ОГЛАВЛЕНИЕ
ПРЕДИСЛОВИЕ РЕДАКТОРА................................................................................. 9
ПРЕДИСЛОВИЕ АВТОРА..................................................................................... 12
ЧАСТЬ I. МЕХАНИЗМЫ ХРАНЕНИЯ И РЕАЛИЗАЦИИ
ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ................................. 17
ВВЕДЕНИЕ 18
ГЛАВА 1. ГЕНОМ................................................................................................ 25
1.1. Гены и хромосомы.......................................................................... 28
1.2. Геном прокариот.............................................................................. 30
1.2.1. Геном вирусов.................................................................................... 31
1.2.2. Нуклеоид бактериальной клетки...................................................... 32
1.2.3. Геном архебактерий.......................................................................... 35
1.2.4. Минимальный размер генома одноклеточных организмов............ 37
1.3. Геном эукариот................................................................................ 40
1.3.1. Последовательности нуклеотидов эукариотического генома........ 41
1.3.2. Хроматин............................................................................................ 45
1.3.3. Роль ДНК-топоизомераз в обеспечении структуры и
функционирования хроматина................................................... 55
ГЛАВА 2. РЕАЛИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ ПРИ
ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ...................................................................... 60
2.1. Транскрипция................................................................................... 61
2.1.1. ДНК-зависимые РНК-полимеразы.................................................... 62
2.1.2. Единицы транскрипции (транскриптоны)......................................... 72
2.1.3. Этапы транскрипции.......................................................................... 80
2.1.4. Хроматин во время транскрипции.................................................. 112
2.2. Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации
РНК................................................................................................ 124
2.2.1. Процессинг РНК у бактерий............................................................ 125
2.2.2. Редактирование пре-мРНК............................................................. 131
2.2.3. Другие модификации эукариотических мРНК................................ 143
2.2.4. Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего
основные реакции метаболизма транскриптов РНК-
полимеразы II............................................................................ 163
2.3. Функциональная компартментализация ядра......................... 168
2.3.1. Интерфазные хромосомы в ядре................................................... 169
2.3.2. Ядрышко........................................................................................... 171
2.3.3. Пространственная организация синтеза мРНК............................. 173
2.3.4. Ядерные тельца и домены.............................................................. 176
2.3.5. Компартментализованное ядро...................................................... 178
2.4. Биосинтез белка рибосомами бактерий.................................... 180
2.4.1. Рибосомы......................................................................................... 180
2.4.2. Этапы биосинтеза белка................................................................. 187
2.4.3. Антибиотики, действующие на уровне трансляции...................... 197
2.5. Трансляция у эукариот................................................................. 200
2.5.1. Особенности первичной структуры эукариотических мРНК......... 201
2.5.2. Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами.... 202
2.5.3. Элонгация полипептидных цепей................................................... 212
2.5.4. Терминация трансляции................................................................. 213
2.5.5. Трансляция в митохондриях........................................................... 215
2.5.6. Трансляция в хлоропластах............................................................ 219
ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ ПУТИ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ............ 223
3.1. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у
прокариот.................................................................................... 225
3.1.1. Регуляция на уровне инициации транскрипции............................ 225
3.1.2. Регуляция синтеза РНК на уровне элонгации и терминации....... 229
3.2. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у
эукариот....................................................................................... 238
3.2.1. Передача сигнала и вторичные мессенджеры.............................. 241
3.2.2. Механизмы позитивной регуляции транскрипции......................... 259
3.2.3. Механизмы негативной регуляции транскрипции......................... 297
3.2.4. Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии
генов.......................................................................................... 304
3.2.5. Импринтинг...................................................................................... 318
3.2.6. Метилирование ДНК в регуляции транскрипции........................... 319
3.3. Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов............. 330
3.3.1. Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и
депонирование мРНК............................................................... 330
3.3.2. Сплайсинг РНК в регуляции экспрессии генов.............................. 343
3.3.3. Избирательная деградация мРНК.................................................. 353
3.4. Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции.............. 358
3.4.1. Регуляция инициации трансляции................................................. 358
3.4.2. Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей................... 367
3.4.3. Регуляция терминации трансляции............................................... 370
3.5. Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина........... 371
3.6. Посттрансляционная регуляция экспрессии генов................. 373
3.6.1. Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных
цепей.......................................................................................... 373
3.6.2. Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге
белков........................................................................................ 376
3.6.3. Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой
деградации белков.................................................................... 377
3.6.4. Сплайсинг белков............................................................................ 381
3.6.5. Другие посттрансляционные модификации белков...................... 386
ГЛАВА 4. ВОСПРОИЗВЕДЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ........... 390
4.1. Репликация ДНК............................................................................. 390
4.1.1. Белки, участвующие в репликации ДНК........................................ 391
4.1.2. Репликативная вилка E. coli и бактериофага T4........................... 394
4.1.3. Особенности функционирования репликативной вилки эукариот 400
4.2. Регуляция репликации ДНК......................................................... 403
4.2.1. Инициация репликации ДНК у E. coli и ее регуляция.................... 405
4.2.2. Регуляция репликации плазмиды ColE1........................................ 414
4.3. Особенности репликации линейных геномов.......................... 421
4.3.1. Линейные хромосомы бактерий..................................................... 422
4.3.2. Репликаторы эукариот.................................................................... 425
4.3.3. Репликация теломерных участков эукариотических хромосом... 427
4.3.4. Пространственная организация синтеза ДНК у эукариот............. 429
ГЛАВА 5. ЗАЩИТА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ................................. 432
5.1. Мутации........................................................................................... 433
5.1.1. Основные источники мутаций и методы определения мутагенной
активности................................................................................. 435
5.1.2. SOS-мутагенез у бактерий.............................................................. 449
5.1.3. Мутаторный фенотип...................................................................... 453
5.1.4. Экспансия ДНК................................................................................. 456
5.1.5. Адаптивные мутации....................................................................... 460
5.1.6. Механизмы защиты генома от мутаций......................................... 464
5.2. Репарация ДНК............................................................................... 465
5.2.1. Основные механизмы репарации поврежденной ДНК................. 466
5.2.2. Эксцизионная репарация в клетках животных.............................. 468
5.2.3. Гомологичная рекомбинация в репарации ДНК............................ 481
5.2.4. Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов............................. 483
5.2.5. Полимераза поли(ADP-рибозы) в репарации ДНК у эукариот..... 486
5.3. Альтруистичная ДНК..................................................................... 490
5.3.1. Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
.................................................................................................... 491
5.3.2. Повышение информационной стабильности генома избыточными
последовательностями............................................................ 495
5.3.3. Селективная защита генов от мутаций.......................................... 500
5.3.4. Высокоупорядоченое расположение летальных генов на
хромосомах............................................................................... 508
5.3.5. Возможный смысл парадокса С..................................................... 516
ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННАЯ КОНЦЕПЦИЯ ГЕНА............................................ 522
ЧАСТЬ II. ИСКУССТВЕННЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ
.......................................................................................................... 531
ГЛАВА 7. ПРИНЦИПЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ............................................. 532
7.1. Основные ферменты, используемые в генной инженерии... 539
7.1.1. Рестриктазы и ДНК-метилазы......................................................... 539
7.1.2. ДНК- и РНК-лигазы.......................................................................... 548
7.1.3. Ферменты матричного синтеза ДНК и РНК.................................... 549
7.1.4. Другие ферменты............................................................................ 556
7.2. Векторы........................................................................................... 558
7.2.1. Плазмидные векторы...................................................................... 559
7.2.2. Векторы на основе фага λ.............................................................. 563
7.2.3. Космиды и фазмиды........................................................................ 568
7.2.4. Сверхъемкие векторы YAC, BAC и PAC........................................ 570
7.2.5. Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы....................... 574
7.2.6. Конструирование экспрессирующих векторов и их
функционирование................................................................... 577
7.2.7. Векторы для переноса ДНК в клетки животных и растений......... 593
7.3. Клонотеки генов............................................................................. 596
7.3.1. Получение клонотек генов.............................................................. 596
7.3.2. Введение рекомбинантных ДНК в клетки...................................... 599
7.3.3. Методы скрининга клонотек генов.................................................. 600
7.4. Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов,
основанные на культурах клеток............................................ 602
7.4.1. Клетки яичников китайских хомячков (линия CHO)....................... 604
7.4.2. Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)...................................... 607
7.4.3. Клетки селезенки мышей (линия MEL).......................................... 608
7.4.4. Клетки африканской зеленой мартышки (линия COS)................. 610
7.4.5. Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами......................... 611
7.4.6. Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии.. 612
7.5. Бесклеточные белоксинтезирующие системы........................ 613
7.5.1. Прокариотические системы............................................................ 615
7.5.2. Эукариотические системы.............................................................. 618
7.5.3. Проточные системы......................................................................... 619
7.6. Другие современные методы исследования генов................ 621
7.6.1. Рестрикционное картирование генов............................................. 621
7.6.2. "Прогулки и прыжки по хромосомам"............................................. 622
7.6.3. S1-картирование fs21 jРНК и ДНК........................................................... 624
7.6.4. Футпринтинг..................................................................................... 625
7.7. Стратегия выделения нового гена............................................. 626
ГЛАВА 8. НАПРАВЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ И БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ... 629
8.1. Методы направленного получения мутаций............................ 630
8.1.1. Получение делеций и вставок........................................................ 630
8.1.2. Химический мутагенез..................................................................... 633
8.1.3. Сайт-специфический мутагенез с использованием
олигонуклеотидов..................................................................... 635
8.1.4. Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе....... 642
8.2. Белковая инженерия..................................................................... 646
8.2.1. Библиотеки пептидов и эпитопов................................................... 646
8.2.2. Белки-репортеры в гибридных белках........................................... 655
8.2.3. Гибридные токсины......................................................................... 656
8.2.4. Подходы к созданию новых ферментов......................................... 662
8.2.5. Субтилигаза в лигировании пептидов............................................ 666
8.3. Концепция ксенобиоза.................................................................. 670
ГЛАВА 9. АНТИСМЫСЛОВЫЕ РНК, РИБОЗИМЫ И ДЕЗОКСИРИБОЗИМЫ
.......................................................................................................... 679
9.1. Антисмысловые РНК и олигонуклеотиды................................ 679
9.1.1. Механизм действия антисмысловых РНК...................................... 680
9.1.2. Использование антисмысловых РНК............................................. 682
9.1.3. Природные антисмысловые РНК................................................... 687
9.1.4. Антисмысловые РНК и патология: возможный механизм
возникновения доминантных мутаций.................................... 690
9.2. Рибозимы и дезоксирибозимы................................................... 692
9.2.1. Типы рибозимов............................................................................... 692
9.2.2. Свойства рибозимов........................................................................ 694
9.2.3. Рибозимы как лекарственные средства......................................... 698
9.2.4. Репарация мутантных РНК с помощью рибозимов,
осуществляющих транс- сплайсинг......................................... 704
9.2.5. Дезоксирибозимы............................................................................ 708
9.3. Аптамеры........................................................................................ 710
9.4. Молекулы РНК у истоков жизни.................................................. 713
9.4.1. Молекулы РНК в качестве РНК-репликаз...................................... 714
9.4.2. Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами РНК... 717
ГЛАВА 10. ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ И РАСТЕНИЯ............................... 722
10.1. Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
....................................................................................................... 722
10.2. Экспрессия трансгенов................................................................ 725
10.3. Использование трансгенов у животных................................... 726
10.3.1. Исследование механизмов экспрессии генов............................ 727
10.3.2. Токсигены в исследовании дифференцировки соматических
клеток в онтогенезе.................................................................. 728
10.3.3. Изменение физиологического статуса лабораторных и
сельскохозяйственных животных............................................ 729
10.3.4. Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний
человека.................................................................................... 732
10.4. Трансгенные растения.................................................................. 735
10.5. Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
....................................................................................................... 737
10.5.1. Способы доставки новых генов в геном человека..................... 738
10.5.2. Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях......... 743
10.5.3. Современные достижения генотерапии онкологических
заболеваний.............................................................................. 746
10.5.4. Ближайшие перспективы использования генотерапии............. 750
10.5.5. Успехи генотерапии в модельных экспериментах..................... 752
10.5.6. Проблемы, возникающие в связи с практическим применением
генотерапии............................................................................... 753
ГЛАВА 11. ДНК-ДИАГНОСТИКА И ДНК-ТИПИРОВАНИЕ.............................. 755
11.1. ДНК-диагностика наследственных и приобретенных
заболеваний................................................................................ 759
11.1.1. Получение клинического генетического материала.................. 759
11.1.2. Диагностика заболеваний............................................................ 761
11.2. ДНК-типирование........................................................................... 774
11.2.1. ДНК-типирование микроорганизмов........................................... 775
11.2.2. Идентификация личности на основе минисателлитной ДНК:
определение отцовства............................................................ 778
11.3. Микроматрицы и микрочипы ДНК.............................................. 786
11.3.1. Методы создания микроматриц ДНК.......................................... 787
11.3.2. Ограничения в использовании микроматриц ДНК..................... 790
11.3.3. Использование микроматриц ДНК в фундаментальных и
прикладных исследованиях..................................................... 792
ГЛАВА 12. КАРТИРОВАНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА...................................................................... 796
12.1. Основные подходы к картированию генома человека.......... 796
12.1.1. Генетические карты сцепления................................................... 797
12.1.2. ПЦР в исследованиях генома человека..................................... 802
12.1.3. Физические карты низкого разрешения...................................... 804
12.1.4. Физические карты высокого разрешения................................... 807
12.2. Определение полной первичной структуры ДНК генома
человека...................................................................................... 809
12.3. Базы данных получаемой информации.................................... 810
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................. 813
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА.................................................................. 818
ЧАСТЬ I. МЕХАНИЗМЫ ХРАНЕНИЯ И РЕАЛИЗАЦИИ
ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ
ВВЕДЕНИЕ
Организм. Живой организм представляет собой
самовоспроизводящуюся, открытую термодинамическую систему, в которой
пути превращения вещества и энергии определяются генетической
информацией, реализующейся через генетический код. В таком несколько
измененном определении М. Барбьери (1998 г.) сформулирован один из
фундаментальных принципов биологии конца XX в. Сама возможность
появления этого глобального обобщения, по мнению Барбьери, связана с
тремя крупнейшими прорывами в биологических исследованиях уходящего
века. Биохимиками была определена функциональная роль белков, генетикам
удалось приподнять завесу над миром генетической информации, а
молекулярные биологи установили, что связь между этими двумя мирами
осуществляется через генетический код.
Поскольку организм является самовоспроизводящейся системой, он
должен обладать информацией, необходимой и достаточной для поддержания
своего status quo и производства себе подобных. Словосочетание открытая
термодинамическая система подчеркивает, что все проявления
жизнедеятельности организма могут быть объяснены в терминах естественных
наук, а одним из необходимых условий его существования является обмен с
окружающей средой веществом, энергией и информацией в разных формах,
включая генетическую информацию.
По современным представлениям вся генетическая информация живого
организма содержится в его генах и, как любая другая информация, заключает
в себе сообщения, в данном случае сообщения для молекулярных объектов,
способных их воспринять. Сама возможность восприятия генетической
информации определяется тем, что сообщения организованы с помощью
системы правил (генетического кода), "понятных" объектам, для которых эти
сообщения предназначены. Получив генетическое сообщение, молекулярный
объект его декодирует в соответствии с правилами, лежащими в основе
функционирования его составных частей. Даже частичное невыполнение этих
правил может приводить к тяжелым нарушениям жизнедеятельности
организма.
Во время передачи генетической информации по существующим
каналам связи от генов к воспринимающим молекулярным объектам имеет
место ее многократное декодирование и перекодирование вплоть до
окончательного воплощения в фенотипических признаках. Происходит
экспрессия генов. Можно сказать, что в результате экспрессии генов
заключенное в них слово материализуется в деяние. Однако это не более чем
метафора: природа без человека лишена членораздельной речи. Было бы
непродуктивно, не опираясь на демиурга, искать в строении организмов
предсуществующий план, а в действии генов – цель.
Клетка. Клетка является той наименьшей частью организованной
материи, которая еще сохраняет все признаки живого. В ней происходят
основные события, связанные с экспрессией генов. Лишь в клетке может
полноценно реализовываться генетическая информация, заключенная в генах.
Рассмотрение генов в отрыве от их естественного внутриклеточного окружения
приводит к искусственному разделению генома на функционально оторванные
друг от друга фрагменты, созданию емких баз данных последовательностей
нуклеиновых кислот. Современные попытки заставить функционировать гены в
новом генетическом окружении завершаются в лучшем случае получением
нежизнеспособных в природных условиях биореакторов – организмов-
сверхпродуцентов собственных или чужеродных белков и метаболитов.
Связь между генами и внутриклеточным генетическим окружением
неразрывна. Компоненты клетки, распознавая гены, считывают заключенную в
них информацию и декодируют ее. При этом они поддерживают гены в рабочем
состоянии и их воспроизводят, создавая точную копию носителя информации,
гарантию существования самих себя. Действительно, в ответ на это гены
предоставляют инструкции, необходимые для внутриклеточного клонирования
самих молекулярных компонентов клеток, а следовательно (по крайней мере, в
случае одноклеточных организмов) создания их точных копий. Функционирует
единая система, части которой невозможно разъединить, не уничтожив живое.
Тем не менее, суть связей между компонентами генетической системы,
организованной в клетку, – это не порочный круг. Напротив, рассматривая
систему, как единое целое, в ней можно обнаружить внутренний потенциал
направленного развития, который реализуется во времени, материализуясь в
биосфере.
В этой связи популярные еще и сегодня рассуждения об эгоистическом
гене, заставляющем клетку работать только на себя, лишены глубокого смысла.
Последовательно оставаясь на такого рода антропоморфных позициях,
необходимо признать, что и эгоистически настроенные белки могут
рассматривать ДНК как сожителя, существование которого приходится терпеть
для воспроизводства самих себя.
"Omnia mea mecum porto!1" – этот девиз в полной мере применим к
одноклеточным организмам. У многоклеточных генетических систем это не так.
В данном случае отдельные клетки, составляющие организм, становятся
зависимыми друг от друга, создавая неразрывное единство на другом уровне –
сомы, или тела. Между клетками происходит контролируемое генами
перераспределение функций. При этом клетки разных частей многоклеточного
организма могут настолько различаться морфологически, что без проведения
специального анализа на молекулярном уровне их невозможно отнести к одной
генетической системе, единому организму.
Пролиферация, дифференцировка и апоптоз соматических клеток.
Переход к многоклеточности перевел отношения организма с окружающим
миром на новый уровень сложности. Многочисленные связи между
рецепторами организма и внешними воздействиями, с одной стороны, а также
внутренними анализаторами поступающей информации, с другой,
обеспечивают максимальную приспособленность организма к условиям
существования. Жизнь не прощает ошибок. Все, что неадекватно реагирует на
сигналы среды существования, элиминируется естественным отбором. Чем
чувствительнее и эффективнее система настроена на окружающий мир (в том
числе и внутреннюю среду организма), тем сложнее и изощреннее ее
морфологическое воплощение, ее внутреннее содержание.
Пролиферация клеток. В основе развития любого многоклеточного
организма, становления системы его органов и тканей лежит деление
(пролиферация) клеток. Генетическая программа обеспечивает протекание
сложной совокупности биохимических реакций, сопровождаемых созданием
точной копии генетического аппарата каждой соматической клетки, ее ростом и
делением. Поскольку при каждом делении клеток весь глобальный
1 Все свое ношу с собой (лат.)
биохимический процесс циклически повторяется, он получил название
клеточного цикла. Индивидуальное (онтогенетическое) развитие, как правило,
начинается с первого деления стимулированного к этому яйца (яйцеклетки) и
завершается только с наступлением его смерти – распада организма как целого
Дата добавления: 2015-08-29; просмотров: 26 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |