тРНК, содержащие до шести тРНК в составе одного предшественника. В
процессинге предшественников тРНК у бактерий ключевую роль играет РНКаза
P. Для проявления нуклеазной активности у этого необычного фермента
требуется присутствие небольшой РНК, прочно ассоциированной с его
полипептидной цепью. Именно ей присуща собственная эндонуклеазная
активность, что характерно и для других рибозимов (подробнее см. главу 9).
Таким образом, зрелые молекулы рРНК и тРНК образуются в клетках как
прокариот, так и эукариот в результате серии эндо- и экзонуклеазных
воздействий на их предшественники. Основной же посттранскрипционной
модификацией является полиаденилирование их 3’-концевых
последовательностей.
Полиаденилирование РНК у бактерий. Хотя поли(А)-полимераза E. coli,
осуществляющая безматричный синтез поли(А) при наличии РНК-затравок,
была очищена в 1962 г., поли(А)-РНК у бактерий не была обнаружена до 1975 г.
Рис. I.10. Локализация сайтов полиаденилирования и пути
катаболизма бактериальных РНК
а – обобщенная структура бактериальной полицистронной мРНК и
положение сайтов полиаденилирования в РНК классов I-VI; б –
альтернативные пути катаболизма бактериальных мРНК с участием
поли(А)-полимеразы, полинуклеотидфосфорилазы (ПНФазы) и различных
РНКаз; РНКаза Х – гипотетическая рибонуклеаза
и долгое время после этого рассматривалась как исключение из общего
правила и биологический курьез. В настоящее время стало ясно, что
полиаденилирование РНК у бактерий столь же обычно, как и у эукариот, и
выполняет важные биологические функции. Поли(А)-последовательности
бактериальных мРНК значительно короче соответствующих эукариотических.
Их длина, в среднем, составляет всего 14–16 нуклеотидов (80–200 – у
эукариот), а полиаденилированы лишь от 1 до 40% молекул мРНК каждого
определенного вида в клетке (∼100% в случае эукариот). Более подробное
сравнение свойств поли(А)-последовательностей прокариот и эукариот
проведено в разделе 2.2.3.
Классы поли(А)-содержащих РНК бактерий. В зависимости от
расположения сайта присоединения поли(А)-последовательности все
бактериальные РНК разделяют на шесть классов (см. рис. I.10, а). В РНК
первого класса происходит полиаденилирование 3’-концевого нуклеотида,
следующего сразу за терминаторной шпилькой ρ-независимого терминатора
последней кодирующей области. У РНК второго класса терминаторная шпилька
отщепляется посттранскрипционно РНКазой Е, и к образующемуся 3’-концу
присоединяется поли(А). Терминаторная шпилька отсутствует и у
полиаденилированных мРНК третьего класса, образующихся с участием ρ-
зависимых терминаторов транскрипции, благодаря особенностям структуры
таких терминаторов. В укороченных мРНК четвертого класса отсутствует 3’-
концевая кодирующая область, а поли(А) начинается непосредственно за
межцистронной терминаторной шпилькой. В РНК пятого класса поли(А)-
последовательности локализуются на концах укороченных цистронов, а у РНК
шестого класса – на концах 5’-концевых некодирующих последовательностей.
На основании структуры поли(А)+-мРНК делается вывод, что
полиаденилирование у бактерий не зависит от присутствия в РНК
специфических регуляторных сигналов, как это имеет место у эукариот, а
определяется наличием у них свободных 3’-OH-групп. Такие промежуточные
мРНК разной длины, по-видимому, появляются в результате деградации или
преждевременной терминации синтеза полноразмерных транскриптов.
Поли(А)-полимеразы. Полиаденилирование бактериальных мРНК
катализирует поли(А)-полимераза (ATP:полирибонуклеотид-
аденилилтрансфераза), которая осуществляет независимое от матрицы
последовательное присоединение остатков аденилата к 3’-OH-концам молекул
РНК в соответствии со следующей реакцией:
РНК + n ATP → РНК(А)n + nPPi
У E. coli описаны две поли(А)-полимеразы. Поли(А)-полимераза I
кодируется локусом pcnB, первоначально идентифицированным в качестве
контролирующего число копий плазмид в бактериальных клетках.
Процессированная молекула представляет собой полипептид с молекулярной
массой 52 кДа, не обладающий гомологией с соответствующими
эукариотическими ферментами, однако содержащий сегмент, гомологичный
части полипептидной цепи тРНК-нуклеотидилтрансферазы, которая
осуществляет посттранскрипционное присоединение акцепторного CCA-
тринуклеотида к молекулам тРНК. Даже умеренная сверхэкспрессия
рекомбинантного гена pcnB летальна для E. coli. Полная инактивация гена pcnB
с помощью делеций не сопровождается прекращением полиаденилирования
мРНК, что указывает на присутствие в геноме E. coli второго аналогичного гена.
Такой ген был обнаружен в виде открытой рамки считывания f310, кодирующей
полипептид с молекулярной массой 36,3 кДа, обогащенный гидрофобными
аминокислотами. Полипептид не обладает гомологией ни с одной из известных
бактериальных, вирусных или эукариотических поли(А)-полимераз.
Возможная функциональная роль полиаденилирования РНК у
бактерий. Несмотря на то что полиаденилирование РНК интенсивно
исследуется более 25 лет, его функциональная роль даже у эукариот
полностью не выяснена. Еще меньше известно о роли полиаденилирования
РНК у бактерий. Однако из имеющихся данных становится ясно, что влияние
полиаденилирования РНК на молекулярные процессы бактериальной клетки
весьма разнообразно и распространяется, по крайней мере, на контроль числа
копий бактериальных плазмид, стабильность мРНК и ее трансляцию.
Регуляция репликации плазмид через полиаденилирование
антисмысловых РНК. Более подробно механизмы регуляции репликации
бактериальных плазмид будут рассмотрены в разделе 4.2.2 на примере
плазмиды ColE1. Здесь же лишь кратко отметим, что у некоторых групп
плазмид, например ColE1 или pBR322, которая является ее производной,
регуляция числа копий осуществляется с помощью антисмысловой РНК (РНК I),
образующей гибрид с РНК-праймером (РНК II), необходимым для инициации их
репликации, и блокирует его функционирование. В соответствии с этим
внутриклеточная концентрация РНК I является критическим параметром в
регуляции репликации плазмид. Деградация РНК I инициируется отщеплением
5’-концевого пентануклеотида под действием РНКазы Е (РНК I–5) и далее
контролируется поли(А)-полимеразой – продуктом гена pcnB.
Полиаденилированная РНК I–5 обладает коротким временем полужизни,
типичным для бактериальных мРНК (1–2 мин), тогда как немодифицированная
РНК I–5 значительно более стабильна (время полужизни – >10 мин). Ускоренная
деградация поли(А)-РНК I–5 инициируется полинуклеотидфосфорилазой. У
поли(А)--РНК I–5 3’-концевой нуклеотид находится в составе шпильки, что
препятствует эффективному действию полинуклеотидфосфорилазы. Однако
при наличии короткого поли(А)-хвоста, выступающего за пределы шпильки,
РНК I–5 эффективно расщепляется ферментом по 3’-экзонуклеазному
механизму. В разрушение поли(А)+-РНК I–5 вносят свой вклад и другие
нуклеазы, включая РНКазу Е и РНКазу III. Имеются данные и том, что
полиаденилирование само по себе инактивирует РНК I–5, так как оно приводит к
характерному изменению ее вторичной структуры.
Влияние полиаденилирования на время полужизни бактериальных
мРНК. Описанное выше дестабилизирующее действие полиаденилирования на
антисмысловые РНК распространяется и на некоторые бактериальные мРНК.
Например, инактивация гена pcnB, кодирующего поли(А)-полимеразу, с
помощью делеций сопровождается значительным увеличением времени
полужизни мРНК генов lpp, trxA, ompA, а также rpsO на фоне мутаций pnp, rnb и
rne, инактивирующих гены полинуклеотидфосфорилазы и соответствующих
рибонуклеаз. Поскольку эти результаты были получены в отсутствие РНКазы Е,
3’-концы большинства бактериальных мРНК содержали шпильку, характерную
для ρ-независимых терминаторов транскрипции (см. рис. I.10). Экзонуклеазное
расщепление РНК под действием полинуклеотидфосфорилазы и РНКазы II
затруднено при наличии такой шпильки и облегчается в присутствии
выступающей поли(А)-последовательности (см. рис. I.10, б). Как показано на
рисунке, первичный транскрипт в бактериальных клетках может или
полиаденилироваться, или подвергнуться экзонуклеазному расщеплению,
неэффективному без поли(А)-последовательности, при наличии которой в
процесс деградации активно включаются полинуклеотидфосфорилаза и
РНКаза II. РНКаза Е может отщеплять как полиаденилированную, так и
неполиаденилированную шпильку. Такой незащищенный с 3’-конца транскрипт
подвергается атаке 3’-экзонуклеаз, с которой конкурирует полиаденилирование,
препятствующее деградации мРНК по этому механизму. Следовательно,
полиаденилирование мРНК в бактериальных клетках может выполнять
альтернативные функции: дестабилизировать транскрипты при наличии у них
3’-концевых шпилек и стабилизировать "линейные" формы мРНК.
Предполагается участие в деградации поли(А)+-мРНК и неизвестной РНКазы Х,
поскольку этот процесс может происходить на фоне неактивных
полинуклеотидфосфорилазы, РНКазы II и РНКазы Е.
Изображенная на рис. I.10 схема катаболизма первичных бактериальных
транскриптов является упрощением, так как предполагает независимое
действие нуклеаз. В последнее время, в соответствии с общей тенденцией,
накапливаются данные о координированной работе большинства компонентов
системы деградации бактериальных РНК в составе сложных
мультиферментных комплексов, получивших название деградосом. Полное
расщепление РНК с 3’-концевой шпилькой деградосомами требует расхода ATP
ATP-зависимой РНК-хеликазой, а также участия белка DnaK, белков теплового
шока, энолазы __________и гликолитического фермента с неизвестной функцией в
метаболизме РНК.
Возможная роль полиаденилирования бактериальных мРНК в
трансляции. Как будет видно из дальнейшего изложения (см. раздел 2.2.3),
поли(А)-последовательности эукариотических РНК постоянно ассоциированы с
жизненно важным поли(А)-связывающим белком PAB, который участвует как в
регуляции стабильности мРНК, так и их трансляции. Поиск белка с
аналогичными функциями у бактерий привел к очистке рибосомного белка S1,
который кооперативно связывается с поли(А)-последовательностями мРНК с
константой ассоциации 3ｷ106 М–1. Функциональная роль этого взаимодействия в
настоящее время не ясна, однако предполагают, что оно может оказывать
влияние на трансляцию. Возможно, белок S1 облегчает доставку мРНК к
30S субчастицам рибосом, что должно стимулировать инициацию трансляции.
Полиаденилирование мРНК в митохондриях и хлоропластах.
Концепция эндосимбиотического происхождения митохондрий и хлоропластов
эукариот из бактерий-эндосимбионтов подкреплена многочисленными
экспериментальными данными и является в настоящее время весьма
популярной. В этой связи целесообразно рассмотреть особенности
полиаденилирования РНК у этих органелл в данном разделе.
Полиаденилированные мРНК митохондрий по своей структуре аналогичны
мРНК E. coli класса IV (см. рис. I.10, а). Как и у бактерий, полиаденилирование
митохондриальных РНК происходит вне зависимости от специфических
регуляторных последовательностей, характерных для мРНК эукариот. Средний
размер поли(А)-последовательностей мРНК митохондрий в клетках HeLa
человека составляет 55 нт, а в клетках асцитных опухолей мышей – 35–55 нт,
что соответствует длине поли(А)-последовательностей у бактерий. Поли(А)-
полимераза митохондрий клеток гепатомы Морриса обладает молекулярной
массой 60 кДа. Она способна добавлять к РНК in vitro поли(А)-
последовательности длиной до 600 нт, однако в изолированных митохондриях
их размер составляет 20–23 нт. Фермент кодируется ядерным геном.
Длина 3’-концевых поли(А)-последовательностей РНК хлоропластов
значительно превышает таковую РНК бактерий и достигает нескольких сотен
нуклеотидов, что характерно для эукариотических поли(А)+-РНК. Эти
последовательности не обязательно являются гомополимерами остатков
аденозина, но могут состоять из кластеров А (75%), перемежающихся
последовательностями G (24%), а также C и U (суммарное содержание – 5%),
что напоминает свойства некодирующих, обогащенных поли(А) участков мРНК
бактериофага Т7. Поли(А)-полимераза хлоропластов гороха (Pisum sativum)
состоит из трех субъединиц, среди которых полипептид с молекулярной массой
43 кДа обладает антигенными детерминантами, общими с поли(А)-полимеразой
дрожжей, а из двух других гликозилированных субъединиц лишь РНК-
связывающий полипептид с молекулярной массой 105 кДа абсолютно
необходим для функционирования фермента.
2.2.2. Редактирование пре-мРНК
Недавно появились сообщения о новых механизмах изменения
кодирующего потенциала мРНК на посттранскрипционном уровне, названных
редактированием РНК (editing). Оказалось, что в клетках многих организмов
имеются ферментные системы, способные с высокой специфичностью
изменять первичную структуру мРНК, что, в свою очередь, меняет их
кодирующий потенциал и приводит к образованию новых функционально
значимых белков. Одним из первых был описан механизм редактирования РНК
для митохондрий внутриклеточных паразитов – жгутиковых трипаносомид:
Crithidia fasciculata, Leishmania tarentolae и Tripanosoma brucei.
Митохондриальная (мт) ДНК этих одноклеточных представлена 20–50
идентичными копиями катенанов кольцевых молекул (зацепленные друг за
друга кольца в виде гирлянды), называемых максикольцами, которые являются
функциональными аналогами мтДНК других эукариот. Кроме того, их
митохондрии содержат несколько тысяч копий небольших молекул ДНК
(миникольца), функциональное значение которых до недавнего времени
оставалось неизвестным. В результате функционирования механизма
редактирования мРНК в специфические участки митохондриальной мРНК
встраиваются многочисленные остатки уридина (U), не кодируемые
максикольцами митохондриального генома, тогда как другие остатки U,
включенные в мРНК в результате транскрипции мтДНК, удаляются из
транскриптов. При таком "редактировании" кодирующего потенциала мРНК
могут быть изменены до нескольких сотен остатков U (табл. I.7), что приводит к
образованию протяженных открытых рамок считывания (ОРС), кодирующих у
жгутиковых высокогомологичные белки, а также новых кодонов инициации
трансляции (AUG), которые __________отсутствуют у мРНК, не подвергнутых
редактированию. Такие модификации мРНК могут создавать новые
терминирующие кодоны (UAG и UAA), а также затрагивать 3’-концевые
нетранслируемые последовательности мРНК и poly(A)-хвосты. Функциональное
значение редактирования этих нетранслируемых последовательностей мРНК
неизвестно. Они, как полагают, могут оказывать влияние на стабильность
соответствующих мРНК и их содержание внутри клеток.
Выбор последовательностей нуклеотидов в мРНК, которые подвергаются
редактированию у трипаносомид, по-видимому, осуществляется с участием
небольших РНК-проводников (guide RNAs, gRNA), частично комплементарных
редактируемым участкам мРНК и кодируемых миникольцами мтДНК. gРНК
являются первичными транскриптами, так как содержат на 5’-концах
нуклеозиддифосфаты или нуклеозидтрифосфаты. На их 3’-концах
обнаруживают 15 некодируемых остатков U, которые добавляются
посттранскрипционно 3’-концевой уридилилтрансферазой.
Таблица I.7
Различные способы редактирования мРНК
Объект Модифицированные или
добавленные нуклеотиды
Митохондрии трипаносом AAUUUAUGUUGUCUUU
Митохондрии P. polycephalum AUCUCUAAGGGUUUAACCGG
Сдвиг рамки Сдвиг рамки
Парамиксовирусы (ген Р) AUUAAAAAGGGGCACAC
Сдвиг рамки
Митохондрии позвоночных CAGUAAAAAAAAAAAAAA
СТОП-кодон
высших растений UUUUUCAUUGUGGUUUAC
Phe Tyr
Хлоропласты высших растений AAUAAUAUGGCGAAACAU
Инициирующий кодон
Ионные каналы млекопитающих,
регулируемые глутаматом
UUUAUGCGGCAAGGA
Arg
Ген аполипопротеина В
млекопитающих
GAUAUAAUUUGAUCAGUAUA
СТОП-кодон
Шесть или более 5’-концевых нуклеотидов gРНК комплементарны
последовательности редактируемой мРНК, непосредственно предшествующей
блоку нуклеотидов, подвергаемых редактированию. Уже сейчас ясно, что gРНК
не служат матрицей для встраивания модифицируемых нуклеотидов в
процессе посттранскрипционного редактирования РНК. Обсуждается
гипотетический механизм этого процесса, который, к сожалению, не объясняет
полностью имеющиеся факты. В соответствии с гипотезой образующиеся
ошибочно спаренные (некомплементарные) нуклеотиды в гибридах gРНК и
редактируемой мРНК служат сигналами для расщепления мРНК с
последующим добавлением по местам разрывов остатков U. При этом места
комплементарного спаривания нуклеотидов в РНК–РНК-гибридах защищены от
редактирования. Кроме того, предполагают__________, что редактирование мРНК
происходит с участием сложных нуклеопротеидных комплексов – эдитосом, по
аналогии со сплайсингом, где участие аналогичных комплексов – сплайсом в
настоящее время доказано.
Другой тип редактирования РНК характерен для митохондрий
слизневиков P. polycephalum (см. табл. I.7). В этом случае отдельные остатки С
встраиваются во множественные участки митохондриальных мРНК, что
приводит к сдвигам рамок считывания. Механизм данного процесса неизвестен.
Своеобразно решают задачу изменения кодирующего потенциала своих
мРНК парамиксовирусы, в частности вирусы кори и свинки. Во время
транскрипции гена P, кодирующего белок, ассоциированный с полимеразой,
РНК-полимераза совершает ошибки, что сопровождается вставками лишних
остатков гуанозина (G) в мРНК и, как следствие, сдвигом рамок считывания при
их трансляции.
В транскриптах митохондрий позвоночных животных в процессе
полиаденилирования мРНК происходит создание бессмысленных кодонов UAA
и UGA, приводящих к преждевременной терминации трансляции, что в
конечном счете сопровождается появлением новых полипептидных цепей. Тот
же самый механизм реализуется в ядрах позвоночных.
Другая группа механизмов редактирования мРНК основана на
ферментативном взаимопревращении остатков нуклеотидов. Например, в
большинстве митохондрий высших растений в результате дезаминирования
происходит превращение остатков С в U. В меньшей степени для них
характерен обратный процесс: U→C. При этом изменяется смысл кодонов в
мРНК и, как следствие, происходит замена соответствующих аминокислот в
белках. В настоящее время еще не охарактеризованы ферментные системы,
осуществляющие такие посттранкрипционные превращения нуклеотидов на
уровне мРНК.
Отдельно следует упомянуть редактирование мРНК, происходящее в
хлоропластах высших растений, в частности у кукурузы и табака. Оказалось,
что предсказание последовательностей аминокислот в белках хлоропластов,
сделанное на основании последовательностей нуклеотидов их генов, часто не
соответствует действительности. Так, в гене rpl2 хлоропластов кукурузы и гене
psbL хлоропластов табака находится кодон AСG в том месте, где ожидается
расположение наиболее распространенного кодона инициации трансляции
ATG. При созревании транскриптов этих генов происходит их
посттранскрипционная модификация, сопровождаемая превращением С→U.
Своеобразный механизм посттранскрипционного редактирования РНК
описан для транскриптов генов, кодирующих ионные каналы мозга
млекопитающих, которые участвуют в передаче сигналов в синапсах
центральной нервной системы. Известно, что субъединицы двух
близкородственных классов глутаматных рецепторов содержат в определенных
сегментах своих полипептидных цепей, формирующих каналы, остатки
глутамина или аргинина, что оказывает существенное влияние на
функционирование этих каналов. Оказалось, что субъединицы обоих классов
кодируются генами, у которых в соответствующем месте имеется только кодон
для глутамина (СAG), хотя в кДНК, полученной с использованием мРНК
указанных субъединиц в качестве матрицы, в этом месте обнаружен также и
аргининовый кодон СGG.
Интересно, что мРНК одной из субъединиц рецептора, принадлежащей
на основании аминокислотных последовательностей к одному определенному
классу (называемому здесь класс 1), подвергаются редактированию на 100%,
тогда как транскрипты трех других субъединиц того же класса вообще не
изменяются, несмотря на 90–95%-ную гомологию 30-звенных
последовательностей, окружающих редактируемый сайт. Транскрипты двух
субъединиц, принадлежащих к другому классу, редактируются с
эффективностью соответственно 40 и 80%. Таким образом, во всех этих
случаях имеет место количественная регуляция эффективности
редактирования мРНК рецепторов мозга, что необходимо для
пропорционального внутриклеточного синтеза соответствующих субъединиц.
Механизм такой своеобразной регуляции экспрессии генов в настоящее время,
к сожалению, не известен. Предполагают, что эдитосомы могут узнавать
характерные элементы вторичной структуры мРНК, по-разному
подвергающиеся редактированию.
Широкая, может быть, даже более широкая, чем мы сейчас
представляем себе, распространенность посттранскрипционного
редактирования мРНК у живых организмов указывает на этот механизм как на
один из обычных способов реализации генетической информации.
Использование __________таких модификаций пре-мРНК функционирующими
генетическими системами при экспрессии генов расширяет кодирующий
потенциал генома и добавляет еще одну возможность регуляции их
функционирования на посттранскрипционном уровне. В табл. I.8 суммированы
данные об использовании редактирования мРНК у животных и некоторых их
вирусов, которые наглядно демонстрируют распространенность этого явления у
данной группы организмов.
В заключение рассмотрим еще один наиболее хорошо изученный пример
редактирования мРНК аполипопротеина B (APOB) млекопитающих,
участвующего в транспорте холестерина и триглицеридов в крови. Уже давно у
млекопитающих обнаружили две формы APOB, кодируемые одним и тем же
геном и образующиеся в результате редактирования APOB-мРНК (рис. I.11, а).
Уникальный ген АPOB человека содержит 29 экзонов, и его общая длина
составляет 43 т.п.о. Длина мРНК этого гена, кодирующей ApoB100 с
молекулярной массой 512 кДа, составляет 14 тысяч оснований (т.о.). В
середине самого большого экзона 26 имеется глутаминовый кодон СAA,
который в результате редактирования мРНК превращается в терминирующий
кодон UAA. Некоторые из мРНК, подвергшихся редактированию, расщепляются
по криптическому (не функционирующему до расщепления) сайту
полиаденилирования, что приводит к образованию более короткой
Таблица I.8
Редактирование РНК у животных и их вирусов
Организм, ткань Локализация РНК-субстрат Последствия
редактирования
Печень/кишечник
крыс
Ядро APOB-мРНК C→U (CAAGlu→UAASTOP)
Мозг человека и
грызунов
ｻ мРНК
рецепторов
AMPA и KA
A→I (CAGGlu→CGGArg)
Семенники
человека,
нормальные и
опухолевые ткани
крыс
ｻ мРНК опухоли
Вилмса 1
U→A (CUCLeu→CCCPro)
Мышцы человека? мРНК α-
галактозидазы
U→A (TTCPhe→TACTyr)
Опухоли человека Ядро мРНК
нейрофибромат
оза типа 1
C→U
(CGAArg→UGASTOP)
Печень крыс ｻ тРНКAsp C→U и U→C рядом с
антикодоновой петлей
Сумчатые Митохондрии тРНКGly C→U в антикодоне
(Gly→Asp)
Вирус гепатита δ Вирус Антигеномная
РНК
A→I (UAGSTOP→UGGTrp)
Парамиксовирусы ｻ Ген Р Вставки G
Вирус Эбола ｻ Ген
гликопротеина
Вставки А
Рис. I.11. Экспрессия гена APOB человека и механизм редактирования
его мРНК
а – схема экспрессии гена; б – механизм дезаминирования остатка C в
APOB-мРНК в результате редактирования с участием эдитосомы; в –
нарушение специфичности редактирования APOB-мРНК при
олигомеризации каталитической субъединицы APOBEC1. В этих условиях
субстратом для эдитосомы могут быть другие мРНК (мРНК Z)
мРНК длиной в семь т.о. В результате трансляции редактированных мРНК
образуется укороченный APOB48 (241 кДа), который содержит 2152 N-концевых
аминокислотных остатка APOB100. В функциональном отношении этот белок
остается полностью активным, однако у него отсутствует С-концевой домен
APOB100, который отвечает за связывание с рецептором липопротеинов
низкой плотности. Молекулярным механизмом редактирования APOB-мРНК
является сайт-специфическое дезаминирование цитозина с помощью
цитидиндезаминазы. Недавно клонировали ген, кодирующий этот фермент у
человека, и полностью определили его первичную структуру. Показано, что
цитидиндезаминаза человека, осуществляющая редактирование APOB-мРНК,
представляет собой димер, построенный из двух идентичных субъединиц
(АРОВЕС1) с молекулярной массой 28 кДа. Ген фермента, расположенный на
хромосоме 12, экспрессируется исключительно в тонком кишечнике.
Специфичность дезаминирования остатка цитозина определяется, по крайней
мере, двумя факторами: последовательностью нуклеотидов мРНК в
окрестностях этого сайта и белковыми кофакторами, взаимодействующими с
каталитической субъединицей цитидиндезаминазы. Перенос методами генной
инженерии последовательности нуклеотидов, фланкирующей сайт
редактирования, в новые мРНК приводил к тому, что новые рекомбинантные
РНК также подвергались специфическому редактированию in vivo и in vitro. В
экспериментах такого рода, а также путем замен отдельных нуклеотидов
методами направленного мутагенеза определили последовательность
нуклеотидов мРНК, отвечающую за специфичность редактирования. Оказалось,
что для оптимального осуществления этого процесса необходима
последовательность длиной в 55 нуклеотидов, однако и 25 нуклеотидов в
окрестностях сайта было достаточно, чтобы редактирование осуществлялось
in vitro с 25%-ной эффективностью. Ниже представлены последовательности
нуклеотидов в окрестностях сайтов редактирования, которые оказались
высокогомологичными у разных видов млекопитающих.
С→U * * ** * * * * *
Человек Сайт 1 GAUA С AAUU UGAUСAGUAUAUUAAAG
Сайт 2 aAaA С AAUссaUGAUСuaсAUuUguuua
Бабуин Сайт 1 GAUA С AAUU UGAUСAGUAUAUUAAAG
Свинья Сайт 1 GAUA С AAUU UGAUСAGUAUAUUAAAG
Кролик Сайт 1 GAUA С AAUU UGAUСAGUAUAUUAAAG
Крыса Сайт 1 GAUA С AAUU UGAUСAGUAUAUUAgAG
Мышь Сайт 1 GAUA С AAUU UGAUСAGUAUAUUAAAG
Звездочками обозначены нуклеотиды, замены которых с помощью
направленного мутагенеза наиболее резко снижали эффективность
редактирования, а строчными буквами отмечены негомологичные нуклеотиды.
Подчеркнута последовательность нуклеотидов, получившая название якорной
последовательности (mooring sequence). Эта последовательность является
единственным цис- действующим регуляторным элементом, присутствие
которого необходимо и достаточно для специфического редактирования
вышерасположенного остатка С в экспериментах in vitro. Редактирование
APOB - мРНК здесь происходит после удаления из нее интронов в результате
Дата добавления: 2015-08-29; просмотров: 18 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |