. Что представляет собой глобин и какова его структура в различных гемоглобинах человека?

6.6.Назвать разновидности физиологических гемоглобинов?

6.7.К каким заболеваниям могут привести гемоглобинопатии?

6.8.К какой группе сложных белков относится миоглобин? Какова его биологическая роль?

6.9.Каковы особенности строения гемоглобина и миоглобина?

6.10. Какова концентрация гемоглобина в крови в норме?

6.11. Каким методом можно количественно определить содержание гемоглобина в крови? В чем его принцип?


Дата добавления: 2015-07-08; просмотров: 226 | Нарушение авторских прав


Читайте в этой же книге: Определение сиаловых кислот в сыворотке крови методом Гесса. | Определение сиаловых кислот в сыворотке крови методом Гесса | Определение прочности связи между белковым и липидным компонентами липопротеидов ткани печени по качественной пробе Л. Делямуре | Открытие действия тирозиназы картофеля | Коферментная функция водорастворимых витаминов |
<== предыдущая страница | следующая страница ==>
Исследование составляющих уравнений баланса активных и реактивных мощностей.| Краткая характеристика нуклеиновых кислот клеток высших организмов

mybiblioteka.su - 2015-2017 год. (0.286 сек.)