Применение биотехнологий в сахарной свеклы 3 страница

Ф. Зародышевой Плазмы Хранения Багажа

Учитывая негативные последствия генетического разнообразия, сохранение генетических ресурсов растений, а соматических тканей была широко использована. Для кратко - и среднесрочного хранения багажа, культивирования растительных тканях проводили in vitro при низких температурах или для длительного хранения замораживания в жидком азоте. Сохраняя clonally распространяются ростки на 12°C, Хасси и Hepher (1978) снизилась субкультивирования частот до 18-недельными интервалами. In vitro регенерированного побеги были сохранены при низкой интенсивности света на один год при 2 ч или 5 градусов C (Миедема, 1982a).

Хотя низких температурах полезны для сохранения размножения материалов (напр., CMS линий, инбредных O-Тип линии, тетраплоидных опылителей) лет, обслуживание растительных материалов-это кропотливая и трудоемкая, а также несет риск потери ценных материалов из-за загрязнения или человеческой ошибки (Ван - denbussche et al., 2000). Чтобы минимизировать потери, криоконсервация был разработан для сахарной свеклы с использованием либо стрелять-советы (Braun, 1988; Vandenbussche и де Профт, 1996, 1998; Vandenbuss - че et al., 1999, 2000) или root-советы от трансгенных волосатый культур корень (Benson и Хэмилл, 1991).

В общем, криоконсервация стрелять-советы приводит к длительному хранению, максимальная стабильность фенотипические и генотипические характеристики хранящихся зародышевой плазмы, и минимальное дисковое пространство и требования к техническому обслуживанию (Ding et al., 2008). Braun (1988) впервые показал применимость замораживания стрелять-совет каллуса не дифференцированных клеток отделен от clonally распространяются побеги цветочные почки. Медленное замораживание, участвующих preculturing изолированные стрелять-советы на агаризованной среде с TIBA и 5% диметилсульфоксида (ДМСО), криопротектора, передав в жидкой среде с двумя криопротекторов (сорбит и ДМСО), и замерзает при -40 C до хранение в жидкий азот. Частота 58,4% отрастания произошло, когда замороженные каллуса не дифференцированных клеток были талых на 39°с.

Усовершенствованные протоколы были разработаны, которые используют инкапсуляция-обезвоживание организма, в сочетании с (Vandenbuss - че et al., 2000) или без (Vandenbussche и де Профт, 1996, 1998 г.) до стеклования. Наилучшие результаты были получены при инкапсуляции-обезвоживание, следующие три шага preculture и обезвоживания (Vandenbussche и де Профт, 1996). Выживаемость увеличилась до 45% до 90% при стрелять-советы были исключены из холодной приспособиться in vitro побеги (Vandenbussche и де Профт, 1998), в котором отображается для повышения толерантности к обезвоживанию и замерзания вызывая физиологические изменения. Растений от холода-приспособиться стрелять-советы имеют более сахарозы, D-глюкозы и D-фруктозы и жирных кислот (Vandenbussche et al., 1999 г.); обесцвечивание мембранных липидов, также увеличилось. Оптимизированный инкапсуляция-обезвоживание метод был, однако, длительный и трудоемкий, т.е., один день в предварительной обработки, три-день preculture и семь-час обезвоживания. Эти недостатки были в значительной степени преодолены с помощью комбинации стеклования и криоконсервации сохранить стрелять-советы (Vandenbussche et al., 2000), включение выживаемости до 100% и быстрее отрастания. Сочетание стеклования и криоконсервации стрелять советы из области растениями был использован для удаления патогенных микроорганизмов, особенно вирусы (Ding et al., 2008).

Методы Криоконсервации для root-советы от мохнатого корень трансгенных культур, сахарной свеклы, были использованы для изучения воздействия культуры возраста, pregrowth, криозащиты, скорости замораживания и пост - стоп условиях культуры (Benson и Хэмилл, 1991). Хотя ca. 80% корневой совет каллуса не дифференцированных клеток были жизнеспособными (после замораживания), основанный на флюоресцентной диацетата окрашивание, менее 20% из корней заново. Темпы роста производства вторичных метаболитов и T-структуры ДНК, однако, остались неизменными после криоконсервации.

G. Варианту С Генотипической: Серьезные Проблемы

Генотипической изменчивости препятствует регенерации (выступивший на церемонии с речью и Казань, 1998) и преобразования (выступивший на церемонии с речью и Казань, 1999). Определенные генотипы сахарной свеклы более сговорчивым, чем другие прямые и косвенные органогенеза (Saunders и мазня, 1984; Detrez et al., 1988; Nakashima et al., 1988; Миками et al., 1989a,b, Сабир и Ford-Lloyd, 1991; Jacq et al., 1992 г.; Чжун et al., 1993b; выступивший на церемонии с речью, 1997; выступивший на церемонии с речью etal, 2001 г., 2003a; Ивич-Haymes и Smigocki, 2005a; Mishutkina и Гапоненко, 2006), соматического эмбриогенеза (Steen et al., 1986; Doley и Сондерс, 1989; Сондерс и Цай, 1999), гаплоидных растений продукции из неоплодотворенных яйцеклеток (Доктринальных etal., 1989 г.; люкс etal., 1990; Hansen et al. 1995; выступивший на церемонии с речью et al., 2000), protoplast изоляции, культуры и регенерации (Кренц et al., 1990; Lenzner et al., 1995; выступивший на церемонии с речью et al., 2002b; Jazdzewska et al., 2000), и клонального размножения из существующих каллуса не дифференцированных клеток (Миедема, 1982a; Mezei et al., 1990; " Сабир " и " Форд-Lloyd, 1991; Хаякава etal, 1994).

Большие Интер-сортовые различия наблюдались среди десяти различных коммерческих сортов когда изменчивость каллус развития и корень органогенеза было исследовано на разных уровнях, т.е., разнообразие, растений и органов/лист (выступивший на церемонии с речью, 1997). Значительные межзаводской (производственных) и внутризаводского (inter-лист) изменчивость произошло в разнообразные даже на подобные физиологические возрастов, но эксплантов из разных должностях в лист пластинки вели себя аналогичным образом. Сильный внутризаводского вариации в callusing и съемки в пределах сорта (Генотип населения) также наблюдалось (Steen et al., 1986 г.; Doley и Сондерс, 1989; Ивич-Haymes и Smigocki, 2005a). С сахарной свеклы высоко гетерозиготных, понятно, что значительные межзаводской имеются вариации, даже фенотипически похожими людьми. Таким образом, генотипические различия, сохраняющиеся в пределах различных скорее всего, ответственность за межзаводской изменчивости, на долю которых приходится растения сорта, Primo, которые относятся хорошего-плохого или non-рутер in vitro (выступивший на церемонии с речью, 1997). Внутризаводского изменчивости трудно объяснить. Выше корреляция ожидается в эксплантов поведение из разных листьев одного и того же растения, но не наблюдается.

Значит, существуют, чтобы справиться с изменчивостью в сахарной свеклы. Одним из них является использование большого числа эксплантов реплицирует из множества отдельных предприятий в пределах одной строки/населения (Doley и Сондерс, 1989; Ивич-Haymes и Smigocki, 2005a). Но трудоемкий - Несс культура тканей растений, в сочетании с необходимостью стандартизации продукции родительских растений, нередко ограничивает целесообразность такого подхода. Материал также может быть отсортированы до культуры уничтожить тех, с низким органогенного образования или эмбриогенного потенциал. Чтобы облегчить этот подход, были сделаны попытки соотнести почернение листовой пластинки дисков по культуре средних и невозможностью производства корни с уровнями естественных фенолов. Последний был измерен с помощью полифенол оксидазы (PPO) деятельность с весьма чувствительной, мелких, воспроизводимым способом (выступивший на церемонии с речью и РЕН, 1995b). Хотя двойную разницу в уровнях ферментативной активности наблюдалось, никакой связи не было видно между PPO деятельности и укоренения мощности, либо между PPO деятельности и степень почернения; слабая отрицательная связь наблюдается между степень почернения и укоренения потенциала (выступивший на церемонии с речью, 1997). Другие факторы, например, природа и концентрация фенольных субстратов, а не активность фермента, может быть более важным, определяющим способность к регенерации.

III. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ СТРАТЕГИИ

A. агробактериальной трансформации

С открытия уникальной способности Agrobacterium tumefaciens и A. rhizogenes интегрировать определенную часть их передачи-ДНК (т-ДНК) в клетках эукариот, две бактерии широко используются для трансформации растений-изначально двудольных растений и спустя почти всех видов. Чтобы сделать это, опухоли, вызывающие (Ti) и корневой вызывающие (Ri) плазмиды были изменены, чтобы удалить фитогормона и высказать свое мнение (cy - tokinin и ауксинов) биосинтетических гены так, чтобы не мешать нормальной морфологического развития. В общем, агробактериальная трансформация была проще, эффективнее и дешевле, чем другие системы. Это также приводит к низкой копию количество вставок.

Сахарная свекла является весьма чувствительны in vitro как A. tumefaciens (Кренц et al., 1988; Линдси и Галуа, 1990; D'Halluin et al., 1992 г.; Jacq et al., 1993b; Захарченко et al., 2000) и А. rhizogenes (Хэмилл etal., 1987; Mugnier, 1987; Павел etal., 1987, 1990; Ehlers etal., 1991 г., Трифонова и Атанасов, 1995; Elliott etal., 1996; Захарченко etal., 2000). Однако восприимчивость это Генотип-зависимые (Lindsey и Галуа, 1990; Jacq et al., 1993b), но могут быть улучшены путем preculturing эксплантов перед посевом (Кренц et al., 1996 г.) или за счет удлинения co-культуры Продолжительность (Jacq et al., 1993b; Кренц et al., 1996). Восприимчивость эксплантов с поля выращенной сахарной свеклы растений A. tumefaciens также продемонстрировали производство опухолей у растений (Whitney, 1986).

Первые попытки преобразования сахарной свеклы via A. tumefaciens не увенчались успехом, в основном из-за невыполнения регенерации растений из стабильно трансформированные каллюс (Harpster et al., 1988; Кренц etal., 1988; Jacq etal., 1993b) или суспензии клеток (Возняк и Оуэнс, 1989; Kallerhoff et al., 1990). Для улучшения регенерации сахарная свекла листовая диски, семядоли и hypocotyls от всего две недели от роду саженцев девять различных линий, Кренц et al. (1988), используемые 'стрелок' мутанты A. tumefaciens, проведение изолированные cy - tokinin ген. Cotyledon и гипокотиле эксплантов, произведенных побеги на низких частотах, однако, не стрелять регенерация произошла привиты от листьев дисков. Стабильный преобразования не могли быть подтверждены.

Линдси и Галуа (1990) сообщила о первой успешной регенерации трансгенные растения сахарной свеклы от A. tumefaciens. Трансгенные всходы были получены в результате перестрелки базы тканей совместно культивируемых с использованием штамма LВА4404 укрывательство двоичного вектора с ген устойчивости к канамицину (nptll) и либо гены хлорамфеникол ацетил-трансферазы (cat) или в - глюкуронидаза (gusA). Преобразование частоты зависит от эксплантов типа, генотипа и условий отбора. Преобразования также сообщили D'Halluin et al. (1992 г.), который разработал установок толерантного широкого спектра гербицидов, glufos - согласовать и производных сульфонилмочевины. Рыхлые каллус, полученных из семядолей, hypocotyls, черешки и настоящих листьев 2 - 3-месячного саженцы, выращенные в темноте, было мелко нарезанный и привиты A. tumefaciens либо bialaphos сопротивления (бар) или мутант ацетолактатсинтаза (ALS) Гена на основе различных промоутеров, т.е., 35S CaMV, нос, TR1 " или TR2'). Этот Генотип-зависимые протокол был долгим, принимая почти два года, чтобы получить побеги, которые, вероятно, объясняет аномальным морфологии растений. Тем не менее, это была первая публикация, описывающая трансгенных растений выражения агрономически важная черта.

Генотип-независимый протокол был описан в котором cotyledonary эксплантатов несколько разных генотипов были привиты с A. tumefaciens, содержащих гены, кодирующие либо канамицин устойчивость и активность GUS или канамицина сопротивление, Гусь деятельности и к устойчивости к глифосату (Срю et al., 1991). Наличие трансгенов было подтверждено Гусь выражение, NPT дот-блот и EPSPS анализов; потомства показали, Mendelian inheritance трансгенов и терпимости к глифосату на уровнях летальным исходом у контрольных растений. К сожалению, технические подробности метода обнародованы не были.

Более поздние исследования с помощью A. tumefaciens в основном частными компаниями, произведенных трансгенных растений на частотах достаточно для создания растений, используемых в полевых испытаний, чтобы оценить устойчивость к гербицидам и устойчивость к болезням (Steen и Педерсен, 1993 г., 1995а,б; и Стин Педерсен, 1995; Tenning et al., 1995; человек - nerlof et al., 1996, 1997; Snyder et al., 1999). A. tumefaciens, сгенерированный трансгенных растений были также использованы для физиологических и молекулярных исследований. Эндогенный сахарной свеклы Гусь фермента (SB-GUS) сравнивалось с E. coli в лист диска трансформации (Возняк и Оуэнс, 1993, 1994). В другое приложение, различия в экспрессии генов структуры в корни были изучены с помощью различных конструкций (Vitha et al., 1998). Совсем по-другому, привычка роста и накопления Сахаров был изучен после преобразования с бактериальной цитокинин биосинтетических Гена сплавлен к patatin Гена промоутера (Ивич et al., 2001).

Хотя в разных сахарной свеклы эксплантов, т.е., стрелять баз, черешки, листья и каллус, были использованы, cotyledon эксплантов, часто были более успешными в трансформации с КПД в диапазоне от 0,1 до 1,0% (Срю et al., 1991; Стин и Педерсен, 1993; Кренц et al, 1996; Mannerlof et al., 1997; Snyder et al., 1999; Joersbo et al., 1998,2000; Zhang et al, 2001a). Совсем недавно, более высокие частоты были отмечены различными эксплантов. Листовой пластинки эксплантов от побегов умножить апикальной мерис - tems четырех генотипов уступил на 6,2%, коэффициент трансформации с канамицином выбор (Norouzi et al., 2005). Небольшой (1-3 мм) бутон советы от нескольких стрелять комки из незрелых цветочные бутоны пять разных генотипов, произведенных на 13,3 до 30,6% частот hygromycin-устойчивые ростки (Yang et al., 2005). Более 50% растений от устойчивости к канамицину эксплантов стрелять из базы тканях содержится hpt Гена (Hisano et al., 2004). Наконец, сочетание Agrobacterium и вакуума инфильтрация была использована для облегчения доставки ДНК в бактериальных костной ткани растений, в результате чего более 40% трансгенных каллус клонов (Кищенко et al., 2005). Важно отметить, что фактические стабильный преобразования частоты в этих исследованиях не известно, поскольку высокие коэффициенты были получены либо преходящей, либо не рассчитывается от количества трансгенных растений от переходных expressers.

Эффективность трансформации оказывают влияние множество факторов: Генотип (Lindsey и Галуа, 1990; D'Halluin et al., 1992 г.; Хаякава et al., 1994 года; Mannerlof et al., 1997; Захарченко et al., 2000; Hisano et al., 2004), эксплантов источник (Konwar, 1994; Bekheet и Solliman, 2007), бактериальный штамм, и время инкубации (Кренц et al., 1988; Hisano et al., 2004; Norouzi et al., 2005 г.), характер промоутер вождения выбору Гена (Harpster etal., 1988; Joersbo etal., 2000), метод отбора (D'Halluin et al., 1992 г.; Joersbo и Okkels, 1996a,b; Joersbo et al., 2000), интенсивность света (Joersbo et al., 1999), ранив частицы бомбардировки непосредственно перед прививкой (Снайдер et al., 1999), pre - лечение с помощью гормонов (Кренц et al., 1996), использование acetosy - ringone (Jacq et al., 1993b), и продолжительность предварительной и co-культуры периода (Jacq et al., 1993b; Кренц et al., 1996). Несмотря на значительный прогресс, сахарной свеклы до сих пор считается непокорных, чтобы A. tumefaciens. Вряд ли это быть из-за неспособности ДНК поглощения и интеграции, а с низким количеством клеток морфологически компетентным для регенерации. Доступ к такой компетентные клетки также могут быть затруднена, если они встроены в большом количестве noncompetent клеток (выступивший на церемонии с речью и РЕН, 1995a; Joersbo, 2007).

Agrobacterium rhizogenes также был широко использован для того чтобы преобразовать сахарной свеклы, используя черешки (Хэмилл et al., 1986, 1987; Paul et al., 1987; Возняк, 1993; Cai et al., 1997, 2003; Бенсон и Хэмилл, 1991; Кифле et al., 1999) и hypocotyls (Кифле et al., 1999; Баев et al., 2000; Thurau et al., 2003). Как эксплантов быстрое создание трансгенных конструкций, наиболее часто волосатых корней; однако, последний не может быть восстановлен в целом растений. Эксплантов от всего две недели от роду in vitro выращиваются саженцы, которые разработаны волосатые корешки, когда заражены A. rhizogenes штамм LBA9402, культивировали в жидкой среде, чтобы увеличить объем корневой ткани для производства относятся к из красной свеклы (Хэмилл et al., 1986). Измерения betaxanthin и betacyanin, однако, были похожи на те корней растений управления.

Кифле et al. (1999) co-прививка черешки листьев и гипокотиле эксплантов с A. A. tumefaciens LВА4404 и rhizogenes 15834; оба содержащиеся двоичный вектор pAM194 с ГАСОМ. Там было два - четыре раза увеличить эксплантов уступая волосатых корней и частота Гусь-положительных корней был в два - пять раз выше по сравнению с применением только A. rhizogenes. В нематоде, Hs1pro-1, была введена с помощью этого подхода и геномной структуры и выражения устойчивости к нематоде в волосатой корни сохранялся в течение повторил субкультур. Предлагаемое объяснение для повышения корень индукции и трансформации было, что он пришел от стимуляции деления клетки cy - tokinin синтезируется Agrobacterium tzs Гена (trans-зеатина секреции).

Преобразования A. rhizogenes является быстрым способом тестирования нескольких параметров в корней, таких как экспрессии трансгена (Ehlers et al., 1991), промоутер эффективности (Dimmer et al., 2004 г.), " поведение бактериальных генов (Menzel et al., 2003), паразит-хозяин между клетки корня и нематода (Paul et al., 1987, 1990; Cai etal, 1997,2003), вирусного патогенеза (Mugnier, 1987) и насекомых взаимодействий (Возняк, 1993; Smigocki et al., 2006, 2007). Однако, введение хозяйственно-ценных признаков via A. rhizogenes хорошо вдали от практики (Тепфера, 1984; Van der Salm et al, 1996).

B. Обстрел Частицами

Хотя с успехом применяться для переходных и стабильной трансформации многочисленных видов растений, было мало усилий, чтобы превратить сахарной свеклы через частиц бомбардировки. Первоначальные исследования касались в основном с оптимизацией параметров с помощью переходных выражение (Mahn et al., 1995; Ямашита et al., 1995; Ingersoll et al., 1996; Возняк и Оуэнс, 1996; Ямашита и Симамото, 1996; Onde et al., 2000). Обстрел каллуса не дифференцированных клеток апикальной использовался для тестирования различных размеров частиц и разрыв диска давление наблюдение переходных Гусь выражение в первой и второй слои клеток апикальной купола (Mahn et al., 1995). Низкий уровень Гусь выражение наблюдалось в неделящихся клеток меристемы, указывая на выживание бомбардировке клеток. В аналогичном исследовании, Гусь уровней экспрессии в лист диска эксплантов оказались Генотип зависимые (Ямасита et al., 1995; Ямашита и Симамото, 1996). С помощью клеточных суспензий, Ingersoll et al. (1996 г.) по сравнению эффекты различных промоутеров т.е., CaMV 35S, табака, PR-ы, osmotin, и модифицированного картофеля-ингибитора протеиназ II, для потенциальных воздействий на переходные выражение ГАСА, и Лу - ciferase; наблюдались значительные различия. Технико-экономическое частиц бомбардировки каллус, используя различные давления и плиты образца расстояния, был также испытан, но была менее гибкой, чем листовой ткани in vitro проросших рассады (Onde et al., 2000).

В сравнительном исследовании Agrobacterium - частиц и бомбардировки, Снайдер et al. (1999), достигнутые во время бомбардировки регенерации трансгенных растений с использованием эмбрионов - genic мозоль от гипокотиле сегменты высокой регенеративной линии, REL-1 (Sanders et al., 1992 г.) (раздел II.B.3); превращение произошло с генами, либо для патогена, связанные с обеспечением обороны белков или цитокинин генов биосинтеза присвоении повышенной устойчивостью к воздействию насекомых. Средняя эффективность трансформации (количество трансгенных растений на тарелку эмбриогенного каллуса) составил 7,7%; большинство трансгенных побеги были multi-копирования, вставки и молекулярных перегруппировок. Для Agrobacterium метод, эффективность преобразования среднем на 0,7% (количество трансгенных растений на лечение cotyledon). В работе высоко эмбриогенного клеточных суспензий из листьев каллус были засыпаны Гусь Гена обусловлен либо osmotin или pin-II промоутер. Хотя эффективность преобразования не сообщалось, стабильно трансформированных Калли были восстановлены на обоих канамицин - и паромомицина содержащих среднего (Ивич и Smigocki, 2003). Используя аналогичный подход на лист диски precultured в темноте в течение 7 недель привело к трансформации КПД 0,9-3,7% (Ивич-Haymes и Smigocki, 2005b). Маркер-вектор, неся кукурузы сахароза-фосфат Гена синтазы обусловлен риса хлорофилла a/b привязки (Cab) промоутер, был также введен бомбардировки (Хашимото и Симамото, 1999).

C. PEG-опосредованной трансформации

Следующие улучшения регенерации растений от изолированные протопластов (Кренц et al., 1990,1994; Hall et al., 1993a; Lenzner et al., 1995 г.), открытие того, что замыкающие клетки и их протопластов являются тотипотентных (Hall et al., 1995; 1996; раздел II.D) привело к КОЛЫШКУ-опосредованной трансформации системы с помощью гвардии сотового производных протопластов (Hall et al., 1996b). Протопласты, изолированные от последовательно очищенная гвардии-клеточных фракциях из листьев, размачивая эпидермиса, инкубировали с PEG6000 и плазмида кодирования фосфинотрицину ацетил-трансферазы (PAT). Несколько параметров, т.е., Пег и концентрации ДНК, инкубационного периода и типа носителя ДНК, которые были протестированы и только PEG концентрации пострадавших как временных, так Гусь выражение и стабильной интеграции (число Калли, растущих на выбор среды). PEG лечение дало самых высоких частот (от 23 до 36%) однократного копирования вставки (Hall et al., 1996b), значимое активов учитывая, что копировать вставки могут привести к co - подавление (Hall et al., 1996b; Mannerlof et al., 1997). Все регенерантов были трансгенными и не химерный с маленькой сомаклональная вариации; относительно высокой частоты (от 10 до 25%) был тетраплоидных. После устранения тетраплоидов, multi-копировать события и сомаклональная вариантов, почти половина растения-регенеранты пригодных для разведения (холл, 1998). Используя тот же протокол (Hall et al., 1996b), Lathouwers et al. (1997), используемые пальто Гена белка для производства свеклы некротических yellow vein virus (образуют)-устойчивые растения.

Он утверждал, что охранник ячейки protoplast метод независимых от генотипа, бесплатная побегов и способны генерировать трансгенных растений в два месяца, однако, регенерации растений эффективность была низкой. Только 2% устойчивых к гербицидам Калли породило укорененных растений, возможно, из-за плотного выбора схемы, что позволило не ускользает. Внедрение протопластов изолированы от замыкающие клетки тонким слоем альгината и с помощью антиоксидант (n-пропил галлат) были необходимыми для регенерации (Hall et al., 1996b). Улучшая эффективность регенерации бы увеличить полезность этого протокола с использованием протопластов для прямого стрелять органогенеза или соматического эмбриогенеза бы сократить культуры времени и, таким образом, сократить сомаклональная вариации.

D. варианты: Электропорация, ультразвуковой обработки и Соматическая Гибридизация

Первое превращение сахарной свеклы с помощью электропорации используется прямоугольная электрического импульса генерации системы для облегчения усвоения протопластов, от мезофилла листьев или суспензии клеток, плазмиду с кошкой Гена (Lindsey и Джонс, 1987). Хотя только достижения переходных выражение, собирали информацию о влиянии на поглощение ДНК и генной экспрессии маркера несколько параметров, т.е., плазмидной ДНК концентрации, protoplast плотности и взаимодействий между импульса поля, сила, Длительность, количество и импульсно-промежутки времени, и их последующее влияние на жизнеспособность клеток и физиологического состояния протопластов. Мезофилла-производные протопласты, были более чувствительны к электро - корпорация ущерб и более конкретные электропорации условия, необходимые чем подвеска-производные протопластов. Кошка деятельности, наблюдавшаяся на очень низких уровнях в неизменном виде суспензии клеток после elec - troporation, могла бы быть повышена путем пектиназы лечения клеток до электропорации. Дальнейшая оптимизация protoplast условий культуры и антибиотик отбора привели к стабильной трансформации electroporating подвеска-производные протопластов (Lindsey и Jones, 1989); однако, регенерации трансгенных растений была неудачной. Это, скорее всего, из-за трудностей с протопластов существа, способные к регенерации новых клеток стенок и проходят нормально митотического деления и дифференцировки клеток.

Было проведено широкомасштабное исследование, чтобы определить эффективная система преобразования сахарной свеклы протопластов через electropo - рационе (Joersbo и Brunstedt, 1990a, 1991; Joersbo etal., 1990) и ультразвуковой обработки (Joersbo и Brunstedt, 1990b; 1992). При переменном токе прямоугольной и экспоненциально затухающие импульсы были сравнены, переменный ток импульсов были наиболее эффективными, на основе временных выражение из кошка (Joersbo и Brunstedt, 1990a). Формулу для оценки электропорации эффективность клеточной суспензии протопластов как функции этого параметра протестированы была разработана (Joersbo et al., 1990), а также сублетальные sonica - ного лечения, чтобы увеличить поглощение ДНК по протопластов (Joersbo и Brunstedt, 1990b). Проницаемости плазматической мембраны была увеличена, вызывая семи до 15-кратного увеличения в переходных выражение из Кошка по сравнению с этим следующие электропорация, без существенных различий в protoplast выживаемость и покрытие эффективности (Joersbo и Brunstedt, 1992).

Испытывая влияние ультразвуковой обработки на синтез белка в очищенной суспензии клеток и протопластов (Joersbo и Brunstedt, 1990c) показали, что сумма 35S-метионин включены в клеточных белков, была увеличена до 90% после ультразвуковой обработки (220770 msat в 1,2-3,5 Вт/см2), при одновременном снижении жизнеспособности и от 5 до 11%. Ультразвуковой обработки на частоте 20 кГц также использоваться как в лабораторных условиях вирус инокуляция кратко подвергая протопластов, чтобы образуют частицы (Joersbo и Brunstedt, 1990d). Максимальная инфекцией, основанный на измерении образуют слой белка в привиты протопластов ELISA, были получены путем sonicating за 500-600 мс на 45-60 Вт; это также пониженную жизнеспособность 15 до 30%.

Фьюзинг протопластов, используя электрические или химические средства альтернативный способ производства соматических гибридные растения в некоторых видов растений, что влечет за собой передачу цитоплазматической или ядерной геномов от одного источника к другому. В сахарной свеклы, соматических гибридных микро-Калли были произведены (Hall et al., 1993b; выступивший на церемонии с речью et al. 2002c), но регенерации растений не была достигнута. После разработки усовершенствованных протоколов для protoplast изоляции, культуры и регенерации из клетки мезофилла листьев (Кренц et al, 1990; Hall et al., 1993a), как электро - и PEG-fusion сахара, кормов и море свеклы протопластов в различных комбинаций была предпринята попытка путем изменения напряжения, времени и частоте импульсов (Hall et al., 1993b). Ограниченное количество микро-Калли были получены из плавленого протопласты, но асимметричный характер костной мозоли не подтвердилась. Используя оптимизированный протокол изолировать и культуре протопластов (выступивший на церемонии с речью et al., 2002b), фьюжн мезофильных - и подвеска-производные протопластов и последующего развития микро-Калли были достигнуты, но сбой регенерации (выступивший на церемонии с речью et al., 2002c). Что касается асимметричной ячейки гибридизации, возможности применения различных видов УФ-излучения для донорских клеток до лечения было сделано (Hall et al., 1992a,b,c; Jazdzewska et al., 1995).

Нет технологий, упомянутых в этом разделе, т.е., electropora - ции, ультразвуковой обработки и соматической гибридизации, в результате растений-регенерантов и, следовательно, не преследовались для трансформации. Это несмотря на ожидания, что усовершенствованные протоколы для protoplast изоляции и регенерации, особенно с высокой totipotency, охранник-cell протопластов (Hall et al., 1996a,b), в дальнейшем будет способствовать успешной трансгенной сахарной свеклы растениеводства через electropora - ции или ультразвуковой обработки (Kaffka и Lemaux, 1996; Возняк, 1999; Skaracis и МакГрат, 2005).

E. Выбор Стратегии

Выбор селективных маркеров для преобразования имеет важное значение для его успеха. Гербицид-толерантность и антибиотико-резистентности гены были широко использованы для сахарной свеклы. Гербицид-толерантность гены имеют преимущество, что позволяет на строгий отбор, но может позволить спасается (D'Halluin et al., 1992 г.; Mannerlof et al., 1997). Также такие гены могут перемещать через пыльцу диких родственников (Сантони и Berville, 1992; Будри et al., 1993; Барч и Поль-Orf, 1996; Барч etal., 1999 г.), что создает потенциальную угрозу экологической проблемой устойчивых к гербицидам сорняков (Wevers, 1998; Гебхард и Smala, 1999; Джасемом, 2000; Мэдсен и Sandoe, 2001; Беннетт et al., 2004). Антибиотико-резистентных генов, которые кодируют ферменты, инактивирующие антибиотики безвредны, но их применение вызвало озабоченность по поводу того, что такие гены будет передавать инфекционные бактерии (Dale, 1992; Миккельсен et al., 1996; Meier и Wack - ernagel, 2003). Имеет практического значения для трансформации результатов с высокой естественной толерантности растительных клеток аминогликозидных антибиотиков, что приводит к высокой частоты (escape (Konwar, 1994; Линдси и Галуа, 1990; Hisano et al, 2004).

Дата добавления: 2015-11-04