РЕПАРАЦИЯ - свойственное всем клеткам живых организмов восстановление нативной структуры ДНК в случае ее нарушения.

РЕПАРАЦИЯ - свойственное всем клеткам живых организмов восстановление нативной структуры ДНК в случае ее нарушения.

Причины появления повреждений в ДНК:

• Ошибки репликации

• Повреждения ДНК эндогенными агентами
Гидролиз (депуринизация, дезаминирование)

• Повреждения ДНК экзогенными агентами
облучение, повреждение химическими агентами (например, алкилирование)

• Репликация «через повреждения» с использованием полимераз, отличающихся низкой точностью копирования

Гидролиз: спонтанная депуринизация – сахарофосфатный остов остается, дезаминирование – замена аминогруппы на кислород (цитозин переходит в урацил, CG->TA, так как урацила нет в ДНК; гуанин может переходить в ксантин, который может образовывать пару с цитозином с двумя водородными связями, и в итоге мутагенного эффекта нет; аденин может переходить в гипоксантин, который образует пару с цитозином, AT->GC). Другой процесс, который также может приводить к модификации оснований – алкилирование (включение этильной/метильной группы). Этому эффекту чаще всего подвергаются 6 позиция в гуанине и 4 позиция в тимине, включение алкильных групп тоже изменяет характер спаривания. Алкилированный гуанин не может образовывать классическую Уотсон-Криковскую пару с цитозином, зато он образует пару с тимином, GC->AT (т.е. опять нарушение первичной структуры ДНК и мутация). Алкилирование по тимину тоже изменяет характер спаривания, 4-этилтимин образует пару с гуанином, тоже получается мутация, TA->GC. Еще очень частое событие - образование тимидиновых димеров под воздействием УФ-света, происходит между соседями сверху-снизу и два основания теперь химически ковалентно соединены, это приводит к остановке репликации (такое событие имеет достаточно высокую частоту из-за частых воздействий УФ-света, и если димеры не удаляются, то это приводит к ксеродерме). Еще довольно часто возникают разрывы.

Cтратегии коррекции повреждений:

1) Ошибки репликации: многоэтапная стратегия, прежде всего - исправление ошибок ДНК полимеразой (3’-5’ экзонуклеазная активность), в подавляющем количестве случаев сама полимереза чувствует нарушение Уотсон-Криковской пары, останавливает репликацию, цепь ДНк переносится в экзонуклеазный центр, далее удаление нуклеотида и возобновление лрепликации. Но этого все равно недостаточно, на этот случай есть репарация неспаренных оснований (mismatch repair) – распознает нарушения в геометрии ДНК (как и полимераза), удаляет нуклеотид, возвращает все к Уотсон-Криковской паре.

2) Повреждение ДНК эндогенными и экзогенными агентами, разные стратегии реализации в зависимости от типа повреждения. Некоторые повреждения можно удалить просто прямым удалением повреждений (например, просто расшить тимидиновые димеры). Но совсем так непосредственно происходит довольно редко, поэтому чаще реализуются другие стратегии: удаляется кусок ДНК с поврежденным нуклеотидом и на нормальной матрице по комплементарности строится заново. Если удаляется всего один нуклеотид, то это называется - эксцизия оснований (base excision repair). При более серьезном повреждении - эксцизия нуклеотидов (nucleotide excision repair), вырезается более протяженный участок ДНК (у прокариот чуть больше 10, у эукариот около 20 с небольшим). Но бывает так, что ничего не успели починить, а репликация уже идет, ее остановка может привести к апоптозу, поэтому выход – осуществление репликации, невзирая на повреждения - рекомбинация и черезблоковый синтез особыми полимеразами (не удаляет ошибок но позволяет продолжить репликацию), возникают мутации, но это лучше, чем сразу погибнуть.

Далее более подробное рассмотрение всех этих стратегий.

Прямое удаление повреждений.

Есть такой фермент – фотолиаза (у прокариот), который удаляет тимидиновые димеры – может просто взять и удалить неправильную сшивку. Энергию для расшивки этот фермент берет из видимого света, что было открыто случайно: облучали E.Coli сначала УФ-светом, а затем помещали их на обычный свет, после чего многие выживали. Каким-то образом этот фермент фиксирует квант света и восстанавливает структуру.

Все живые организмы (от E. Coli до человека) имеют О6-метилгуанин метил трансферазу (тоже прямое удаление повреждений), которая удаляет метильную (этильную) группу из позиции О6 гуанина. При этом фермент, который обладает SH-группой, необратимо связывается с удаленной с гуанина метильной (этильной) группой, после чего сам инактивируется. Это важная особенность этого фермента, так как обычно ферменты работают по циклам. Это довольно затратный процесс (фермент каждый раз нужно синтезировать заново), поэтому так удаляется мало повреждения. (Еще, вроде бы, этот фермент переносит также группы с метелированных фосфатов, и, таким образом, сам превращается в активатор транскрицпии)

Чаще используются механизмы удаления оснований и нуклеотидов, оба эти механизма есть и у прокариот, и у эукариот. В целом, механизмы похожи, но различаются в деталях.

Base excision repair (BER) эксцизия оснований.

Основной путь удаления модифицированных (в том числе окисленных) оснований и включенного по ошибке урацила (его довольно много в клетке, так как он компонент РНК). Различные ДНК-гликозилазы адресно узнают поврежденные основания и удаляют их, разрезая гликозидную связь (предварительно выворачивая). При этом возникает AP (апуриновый/апиримидиновый) сайт. Этот сайт узнается специальными клеточными АР эндонуклеазами, которые разрезают фосфодиэфирный остов ДНК рядом с AP сайтом. Разрыв должен быть внесен с обеих сторон и это может происходить по двум механизмам:

AP nucleotide удаляется экзонуклеазой/дезоксирибофосфодиэстеразой и «брешь» застраивается репаративной ДНК полимеразой.

В клетке большое количество ДНК-гликозилаз, которые узнают модифицированные основания, выворачивают их и отрезают:

Гликозилазы обладают определенной специфичностью в отношении определенного повреждения или очень узкого класса повреждений (если нет нужной гликозилазы, то повреждение никак не лечится). Поэтому всегда имеется целый набор этих ферментов, и этот набор разный у разных организмов. (Есть слайд, где перечислены гликозилазы человека, но, я думаю, это лишнее).

Основные типы повреждений, которые удаляются посредством BER:

1)Окисленные основания, в том числе 8-oкси-G, который спаривается с А, вызывая GC --> TA

2)Дезоксиурацил

3)Различные продукты алкилирования оснований (например, 3-meA)

4)Спонтанно возникающие апуриновые сайты

Все эти повреждения не блокируют репликацию (не такие уж они и опасные), но зато именно они и вызывают мутации.

Эксцизия нуклеотидов (nucleotide excision repair).

Этот механизм используется для коррекции более «серьезных» повреждений, которые блокируют репликацию (у человека таковыми являются, в частности, тимидиновые димеры). Особые белки узнают поврежденные участки ДНК и привлекают специальные нуклеазы, которые вносят разрывы на некотором расстоянии перед повреждением и на некотором расстоянии после него. Фрагмент ДНК, содержащий повреждение, удаляется, и образовавшаяся брешь застраивается репаративной ДНК полимеразой. У E.Coli в этом процессе участвуют 4 белка, названные по названиям генов: UvrA, UvrB, UvrC, UvrD. UvrA и UvrB сканируют ДНК и выявляют поврежденные места (главный признак – нарушение геометрии). После выявления поврежденного участка UvrA удаляется из комплекса, а UvrB вызывает локальную денатурацию поврежденного участка (участок становится еще более узнаваем для других ферментов) и привлекает UvrC. Комплекс UvrBС вносит однонитевые разрывы с 5’- и 3’- конца от повреждения. DNA хеликаза UvrD обеспечивает удаление из дуплекса фрагмента ДНК (рвет еще и водородные связи), содержащего повреждение. DNA Pol I застраивает брешь и лигаза «зашивает» однонитевой разрыв.

У эукариот изучение этого механизма репарации происходило из-за такого заболевания, как ксеродерма (УФ-лучи ведь есть и в обычном солнечном свете, что у людей с этим заболеванием приводит к тяжелым повреждениям кожи). Названия многих белков человека, участвующих в NER происходят от названия этого заболевания. 8 генов, идентифицированны в экспериментах по комплементации деффектов при слиянии клеток от разных больных: от XPA до XPG и еще hHR23B. У эукариот механизм эксцизии нуклеотидов в общих чертах схож с прокариотическим, но существенно отличается в деталях. Повреждения в ДНК могут узнаваться либо особой группой белков 1)global NER, либо РНК-полимеразой 2)transcription-coupled NER.

1) XPC в комплексе с hHR23B узнают повреждения и вызывают локальную денатурацию ДНК. XPA стабилизирует комплекс и привлекает другие белки. XPB+XPD - субъединицы TFIIH. TFIIH является общим транскрипционным фактором, обладающим хеликазной активностью (участвует в инициации транскрипции и эукариот). В данном случае TFIIH расширяет локально-денатурированный участок. Участок теперь еще более узнаваем. XPF – эндонуклеаза, вносящая 5’-разрыв. XPG – эндонуклеаза, вносящая 3’-разрыв. RPA расталкивает все остальное и помогает правильно позиционировать нуклеазы по краям расплавленного участка ДНК. (Функции XPE не понятны. In vitro этот белок не нужен.) Таком образом, фрагмент ДНК выбрасывается, затем синтезируется новый и зашивается ДНК-лигазой (все как обычно). Такой механизм называется global genome NER, так как он реализуется во всем геноме. Есть еще второй механизм,

2) Возможно узнавание также полимеразой. Повреждения ДНК могут вызвать остановку элонгирующей РНК-полимеразы (РНК-полимераза2) (включает транскрипцию и видит повреждения). Ферменты NER узнают такой задержанный комплекс и процессируют его подобно комплексу XPA-XPC –hHR23B. Это называется – ассоциированная с транскрипцией эксцизия оснований.

Исправление ошибок репликации (Мismatch repair)

ДНК полимеразы (даже те, у которых есть корректирующая активность) все равно делают ошибки, которые надо исправлять

Система репарации ошибок репликации должна быстро находить ошибки и различать родительскую и новосинтезированную цепи. В этой системе репарации есть специальные молекулы, которые едут и ищут ошибки. У E. Coli MutS сканирует ДНК. MutS сильно похож на кольцо, он плотно охватывает ДНК и за счет этого очень хорошо чувствует неправильную геометрию канонической спирали. Найдя ошибку, MutS изменяет конфигурацию, что закрепляет молекулу белка на цепи ДНК (он расширяет малую бороздку и сужает большую бороздку ДНК). Вслед за этим последовательно привлекаются MutL и MutH

Белки, аналогичные MutS, есть и у эукариот:

гомологи MutS (MSH — MutS homolog) образуют два гетеродимерных комплекса

-- MSH2-MSH6 (MutSα) узнает неспаренные нуклеотиды и короткие «инделы»

-- MSH2-MSH3 (MutSβ) узнает длинные «инделы»

У эукариот обнаружены гомологи MutS и MutL; гомолога MutH не обнаружено.

Узнавание неправильного спаривания происходит с неодинаковой эффективностью. Эксперименты по связыванию с ДНК in vitro и репарации гетеродуплексов in vivo показали, что MMR узнает все комбинации неспаренных оснований, кроме C:C, а также короткие <4 п.н. делеции и инсерции («инделы» - в одной цепи ничего комплементарного). Неправильные пары G:T and A:C и инсерции/делеции в 1 п. особенно хорошо узнаются. Эти нарушения являются наиболее частыми ошибками ДНК-полимераз.

Еще раз про E.Coli: MutS из двух субъединиц едет и узнает неправильную пару, зовет MutL и MutH. MutH (эндонуклеаза) вносит однонитевой разрыв в ДНК, после чего хеликаза (UvrD) (расплетает) и одна из экзонуклеаз удаляют фрагмент ДНК от разрыва и до неспаренного нуклеотида (включая последний). Брешь застраивается ДНК полимеразой.

Но важно удалить именно поврежденное основание, то есть разрыв должен быть внесен именно в новосинтезированную цепь, при этом родительская должна остаться нетронутой (ошибочно включенный нуклеотид должен находиться в новосинтезированной цепи ДНК). у прокариот для отличия цепей служат модификации ДНК, в частности, метилирование аденина в GATC (Dam-метилирование) (у E.Coli, ей это нужно для отличия собственной ДНК от чужеродной ДНК вирусов). Так вот, в какое-то короткое время после репликации дочерняя цепь еще не метелирована. MutL распознает метильные группы на родительской цепи, и тогда MutH уже приходит и делает разрыв в дочерней.

У эукариот есть какой-то схожий механизм, но он пока не ясен. Возможно, в этом участвует CpG-метелирование. Но не факт. Или может быть, это распознавание как-то связано с наличием разрывов.

Микросателлитная нестабильность (также относится к MMR). – при наличие большого количества коротких многочисленных повторов полимераза может просто проскочить, в результате чего образуются короткие петельки (инсерции). Так вот они распознаются также с помощью MMR и исправляются.

Есть быстроделящиеся клетки, в которых ошибки не удается исправить и репликация продолжается. В таких случаях нужна либо SOS-репарация, либо обход препятствия посредством смены матричных цепей (чаще у эукариот) (продолжение репликации с сохранением ошибки в одной из родительских цепей):

Вилка не может пройти, поэтому использует новосинтезированную цепь, после чего возвращается назад, впоследствии нужна будет репарация. Важно то, что донором гомологии может быть именно новосинтезированная цепь.

Также может помочь рекомбинация. Существут возможность, что после остановки вилки репликация начнется снова после препятствия (с нового праймера). Тогда напротив препятствия будет брешь. В последствии может произойти гомологичная рекомбинация,

(обмен участками новосинтезированной цепи), в результате чего появится донор гомологии и брешь будет застроена.

SOS репарация у Е. Сoli.

Данный тип репарации необходим для прохождения репликативной машиной повреждений. 1 этап – сигналинг о повреждении. RecA связывается с однонитевой ДНК и образует ДНК-белковые филаменты (однонитевые участки ДНК образуются при остановке репликативных вилок, так как полимераза3 перестает работать, а хеликаза дальше расплетает). В клетке есть много генов, которые в норме не работают (как раз и нужны для прохождения репликации через повреждения), иначе в норме в клетке будет много мутаций. LexA - регулятор транскрипции генов, кодирующих участвующие в репарации повреждений ДНК белки (димеры Lex A связываются с SOS боксами (20 п.н. консенсусы) в операторах генов репарации и ингибируют транскрипцию). Филаменты RecA стимулируют аутопротеолиз LexA, в результате чего происходит активация генов SOS-репарации.

UmuDC оперон – ген, кодирующий особую черезблоковую полимеразу – она может проходить через повреждения, включая при этом рандомно любой нуклеотид. После прохождения повреждения ее необходимо убрать и опять посадить нормальную репликативную полимеразу (иначе будет очень много мутаций из-за случайного включения нуклеотидов). Как именно работает этот самый оперон - UmuD повергается автопротеолитическому расщеплению с образованием активного фрагмента UmuD’. UmuD’ активирует черезблоковую полимеразу UmuC. Комплекс (UmuD’)2-UmuC теперь называют ДНК полимераза V (эта полимераза осуществляет репликацию через AP сайты, тимидиновые димеры и ряд других повреждений). Важно, чтобы эта полимераза работала недолго. Для работы черезблоковой полимеразы нужен ее контакт с PCNA и RecA-филаментом. При движении полимераза разрушает этот самый филамент и как только он разрушается полностью, черезблоковая полимераза сваливается и садится нормальная репликативная3 (скотосбрасыватель). Черезблоковая полимераза успевает синтезировать всего пару нуклеотидов. У каждого организма целый набор черезблоковых полимераз.

Репарация двунитевых разрывов.

Двунитевые разрывы в ДНК возникают под действием ионизирующего излучения, окислительного стресса,под действием некоторых химических агентов, в частности, ингибиторов ДНК топоизомеразы II (существуют в том числе природные ингибиторы). топоизомеразы нужны для релаксации ДНК, но если если действуют их ингибиторы, то остается двунитевой разрыв. С однонитевыми разрывами гораздо проще – они сшиваются лигазами. Существует два основных пути репарации двунитевых разрывов: гомологичная рекомбинация и негомологичное соединение концов ДНК.

Гомологичная рекомбинация: необходим донор гомологии (гомологичная хромосома – но это никогда у эукариот, или гомологичная хроматида – есть сразу после репликации).

Экзонуклеазы создают свободный 3’-конец, который внедряется в соседний дуплекс, после чего происходит репликация с нормальной матрицы достаточно длинного фрагмента, затем второй переброс, в итоге образуется классическая структура Холидея.

Но нужна особая система внедрения, ведь ДНК стабильная (какой-то белок, облегчающий инвазию цепи). У E. Coli ключевым компонентом системы гомологичной рекомбинации

является белок RecA, который связывается с однонитевой ДНК и обеспечивает ее инвазию в двойную спираль с образованием D-петли.

Это было выяснено в экспериментах, в которых смешивали одно- и двунитевую ДНК (они содержали какой-то участок гомологии), и ничего не происходило. А потом добавляли RecA и часть двойной спирали вытеснялась.

В эукариотических клетках гомологом recA является Rad51. Покрытая Rad51 однонитевая ДНК внедряется в гомологичный участок сестринской хроматиды с образованием D петли. 3’-конец внедрившейся цепи достраивается ДНК полимеразой и отжигается с 3’-концом комплементарной цепи исходного дуплекса. Бреши застраиваются и однонитевые разрывы лигируются. В итоге получаются две восстановленные ДНК.

У эукариот есть альтернативный аналог этого прокариотического процесса, с полным восстановлением гомологии, без ошибок:

Но все-таки, гомологичная рекомбинация обычно чаще используется прокариотами, а вот эукариоты обычно лечат двунитевые разрывы негомологичным соединением концов – просто расчет на то, что свободные разорванные концы рядом. Ku (очередное кольцо) – заходит со стороны разрыва и удерживает ДНК, Далее оно привлекает все ферменты, в том числе ДНК-зависимые протеинкиназы. Далее происходит процессирование концов. Но точно воспроизвести исходную структуру не получается. Репликации здесь совсем нет. Концы делаются лигируемыми за счет утраты части информации (но эта информаия может быть и неважная). Но могут также быть и различные перестройки, в том числе приводящие к опухолям. В конце лигирование ДНК. Ku – это очередное кольцо, оно связывается и обхватывает ее, при этом удерживая, два витка вокруг ДНК, работает в виде димера (разрыв при этом доступен другим белкам).

Дата добавления: 2015-09-29