За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, которое превращает 1 мкмоль субстрата за одну минуту при 25оС и оптимальном значении рН.
2.2.2.2. Определение количества белка
Определение общего количества белка проводили по методу Лоури [Lowry O.H. Protein meacuament with the folin pihend reagent / O.H. Lowry, H.J. Rosebrough, A.H. Papp, B.J. Bandace // J. Biologi. – 1951. – Vol. 193. – P. 265–275.]. Метод основан на образовании комплексного окрашенного соединения в результате взаимодействия белка со щелочным раствором сульфата меди (биуретовая реакция) и вольфраматом и молибдатом натрия (реакция Фолина на тирозиновые и цистеиновые радикалы). Количество белка рассчитывали по формуле:
А = 0,37 ∙ D ∙ V1 / V2,
где D – оптическая плотность при 750 нм;
V1 – объём фракции или общий объём гомогената, мл;
V2 – объем внесения, мл;
0,37 – коэффициент поглощения раствора Фолина.
Оптическую плотность растворов определяли на спектрофотометре СФ-2000 (Россия) при 750 нм.
2.2.2.3. Электрофоретические исследования белков
Электрофоретическое исследование проводили по методу Девиса [Davis B.J. Disc electrophoresis II. Method and aplication to human serum protein / B.J. Davis // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 1994. – Vol. 121. – P. 404–427.]. Для концентрирования белкового раствора готовили крупнопористый 4% полиакриламидный гель. Концентрирующий гель содержал Tris-HCl рН 6,7, ТЕМЕД, акриламидную смесь (10% АСА / 2,5% МВА). Разделение осуществляли на разделяющем (мелкопористом) 8% полиакриламидном геле (содержал Tris-HCl, рН 8,3, ТЕМЕД, акриламидную смесь (30% АСА/ 0,8% МВА), персульфат аммония). После окончания процесса полимеризации наносили исследуемые пробы. На один карман пластинки наносили не более 3-5 мкг белка исследуемого образца. Электродный буфер представлял собой смесь 0,5 М Трис-глицеринового буфера рН 8,3.
Для контроля движения фронта в пробу вносили 0,1% раствор бромфенолового синего. Электрофорез ферментативных препаратов проводили при постоянном токе силой 2,0 мА из расчета на одну пробу, а затем силу тока увеличивали до 4-5 мА.
2.2.2.4. Специфическое проявление изоцитратлиазы
Специфическую идентификацию фермента выявляли с помощью модифицированного реагента Шиффа [Reeves H.C. Determination of isocitrate lyase activity in polyacrylamide gels / H.C. Reeves, M.J. Volk // Anal. Biochem. – 1972. – Vol. 48, № 2. – P. 437-441.].
Методика основана на способности глиоксилата образовывать с модифицированным реагентом Шиффа сильно окрашенное соединение, которое стабильно, достаточно специфично и не сразу диффундирует в гель.
Гели окрашивали путём помещения их в инкубационную среду следующего состава: 50 мМ Трис HCl буфер, рН 7,5; 1 мМ ЭДТА; 3 мМ MgCl2.6Н2О; 3 мМ ДТТ; 10 мМ изоцитрат (трёхнатриевая соль); 1,2 мл модифицированого реагента Шиффа. Гель инкубировали при 37 0С до появления ярко-красной полосы в месте локализации ИЦЛ.
2.2.2.5. Исследование субклеточной локализации
Исследование субклеточной локализации изоцитратлиазы в проростках амаранта проводили с помощью изоплотностного центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. После предварительного осаждения неразрушенных остатков тканей и ядер центрифугированием при 1000g в течение 3-4 минут супернатант подвергали дальнейшему центрифугированию в течение ещё 3-4 минут. Полученный супернатант центрифугировали 18 минут при 12000g, а затем – 20-30 минут при тех же оборотах. После этого осадок, растворённый в 10 мл среды выделения, наносили на вершину градиента сахарозы со ступенями 1,3; 1,5; 1,8; 2,3; 2,5 М, уравновешенного 50 мМ Tris-HCl-буфером, содержащим 1 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотрейтол и 0,5 мМ ЭДТА. Градиент центрифугировали в течение 2 ч при 100000g. Осадки использовали для определения активности исследуемого фермента. Степень перекрёстного загрязнения органелл определяли по маркерным ферментам. Для пероксисом в качестве маркеров использовали каталазу.
2.2.2.6. Выделение суммарной клеточной популяции РНК
Суммарную клеточную РНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции [Chomczynski P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction extraction /P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. - 1987. - vol. 162. - pp. 156-159.] со следующими модификациями. Для ингибирования РНКаз на стадии получения клеточного лизата использовали 42,6% гуанидин тиоцианат. Очистку РНК проводили при помощи осаждения хлоридом лития. Качественный анализ препаратов РНК проводили путём неденатурирующего электрофореза в 1% (в/о) геле агарозы при напряжённости электрического поля 7 В/см. Окрашивание геля производилось 0,1% водным раствором бромистого этидия. Визуализация результатов проводилась с использованием трансиллюминатора с длиной волны 312 нм. Результаты фиксировались цифровой видеокамерой Samsung и обрабатывались с помощью пакета программ Gel Explorer 1.0.
2.2.2.7. Проведение обратной транскрипции
Обратную транскрипцию проводили с использованием ревертазы RevertAid M-MuLV (Fermentas, Литва) согласно рекомендациям фирмы-производителя. Для проведения обратной транскрипции использовали 1 мкг суммарной клеточной РНК. В качестве затравочного использовался олиго-(dT)20 праймер. Для предотвращения деградации матриц РНК в реакционную смесь вносилось 20 ед. ингибитора РНКаз IRNasine.
2.2.2.8. Подбор праймеров
Так как специфичность ПЦР, т.е. отсутствие посторонних ампликонов, принципиально важна для количественного анализа, подбор праймеров был важным этапом работы. При этом в первую очередь учитывались GC – состав, уникальность последовательности в геноме, а также отсутствие самокомплементарности внутри праймера и в паре. При подборе праймеров для обратной транскрипции и ПЦР анализа оптимальными считали праймеры, имеющие >50% G/C – пар и не имеющие в геноме других мишеней, комплементарных более чем к 10-11 нуклеотидам на 3'-конце.
Подбор праймеров осуществляли на основе сравнения аминокислотных последовательностей изоцитратлиазы из разных организмов. Поиск гомологичных последовательностей в геномах нематоды, прокариот и растений проводился с использованием базы данных NCBI (США, http://www.ncbi.hlm.nih.gov/). Для этого проводили выравнивание последовательностей с помощью программы AliBee – Multiple alignment Release 2.0 (http://www.genebee.msu.su/services/malign_reduced.html) с целью выявления наиболее консервативных участков. Подобранные на основе аминокислотных последовательностей праймеры проверяли на наличие образования димеров и вторичных структур с помощью программы FAST PCR.
2.2.2.9. Проведение полимеразной цепной реакции
Последующую полимеразную цепную реакцию [Епринцев А.Т. Полимеразная цепная реакция как универсальный метод диагностики и идентификации генов / А.Т. Епринцев, Е.А. Москалев, В.Н. Попов // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. – 2001. – Т. 54, № 1. – С. 9-14.]с ген-специфичными вырожденными праймерами проводили с помощью набора реактивов AmpliSence (Хеликон, Россия).
Для ПЦР анализа использовали праймеры, подобранные на основе аминокислотной последовательности:
прямой - 5'-TGYGGNCAYATGGGNGG-3'; обратный - 5'-DCTRCARTTRTANGC-3'. Температура отжига праймеров составляла 54оС.
Реакция ПЦР проводилась на приборах «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) и Biometra Personal Cycler (Biometra, Германия) со следующими параметрами амплификации: предварительная денатурация при 95оС в течение 5 мин, затем 35 циклов: 95оС – 20 с, 54оС – 20 с, 72оС – 30 с, и, наконец, 72оС – 4 мин.
Исследование результатов полимеразной цепной реакции проводили при помощи электрофореза в 1% геле агарозы при напряжённости электрического поля 7 В/см. Окрашивание геля производилось 0,1% водным раствором бромистого этидия. Визуализация результатов проводилась с использованием трансиллюминатора с длиной волны 312 нм. Размер продуктов определяли путём сравнения с маркерами ДНК известной длины (СибЭнзим, Россия).
2.2.2.10. Секвенирование ПЦР-продукта
Разделение фрагментов ДНК проводили методом вертикального электрофореза в ПААГ различной концентрации [Maniatis T. Molecular cloning / T. Maniatis, E.F. Frisch // J. Sambrook // Cold Spring Harbor Lab. – 1982. – Vol. 65. – P. 141-146.]. Качество выделенной ДНК проверяли в 4% ПААГ, а для разделения ампликонов после проведения ПЦР использовали 5% ПААГ. Для визуализации фронта использовали смесь красителей бромфенолового синего и ксиленцианола. Электрофорез проводили в буфере ТВЕ (89 мМ Tris-HCl, 89 мМ борная кислота, 2 мМ EDTA, рН 8,0) в поле с напряжением 200-250 В и силой тока 70-110 мА. После разделения фрагментов гель окрашивали бромистым этидием и визуализировали на трансиллюминаторе.
2.2.2.11. Проведение ПЦР в реальном времени
Для выяснения изменения уровня экспрессии генов icl1 и icl2 амаранта, проводили ПЦР-РВ на приборе DNA Engine® Thermal Cycler «Chromo4» (Bio-Rad, США), используя в качестве красителя SYBR Green [Tzachi B. Kinetic Outlier Detection (KOD) in real-time PCR / B. Tzachi // Nucleic Acids Research. – 2003. – Vol. 31. – P. 105-109.]. Подбор праймеров осуществляли на основе сравнения нуклеотидных последовательностей генов ИЦЛ с использованием программного обеспечения Primer3 [Rozen S. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers / S. Rozen, H. Skaletsky // Methods Mol. Biol. – 2000. – Vol. 132. – P. 365-386.]. Праймеры для ПЦР-РВ анализа были следующими: прямой - 5'-TGYGGNCAYATGGGNGG-3'; обратный - 5'-DCTRCARTTRTANGC-3'.Параметры амплификации: предварительная денатурация при 95оС в течение 5 мин, затем 35 циклов: 95оС – 20 с, 54оС – 20 с, 72оС – 15 с (детекция) и, наконец, финальная элонгация 72оС – 4 мин.
2.2.2.12. Статистическая обработка данных
Опыты проводили в 3 кратной биологической повторности, аналитическое определение для каждой пробы – в трех повторностях. Для определения достоверности результатов применяли метод вариационной статистики. Для построения графиков применяли программы линейной и параболической аппроксимации. При математической обработке использовали статистический критерий Стъюдента.
Из данных исследования (вариант хi) находили среднее арифметическое х (М); затем вычисляли отклонения каждой варианты от среднего значения (хi – х), после чего рассчитывали квадраты отклонения варианты от среднего значения (хi – х)2, затем находили сумму квадратов отклонений Σ (хi – х)2. Далее вычисляли среднее квадратичное отклонение вариант от среднего арифметического (σ) для контроля и опыта по формуле:
,где n – число вариант.
Затем находили ошибку данных контроля и опыта, после чего рассчитывали нормированное отклонение (t). Значение t, то есть оценка достоверности различий между контролем и опытом, сравнивалась по таблице распределения Стьюдента. Если вычисленное значение совпадает с табличным или больше его, то разницу в эксперименте считали достоверной. Обсуждаются статистически достоверные различия при р≤0,05 [Филлипович Ю.Б. Основы биохимии / Ю.Б. Филлипович. – М.: Высш. шк. 1993.– 496 с.]; [Чернышев Г.А. Вероятность и статистика в биологии и химии / Г.А. Чернышев, В.Н. Стариков – Воронеж: Изд-во ВГУ, 1998. – 270 с.].
2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
2.3.1. Динамика активности изоцитратлиазы из проростков амаранта
Изучение динамики активности изоцитратлиазы в проростках семян амаранта Amaranthus caudatus L. в течение 10 дней показало, что наблюдается ее индукция с первых дней прорастания, достигающая максимального значения уже на 2-3 сутки (рис.?). Возрастание активности ИЦЛ свидетельствует об активном функционировании глиоксилатного цикла, обеспечивающего конверсию запасных липидов в растворимые формы углеводов. К 10 суткам величина активности ИЦЛ постененно снижалась. В условиях гетеротрофного питания в масличных растениях важную роль играет глюконеогенез, обеспечивающий мобилизацию запасных липидов. Анализ полученных данных по динамике изоцитратлиазной активности показывает корреляцию ее величины от этапа онтогенеза амаранта.
Рис.?. Динамика активности изоцитратлиазы в проростках семян амаранта.
2.3.2. Изоферментный состав ИЦЛ в проростках амаранта
С помощью электрофореза в 8% ПААГ с последующим специфическим окрашиванием на активность изоцитратлиазы был проанализирован её изоферментный состав в семенах исследуемого объекта. В семенах 3х-дневных проростков амаранта было обнаружено две изоформы фермента с различной электрофоретической подвижностью (Rf 0,27 и 0,31) (рис.?).
Рис.?. Электрофореграмма ИЦЛ. Специфическое проявление ИЦЛ из 3х дневных проростков амаранта: 1 и 2 – белковые полосы, соответствующие ИЦЛ1 и ИЦЛ2; F – фронт красителя.
Также при работе с другими объектами на нашей кафедре были получены аналогичные результаты. Так, в семенах сои и щитках кукурузы так же обнаружены две изоформы изоцитратлиазы с различным значением Rf: 0,28 и 0,44 для сои; 0,25 и 0,29 для кукурузы. В зелёных листьях данных объектов выявлено лишь по одной белковой полосе, причём значения их электрофоретических подвижностей совпадали с медленнодвижущими формами в семенах.
2.3.3. Исследование субклеточной локализации ИЦЛ
В проростках амаранта субклеточную локализацию изоцитратлиазы определяли методом дифференциального и изоплотностного центрифугирования, в ходе которого выделили цитоплазматическую, глиоксисомальную, митохондриальную фракции. Как видно из рисунка 5, активность ИЦЛ распределилась по фракциям неравномерно. Наибольшая активность фермента сосредоточена преимущественно в осадке, содержащем грубую фракцию микротелец.
Рис.5.Распределение активности ИЦЛ между фракциями, полученными в результате дифференциального центрифугирования.
Вывод о субклеточной локализации изоцитратлиазы делали на основании равенства:
Е кат. пер. / Е кат. цтп = Е ицл пер. / Е ицл цтп,
где Е кат. пер. и Е ицл пер. – активности каталазы и ИЦЛ в пероксисомах;
Е кат. цтп и Е ицл цтп – активности каталазы и ИЦЛ в цитоплазме.
Поскольку соотношение активности каталазы и изоцитратлиазы в цитоплазматической фракции и фракции микротелец равно:
1,93 / 6,11 = 2,42 / 7,87 (табл.1).
можно предположить, что обнаруживаемая активность ИЦЛ в цитоплазме является результатом работы другой изоформы исследуемого энзима.
В результате проведённых расчётов было выявлено, что изоцитратлиаза из проростков амаранта имеет две изоформы, одна из которых имеет глиоксисомальную локализацию, а вторая представлена в цитоплазме.
Таблица 1.
Субклеточная локализация ИЦЛ в амаранте после разделения грубой фракции микротелец методом изоплотностного центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (n=3, P<0,05)
Фермент | Цитоплазма | Глиоксисомы | ||||||
V, мл | Белок, мг | Е | Уд.акт., Е/мгбелка | V, мл | Белок, мг | Е | Уд.акт., Е/мгбелка | |
ИЦЛ | 9,44 | 2,42 | 0,26 | 4,95 | 7,87 | 1,59 | ||
Каталаза | 9,44 | 1,93 | 0,21 | 4,95 | 6,11 | 1,23 |
2.3.4. Идентификация генов изоцитратлиазы
2.3.4.1. Выделение суммарной клеточной популяции РНК
В результате применения оптимизированной методики выделения с использованием фенол-хлороформной экстракции была проведена экстракция суммарной клеточной РНК из семян амаранта [Blackburn P. Ribonuclease inhibitor from human placenta: interaction with derivatives of ribonuclease A / P. Blackburn, B.L. Jailkhani // J Biol Chem. - 1979. - vol. 254. - pp. 12488-93.]. В ходе выделения в качестве хаотропного агента был использован гуанидин-изотиоцианат. Применение данного соединения позволило получить высокоочищенные препараты недеградированной РНК из растительных клеток, что было установлено путём проведения аналитического электрофореза в 1% агарозном геле (рис.?). На приведённой электрофореграмме результатов типичного выделения видно, что количество 28S рРНК преобладает над 18S рРНК, что свидетельствует об отсутствии деградации препарата под действием РНКаз. Кроме того, в полученных препаратах отсутствовали примеси геномной ДНК, что является важным условием успешного проведения дальнейших манипуляций с выделенной РНК и позволяет получать достоверные и воспроизводимые результаты при измерении концентрации растворов РНК и проведении полимеразной цепной реакции.
Рис.?. Электрофорез суммарной клеточной РНК из семян амаранта, в 1% агарозном геле в присутствии бромистого этидия. 7 – день прорастания семян.
2.3.4.2. Проведение обратной транскрипции
Для синтеза первой цепи комплементарной ДНК использовалась рекомбинантная обратная транскриптаза вируса Moloney лейкоза мышей M-MuLv. Данный фермент состоит только из одной субъединицы и проявляет 5’→3’ праймер-зависимую полимеразную активность, эффективную только в отношении матриц РНК [High-efficiency cloning of full-length cDNA; construction and screening of cDNA expression libraries for mammalian cells / H. Okayama [et al.] // Methods Enzymol. - 1987. - vol. 154. - pp. 3-28.]. В качестве затравочного праймера использовался олиго-(dT)20 праймер.
Использование данного праймера позволяет избирательно перевести в форму ДНК только молекулы информационной РНК, представляющих собой транскрипты работающих генов. Применение в реакционной смеси ингибитора РНКаз IRNasine [Chomczynski P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction extraction /P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. - 1987. - vol. 162. - pp. 156-159.] позволило избежать деградации матриц РНК во время протекания реакции и получить набор комплиментарных ДНК (рис.?). Полученные в ходе обратной транскрипции продукты использовались далее для проведения полимеразной цепной реакции.
Рис.?. Продукты обратной транскрипции суммарной клеточной РНК семян амаранта с использованием ревертазы M-Mulv и олиго-(dT)20 праймера.
2.3.4.3. Проведение полимеразной цепной реакции
Обратная транскрипция выделенной РНК и последующий ПЦР-анализ кДНК с вырожденными праймерами для icl1 и icl2 генов изоцитратлиазы показали наличие двух полос на гель-электрофорезе (рис.?), что свидетельствует об экспрессии этих генов. Анализ банка данных GeneBank показал, что в геноме амаранта изоцитратлиаза кодируется двумя генами, расположенными в разных хромосомах.
Рис.?. Результаты ПЦР на матрице кДНК с использованием вырожденных праймеров для генов icl1 и icl2. М – маркеры; 2 – день прорастания семян амаранта.
Полученные результаты показывают, что в геноме амаранта, на стадии прорастания семян экспрессируются одновременно два гена изоцитратлиазы.
Экспрессия двух генов в семенах амаранта связана с тем, что в период прорастания клетки зародыша нуждаются в большом количестве энергии и материала для биосинтетических процессов. На начальных этапах прорастания семена осуществляют гетеротрофный тип питания, используя в качестве субстратов запасные вещества. В том числе, осуществляется процесс превращения запасных жиров в углеводы через глиоксилатный цикл, являющийся звеном глюконеогенеза.
2.3.4.4. Определение нуклеотидной последовательности продуктов полученных методом ПЦР
Так как при проведении ПЦР анализа нами использовались вырожденные праймеры, подобранные на основе сравнения аминокислотных последовательностей в белковых молекулах ИЦЛ из организмов различных таксономических групп, возникла необходимость достоверно убедиться, что полученные ПЦР-продукты являются участками разных генов кодирующих изоцитратлиазу. Для этого полученные ПЦР-продукты экстрагировали из геля по методике, описанной в [Maniatis T. Molecular cloning / T. Maniatis, E.F. Frisch // J. Sambrook // Cold Spring Harbor Lab. – 1982. – Vol. 65. – P. 141-146.].
Очищенные нуклеотидные последовательности секвенировали и сравнили с генетической базой данных. Получили……………….
2.3.4.5. Изменение экспрессии генов изоцитратлиазы в проростках амаранта
Для оценки количественных показателей интенсивности работы генов кодирующих изоферменты изоцитратлиазы использовали метод ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя Sybr Green. Этот метод позволяет количественно оценить скорость транскрипции генов. Кроме того, ПЦР-РВ дает возможность оценить изменения в интенсивности работы гена в зависимости от экспериментальных условий и действия внешних факторов. Данный метод позволяет оценивать результаты работы гена, т.е. концентрацию мРНК, на основе анализа кДНК [Tzachi B. Kinetic Outlier Detection (KOD) in real-time PCR / B. Tzachi // Nucleic Acids Research. – 2003. – Vol. 31. – P. 105-109.]. Для этого суммарную РНК, выделенную из различных органов растения, экспонируемых в разные временные периоды, подвергали обратной транскрипции с целью получения кДНК.
Показано, что на 2-е сутки в проростках амаранта экспрессия генов достигла максимального значения, и величина относительных единиц экспрессии составило 1,53 ед. Далее уровень экспрессии постепенно снижался, и к 5-м суткам достиг минимального значения с величиной относительных единиц экспрессии равной 0,4 ед., что в 4 раза меньше, чем значение на 2-е сутки. Затем наблюдалось небольшое повышение уровня экспрессии генов, и к 9-м суткам ее значение снизилось в 2,3 раз по сравнению с максимальным значением, но увеличилось в 1,75 раз относительно минимального значения, и величина относительных единиц экспрессии равна 0,7 ед. (Рис.?).
Рис.? Относительный уровень экспрессии генов изоцитратлиазы в проростках амаранта.
Кроме того, параллельно проводили измерение активности ИЦЛ в течение всего исследуемого периода (рис?.). Так, динамика активности ИЦЛ в проростках амаранта в течение 9-ти дней имела характерную колокообразную кривую с вершиной на 2-3-и сутки. Эти данные хорошо коррелировали со значением относительных единиц экспрессии генов icl.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Изучение динамики активности изоцитратлиазы в проростках амаранта Amaranthus caudatus L. в течение 9 дней показало, что она индуцируется с первых дней прорастания и достигает максимального значения уже на 2-3 сутки. Возрастание активности ИЦЛ свидетельствует об активном функционировании глиоксилатного цикла. К 9 суткам величина активности ИЦЛ постененно снижалась.
Анализ изоферментного состава изоцитратлиазы в семенах исследуемого объекта показал, что в 3х-дневных проростках амаранта было обнаружено две изоформы фермента с различной электрофоретической подвижностью (Rf 0,27 и 0,31) (рис.?).
В ходе исследование субклеточной локализации изоцитратлиазы методом дифференциального и изоплотностного центрифугирования выделили цитоплазматическую, глиоксисомальную, митохондриальную фракции. При этом активность ИЦЛ распределилась по фракциям неравномерно. Наибольшая активность фермента была сосредоточена преимущественно в осадке, содержащем грубую фракцию микротелец. В результате проведённых расчётов на основании равенства активности каталазы и ИЦЛ в пероксисомах и цитоплазме было выявлено, что изоцитратлиаза из проростков амаранта имеет две изоформы, одна из которых имеет глиоксисомальную локализацию, а вторая представлена в цитоплазме.
Изучение, включавшее выделение суммарной клеточной популяции РНК, проведение обратной транскрипции, получение комплементарной ДНК и ОТ-ПЦР анализ, показало, что в ходе прорастания семян амаранта экспрессируются оба гена изоцитратлиазы - icl1 и icl2.
Секвенирование???
Изменение экспрессии генов icl в проростках амаранта показало максимальное значение относительных единиц экспрессии (1,53 ед.) на 2-е сутки. К 5-м суткам это значение снизилось до минимального (0,4 ед.), и далее наблюдалось незначительное повышение уровня экспрессии на 9-е сутки (0,7 ед.), что связано по-видимому с истощением запаса питательных веществ в семенах. Также наблюдалась корреляция динамики активности ИЦЛ со значениями относительных единиц экспрессии генов icl.
Таким образом, анализ полученных в ходе исследования данных позволяет заключить, что глиоксилатный цикл может иметь более универсальное распространение в организмах, чем считалось ранее. При этом данный метаболический путь не функционирует на протяжении всего онтогенеза, а индуцируется на определенных его стадиях и выполняет ключевую роль в мобилизации запасного пула жирных кислот.
ВЫВОДЫ
1. Изучение динамики активности ИЦЛ из проростков амаранта показало, что максимальное значение активности фермента наблюдалось на 2--3 день прорастания, что связано с интенсификацией глюконеогенеза.
2. Анализ изоферментного состава ИЦЛ показал наличие двух изоформ фермента с различной величиной электрофоретической подвижности (Rf 0,27 и 0,31) (рис.?).
3. Исследование субклеточной локализации изоцитратлиазы выявило, что одна изоформа имеет глиоксисомальную локализацию, а вторая представлена в цитоплазме.
4. Методом ОТ-ПЦР анализа, с использованием вырожденных праймеров к генам изоцитратлиазы, установлено, что в семенах амаранта активно транскрибируются два гена – icl1 и icl2.
5.
6. Методом полимеразной цепной реакции в реальном времени установлена зависимость уровня экспрессии генов изоцитратлиазы от этапов онтогенеза. Максимальный уровень экспрессии генов icl наблюдался на 2-е сутки прорастания (1,53 ед.), минимальный – на 5-е сутки (0,4 ед.). К 9-м суткам наблюдалось незначительное увеличение относительно минимального значения уровня экспрессии (0,7 ед.). Данные значения коррелируют с показателями динамики активности ИЦЛ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
Дата добавления: 2015-11-04; просмотров: 26 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |