Министерство образования и науки РФ
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
«Воронежский государственный университет»
БИОЛОГО-ПОЧВЕННЫЙ ФАКУЛЬТЕТ
КАФЕДРА БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ КЛЕТКИ
Идентификация генов изоцитратлиазы из проростков Amaranthus caudatus L. сорта «Рыжик» и их экспрессия.
Магистерская диссертация
????, биология
Биохимия
Допущено к защите в ГАК
Зав. кафедрой биохимии «_____» А.Т. Епринцев д-р биол. наук проф._._.2013
и физиологии клетки:
Студент: «_____» И. О. Обоймова
Руководитель: «_____» Д.Н. Федорин канд. биол. наук, ассистент
Воронеж 2013
РЕФЕРАТ
УДК.
Обоймова Ирина Олеговна (Идентификация генов изоцитратлиазы из проростков Amaranthus caudatus L. сорта «Рыжик» и их экспрессия)
ВГУ Воронеж 2013.
Содержит? страниц основного текста, рисунков?, таблиц?,? источника литературы.
ГЛИОКСИЛАТНЫЙ ЦИКЛ, ИЗОЦИТРАТЛИАЗА, ГЛЮКОНЕОГЕНЕЗ, РНК, кДНК, ПЦР, ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ.
Целью работы является исследование???. Изучение динамики активности изоцитратлиазы в проростках амаранта Amaranthus caudatus L. в течение 9 дней показало, что она индуцируется с первых дней прорастания и достигает максимального значения уже на 2-3 сутки. Определение изоферментного состава ИЦЛ показало наличие двух изоформ с величинами Rf 0,27 и 0,31. Установлено, что одна изоформа изоцитратлиазы локализуется в глиоксисомальной фракции, а вторая находится в цитоплазме. Проведен ОТ-ПЦР анализ, который показал, что в семенах амаранта активно транскрибируются два гена – icl1 и icl2.?????????? Методом полимеразной цепной реакции в реальном времени установлена зависимость уровня экспрессии генов изоцитратлиазы от этапов онтогенеза. Максимум наблюдался на 2-е сутки прорастания (1,53 ед.), минимум – на 5-е сутки (0,4 ед.). К 9-м суткам наблюдалось незначительное увеличение относительно минимального значения уровня экспрессии (0,7 ед.). Данные значения коррелируют с показателями динамики активности ИЦЛ.
Студент И.О. Обоймова
Научный руководитель Д.Н. Федорин
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АДФ – аденозиндифосфат
АМФ – аденозинмонофосфат
АТФ – аденазинтрифосфат
ГДФ - гуанозиндифосфат
ГТФ – гуанозинтрифосфат
ГЦ – глиоксилатный цикл
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ДТТ – дитиотрейтол
ДЭАЭ – диэтиламиноэтил
ИЦЛ – изоцитратлиаза
кДНК – комплементарная ДНК
МДГ – малатдегидрогенеза
МС – малатсинтаза
НАД+ – никотинамидадениндинуклиотид
ОАА – оксалоацетат
ПААГ – полиакриламидный гель
ПВК – пировиноградная кислота
ПЦР – полимеразная цепная реакция
ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция в реальном времени
РНК – рибонуклеиновая кислота
СФ – спектрофотометр
ТЕМЕД - N,N,N',N' - тетраметилэтилен диамин
ФЕП – фосфоенолпируват
ЦС – цитратсинтаза
ЦТК – цикл трикарбоновых кислот
ЭДТА – этилендиаминтетраацетат
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Функциональная характеристика изоцитратлиазы и ее роль в регуляции клеточного метаболизма
1.1.1. Общая характеристика глюконеогенеза
1.1.2. Глюконеогенез в растениях
1.1.3. Глюконеогенез у животных
1.1.4. Глиоксилатный цикл
1.1.4.1. Роль глиоксилатного цикла в глюконеогенезе
1.1.4.2. Субклеточная локализация изоцитратлиазы
1.1.4.3. Распространение глиоксилатного цикла
1.1.4.3.1. Рапространение глиоксилатного цикла у микроорганизмов, низших растений и грибов
1.1.4.3.2. Функционирование глиоксилатного цикла у высших растений
1.1.4.3.3. Глиоксилатный цикл в тканях животных
1.1.5. Изоферментный состав изоцитратлиазы
1.2. Молекулярные аспекты регуляции ИЦЛ
1.2.1. Экспрессионная регуляция изоцитратлиазы
1.2.2. Генетические механизмы регуляции синтеза ИЦЛ
1.2.3. Характеристика структурной организации генетического материала изоцитратлиазы
1.2.4. Эволюция ферментов глиоксилатного цикла
1.3. Особенности метаболизма нетрадиционной культуры амаранта
1.3.1. Морфо-физиологические и биохимические свойства амаранта
1.3.2. Химический состав амаранта
Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ
2.2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.2.1. Объект исследования
2.2.2. Методы исследования
2.2.2.1. Определение активности изоцитратлиазы
2.2.2.2. Определение количества белка
2.2.2.3. Электрофоретические исследования белков
2.2.2.4. Специфическое проявление изоцитратлиазы
2.2.2.5. Исследование субклеточной локализации
2.2.2.6. Выделение суммарной клеточной популяции РНК
2.2.2.7. Проведение обратной транскрипции
2.2.2.8. Подбор праймеров
2.2.2.9. Проведение полимеразной цепной реакции
2.2.2.10. Секвенирование ПЦР-продукта
2.2.2.11. Проведение ПЦР в реальном времени
2.2.2.12. Статистическая обработка данных
2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
2.3.1. Динамика активности изоцитратлиазы из проростков амаранта
2.3.2. Изоферментный состав ИЦЛ в проростках амаранта
2.3.3. Исследование субклеточной локализации ИЦЛ
2.3.4. Идентификация генов изоцитратлиазы
2.3.4.1. Выделение суммарной клеточной популяции РНК
2.3.4.2. Проведение обратной транскрипции
2.3.4.3. Проведение полимеразной цепной реакции
2.3.4.4.Определение нуклеотидной последовательности продуктов полученных методом ПЦР
2.3.4.5. Изменение экспрессии генов изоцитратлиазы в проростках амаранта
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
ВВЕДЕНИЕ
Одним из приоритетных направлений развития физиологии и биохимии растений является исследование регуляции метаболических процессов, происходящих в растительном организме. Особый интерес вызывает функционирование важнейшего этапа глюконеогенеза - глиоксилатного цикла, а также изоцитратлиазы (ИЦЛ; КФ 4.1.3.1.) – ключевого фермента в процессе трансформации липидов в доступные для организма формы углеводов.
Изоцитратлиаза имеет широкое распространение в природе и функционирует в различные физиологические периоды жизни у многих организмов. Этот фермент считается большинством авторов маркерным ферментом глиоксилатного цикла [Епринцев А.Т. Глиоксилатный цикл: универсальный механизм адаптации? / А.Т. Епринцев, В.Н. Попов, М.Ю. Шевченко. – М.: ИКЦ «Академкнига», 2007. – 228 с.], физиологическая роль которого для растений – участие в глюконеогенезе, обеспечивающим растущий организм в условиях гетеротрофного питания доступными формами органического вещества. Однако, в работах А. У. Игамбердиева (1990) сообщалось о наличии второй изоформы, локализованной вне глиоксисом – внеглиоксисомальная форма. Известно так же, что активность изоцитратлиазы увеличивается при старении растения, что даёт возможность преобразовывать липиды в органические кислоты. Таким образом, изоцитратлиаза растений представлена двумя формами, имеющими глиоксисомальную и внеглиоксисомальную локализации.
В последнее время появились сообщения о полифункциональности данной изоферментной системы. Работа данной системы позволяет метаболизировать двухуглеродные соединения, которые токсичны для клетки, и использовать их как строительный материал. В растительном организме в процессе фотодыхательного метаболизма образуется глиоксилат, являющийся токсичным для клетки соединением, но благодаря синтазной реакции ИЦЛ он может использоваться как в катаболических, так и в анаболических реакциях.
Амарант является нетрадиционной сельскохозяйственной продовольственной культурой, относится к С4-растениям, обладает большим количеством белка, аминокислот, витаминов, макро- и микроэлементов. Также он обладает очень большой засухоустойчивостью и при этом очень хорошо реагирует на полив, что позволяет выращивать его в районах непригодных для традиционных зерновых и зернобобовых культур. Эти особенности делают амарант перспективной культурой, которая может занять свою нишу в сельском хозяйстве. Поэтому исследование в онтогенезе характеристик ферментов, которые регулируют процессы мобилизации жиров, особенно, при смене типов питания, представляет значительный научный интерес.
Исследование отдельных звеньев метаболических процессов, связанных с трансформацией липидов в углеводы, является актуальной задачей не только биохимии, но и молекулярной биологии. В связи с этим целью данной работы являлось выделение из проростков семян амаранта суммарной матричной РНК и идентификация генов, кодирующих изоферменты изоцитратлиазы.
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Функциональная характеристика изоцитратлиазы и ее роль в регуляции клеточного метаболизма
1.1.1. Общая характеристика глюконеогенеза
Биосинтез глюкозы и других углеводов из более простых предшественников является в количественном отношении наиболее важным процессом в биосфере. Превращение глюкозы в пировиноградную кислоту, катализируемое ферментами гликолиза, является центральным путем катаболизма углеводов в большинстве клеток как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Точно также обратный процесс — превращение пирувата в глюкозу — является наиболее важным общим путем биосинтеза моно- и полисахаридов. В этот центральный биосинтетический путь вливаются два главных «питающих пути»: один из них из ряда реакций, посредством которых интермедиаты ЦТК, лактат, большинство аминокислот, пропионат превращаются в пировиноградную кислоту (рис.1) - это процесс, протекающий у всех организмов - глюконеогенез; второй важный путь состоит в восстановлении СО2 до глюкозы - этот путь является отличительной особенностью автотрофов.
Стадии глюконеогенеза:
1) Жирные кислоты ® b- окисление ® Ацетил КоА
2) Ацетил-КоА ® Глиоксилатный цикл ® Сукцинат
3) Янтарная кислота ® Реакции ЦТК ® Оксалоацетат
4) Оксалоацетат ® Фосфоенолпируваткарбоксикиназа ® ФЕП
5) ФЕП ® Обращенный гликолиз ® Углеводы
Два первых этапа этого процесса локализованы в глиоксисомах, цикл трикарбоновых кислот - в митохондриях, а последующие два этапа - в растворимой части цитоплазмы.
Глюконеогенез реализуется путем обращения некоторых стадий гликолиза, однако, в гликолитическом пути имеются три необратимых стадии, которые не могут использоваться при превращении пирувата в глюкозу, поэтому используются альтернативные реакции (обходные пути), которые термодинамически благоприятствуют синтезу глюкозы.
Первый обходной путь у некоторых животных требует совместного действия цитозольных и митохондриальных ферментов. Реакция, осуществляемая под действием митохондриальной пируваткарбоксилазы, выглядит следующим образом (рис.1):
ПВК + СО2 + АТФ + ацетил-КоА = ОАА + АДФ + Фн
Рис.1. Схема глюконеогенеза: красным выделены ферменты, осуществляющие обходные пути при синтезе глюкозы.
Пируваткарбоксилаза — регуляторный фермент, который в отсутствии ацетил-КоА почти полностью лишен активности, так как данный метаболит выступает в роли положительного регулятора. Оксалоацетат, образующийся в этой реакции, восстанавливается, а затем в митохондриях трансформируется в малат. Малат, диффундируя в цитоплазму при участии специальной декарбоксилатной транспортной системы, находящейся во внутренней митохондриальной мембране, окисляется цитоплазматической НАД-зависимой МДГ с образованием внемитохондриального ОАА.
Под действием фосфоенолпируваткарбоксикиназы (Мn2+ - зависимая реакция, в которой донором фосфата служит ГТФ или АТФ) щавелевоуксусная кислота распадается на ФЕП и углекислый газ:
ОАА + ГТФ (АТФ) = ФЕП + СО2 + ГДФ (АДФ)
Фосфофруктокиназная реакция гликолиза необратима, поэтому второй обходной механизм биосинтеза глюкозы достигается при помощи фермента фруктозодифосфотазы, осуществляющим необратимый гидролиз 1-фосфатной группы:
Фр-1,6-бис-фосфат + Н2О = Фр-6-Ф + Фн.∆G0= -3,9ккал/моль.
Для проявления активности фруктозодифосфотазы необходимы ионы Мg2+ и положительный модулятор – АТФ. Данный фермент резко ингибируется отрицательным модулятором – АМФ [Филлипович Ю.Б. Основы биохимии / Ю.Б. Филлипович. – М.: Высш. шк. 1993.– 496 с.].
На третьем обходном пути вместо гексокиназы, работающей в гликолизе, в глюконеогенезе участвуют глюкозо-6-фосфотаза (Мg2+-зависимый фермент) (рис.1).
Таким образом, суммарное уравнение реакции, ведущей от ПВК к свободной глюкозе следующее:
2ПВК + 4АТФ + 2ГТФ + 2НАДН + 6Н2О = Глюкоза + 2НАД+ +4АДФ +2ГДФ + 6Фн.
Субстратами глюконеогенеза выступают также промежуточные продукты ЦТК. Главными из них являются интермедиаты, способные окисляться в малат.
Аминокислоты, служащие предшественниками ФЕП называются гликогенными. Лейцин и некоторые другие аминокислоты являются кетогенными, т.е. способны трансформироваться в ацетоацетат. Фенилаланин, тирозин относятся к смешанным аминокислотам, способным выполнять и кето- и гликогенные функции.
Глюконеогенетическим субстратом также является образующийся при гидролизе нейтральных жиров глицерин. У микроорганизмов и растений субстратами глюконеогенеза выступают жирные кислоты и ацетил-КоА, способный вовлекаться в реакции глиоксилатного цикла; у беспозвоночных [Епринцев А.Т. Очистка и физико-химические свойства изоцитратлиазы из куколок бабочки P. machaon L. / А. Т. Епринцев, М. Ю. Шевченко, В. Н. Попов.// Биохимия. – 2004. – T.69, № 4. – C. 467-472.] и позвоночных (млекопитающих) животных [Волвенкин С.В. Субклеточная локализация и свойства ферментов глиоксилатного цикла в печени крыс с аллоксановым диабетом / С. В. Волвенкин, В.Н. Попов, А.Т. Епринцев // Биохимия. – 1999. – Т.64, № 9. – С. 1185-1191.]; [Попов В. Н. Индукция ферментов глиоксилатного цикла в различных тканях голодающих крыс / В. Н. Попов, С. В. Волвенкин, А. Т. Епринцев, А. У. Игамбердиев // Известия РАН. Серия биологическая – 2000. – № 6.– С. 663-667.] – лактат, пируват, кетоновые тела, аминокислоты и другие субстраты.
1.1.2. Глюконеогенез в растениях
Растение как целостный организм представляет собой сложную саморегулирующуюся систему с взаимозависимыми путями превращения метаболитов. Функционирование и регуляция такой системы обусловлены организацией и биогенезом ферментных комплексов, катализирующих протекание реакций того или иного метаболического пути. Наряду с метаболическими путями, имеющими первостепенную важность в течение всей жизни растений, существуют процессы, протекающие только в определенные периоды онтогенеза.
Глюконеогенез – это процесс превращение запасных жиров в углеводы. Мобилизация липидов являетсяжизненно важным процессом для прорастания, голодания и старения растений. Превращение жиров в углеводы происходит при прорастании семян масличных растений, спор папоротникообразных, а также во время старения листьев Lycopersicon esculentum, при росте Brassica napus и Arabidopsis, во время развития пыльцевых трубок [Lorenz M.C., The glyoxylate cycle is required for fungal virulence/ Lorenz M.C., Fink G.R. // Nature, – 2001 – Vol. 412 – P. 83–86.]; [Schaik van E. J. Burkholderia pseudomallei Isocitrate Lyase Is a Persistence Factor in Pulmonary Melioidosis: Implications for the Development of Isocitrate Lyase Inhibitors as Novel Antimicrobials/ E. J. van Schaik, M. Tom, D. E. Woods // Infection and Immunity – 2009 – Vol. 77, №10 – P. 4275–4283.]. Два первых этапа данного процесса локализованы в глиоксисомах, цикл трикарбоновых кислот – в митохондриях, а последующие два этапа – в растворимой части цитоплазмы.
При прорастании семян запасные жиры, являющиеся водонерастворимыми, превращаются в углеводы, которые хорошо растворяются в воде, что обеспечивает возможность дальнего транспорта запасных веществ к местам утилизации, где они участвуют в процессах биосинтеза клеточных компонентов. Глиоксилатному циклу принадлежит ключевая роль при глюконеогенезе, поскольку именно наличие ферментов глиоксилатного цикла – изоцитратлиазы и малатсинтазы – обеспечивает протекание этого процесса.
Янтарная кислота, образующаяся в глиоксилатном цикле, используется в дальнейших реакциях глюконеогенеза, а также для регенерации и последующее его окисление до малата и оксалоацетата показаны, в частности, на примере эндосперма клещевины [Malhotra O. P. Isolation and characterization of isocitrate lyase of castor endosperm / O. P. Malhotra, P. K. Srivaslava // Arch. Biochem. and Biophys. – 1982. – Vol. 214, №1. – P. 164-171.]. Последующие две стадии глюконеогенеза, протекающие в цитозоле, изучены пока слабо.
Превращение фосфоенолпирувата в глюкозо-1-фосфат, являющегося ключевым промежуточным соединением в биосинтезе сахаров и полисахаридов, происходит путем обращения части гликолитической последовательности. В связи с тем, что запасные жиры семядолей и других жирозапасающих тканей находятся в особых тельцах – олеосомах, должна иметься тесная связь между олеосомами и глиоксисомами. Эти органоиды не являются производными эндоплазматической сети. Шопфер и др. показали, что имеется тесная связь между мембранами олеосомы и глиоксисомы [Siddiqui A. A. Cloning and expression of isocitrate lyase from human round Strongyloides stercoralis / A. A. Siddiqui, C. S. Stanley, S. L. Berk // Parasite. – 2000. – Vol. 7. – P. 233–236.]. В ряде случаев глиоксисома частично «покрывает» олеосому и только тонкий цитоплазматический слой остается между ними. Подобная близость олеосомы и глиоксисомы, по-видимому, обеспечивает стерически благоприятное состояние для транспорта жирных кислот. Вигил обнаружил, что в клетках эндосперма клещевины глиоксисомы могут располагаться в большом количестве на поверхности более крупных по размеру липидных тел – олеосом [Firenzuoli A.M. Enzymes of glyozylate cycle in conifers / A. M. Firenzuoli, P. Vanni, E. Mastronuzzi // Plant Physiol. – 1968. – Vol. 43, №7. – P. 1125–1128.].
Кислая липаза гидролизует три-, ди- и моноглицериды, в то время как щелочная липаза расщепляет только моноглицериды. По-видимому, работа этих двух ферментов взаимосвязана. Однако данные о локализации липаз, полученные для клещевины, не подтвердились для других растений. Так, в рапсе (Brassica napus) липаза не обнаружена в верхней фракции градиента, представляющей собой олеосомы, но она присутствовала в мембранной фракции, которая, возможно, содержала мембраны олеосом. Данные, полученные при изучении арахиса (Arachis hypogaea), указывают на то, что щелочная липаза связана с мембраной глиоксисом, а также имеется в митохондриях и пузырьках эндоплазматической сети. Липазная активность не обнаруживалась во фракции олеосом.
В клетках семядолей подсолнечника олеосомы, меньших по размеру, чем у клещевины, облегают глиоксисому. В этих клетках наблюдаются также цитоплазматические инвагинации в глиоксисому, что свидетельствует о тесной взаимосвязи физиологических процессов, происходящих в разных компартментах. Что касается липаз, расщепляющих жиры на глицерины и жирные кислоты, то у некоторых растений их активность не обнаруживается в сухих семенах и появляется при прорастании. Установлено, что они локализованы на мембране олеосом. В эндосперме клещевины кислая липаза находится на мембране олеосомы, в то время как щелочная липаза находится на глиоксисомальной мембране.
1.1.3. Глюконеогенез у животных
Глюконеогенез функционирует у человека и животных главным образом в печени и в меньшей степени в почках и слизистой оболочке кишечника. Особенно активно этот процесс идет при голодании, а также в период восстановления после интенсивной мышечной работы [Епринцев А.Т. Распространение глиоксилатного цикла у организмов различных таксономических групп / А.Т. Епринцев, М.Ю. Шевченко, В.Н. Попов // Успехи современной биологии. — М., 2008.— Т. 128, № 3. - С. 271-280.];[ Епринцев А.Т. Экспрессия и регуляция ферментов глиоксилатного цикла / А.Т. Епринцев, М. Ю. Шевченко, В. Н. Попов. – Воронеж: Центрально-Черноземное книжное издательство, 2005. – 224с.]. По данным некоторых авторов, небольшая активность фосфоенолпируваткарбоксикиназы отмечена в клетках скелетных мышц [Филлипович Ю.Б. Основы биохимии / Ю.Б. Филлипович. – М.: Высш. шк. 1993.– 496 с].
Важнейшим предшественником углеводов в организме животных является молочная кислота (лактат), образующаяся при работе мышц в процессе гликолиза и поступающая в печень с током крови. Превращение лактата в пируват осуществляется под действием гликолитического фермента лактатдегидрогеназы (так называемый Кори цикл). Субстратами глюконеогенеза выступают также промежуточные продукты ЦТК. Главными из них являются интермедиаты, способные окисляться в малат. Однако в тканях животных имеется альтернативный путь образования ФЕП из 2-оксоглутарата и предшествующих ему шестиуглеродных кислот ЦТК.
1.1.4. Глиоксилатный цикл
1.1.4.1. Роль глиоксилатного цикла в глюконеогенезе
Глиоксилатный цикл является важным этапом трансформации жирных кислот в углеводы у организмов различных таксономических групп.
Глиоксилатный цикл был впервые открыт Корнбергом и Кребсом в 1957 году в клетках бактерий рода Pseudomonas, выращиваемых на ацетате [Kornberg H. L. Synthesis of cell constituents from C2-units by a modigied tricarboxylic acid cycle / H. L. Kornberg, H. A. Krebs // Nature – 1957. – Vol. 179. – P. 988-991.]. Для этих микроорганизмов было показано, что его функцией является конденсация С2-молекул для синтеза составляющих клетку компонентов. Для растительных тканей функционирование глиоксилатного цикла было впервые показано в эндосперме клещевины [Malhotra O. P. Isolation and characterization of isocitrate lyase of castor endosperm / O. P. Malhotra, P. K. Srivaslava // Arch. Biochem. and Biophys. – 1982. – Vol. 214, №1. – P. 164-171.]. В жирозапасающих тканях растений основной функцией глиоксилатного цикла считается участие в глюконеогенезе при мобилизации запасных жиров. Глиоксилатный цикл шунтирует две декарбоксилирующие реакции цикла трикарбоновых кислот и позволяет использовать C2-соединения в качестве субстрата для глюконеогенеза[Kornberg H. L. Synthesis of cell constituents from C2-units by a modigied tricarboxylic acid cycle / H. L. Kornberg, H. A. Krebs // Nature – 1957. – Vol. 179. – P. 988-991.].
Глиоксилатный цикл состоит из пяти реакций (рис.2). На первом этапе ацетил-КоА (C2) конденсируется с глиоксилатом с образованием малата (C4) при помощи ключевого фермента глиоксилатного цикла – малатсинтазы (КФ 4.1.3.2). НАД+-зависимая малатдегидрогеназа окисляет малат до оксалоацетата, восстанавливая НАД+. Цитратсинтаза катализирует образование цитрата из оксалоацетата и ещё одной молекулы ацетил-КоА. Аконитатгидратаза превращает цитрат в изоцитрат через цис-аконитат. Другой маркерный фермент ГЦ изоцитратлиаза (КФ 4.1.3.1) катализирует расщепление изоцитрата на сукцинат и глиоксилат. Другими словами последним этапом глиоксилатного цикла является образование сукцината и регенерация глиоксилата в изоцитратлиазной реакции. Некоторые биохимические этапы ГЦ идентичны реакциям ЦТК, однако существуют их регуляторные особенности, связанные с работой изоферментов и компартментализацией (рис.2).
Суммарное уравнение глиоксилатного цикла:
2Ацетил-СоА + Н2О + НАД+ → сукцинат +2СоАSH + НАДН + Н+
Возможность конденсации С2 соединений через глиоксилатный цикл, делает его центральной стадией в пути превращения жирных кислот в углеводы.
Конверсия запасных липидов в форму углеводов делает возможным построение клеточных компонентов в периоды, когда необходимы эндогенные источники углеводов. Кроме того, совсем недавно было открыто, что работа глиоксилатного цикла является необходимым условием вирулентности возбудителей некоторых заболеваний растений, животных и человека [Епринцев А.Т. Экспрессия и регуляция ферментов глиоксилатного цикла / А.Т. Епринцев, М. Ю. Шевченко, В. Н. Попов. – Воронеж: Центрально-Черноземное книжное издательство, 2005. – 224с.].
Рис. 2. Схематичное изображение реакций цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного цикла.
Реакции глиоксилатного цикла, реакции ЦТК, общие реакции, глюконеогенез
Хотя глиоксилатный цикл впервые описан для бактерий, дальнейшие исследования показали, что данный метаболический путь имеет широкое распространение в природе, функционируя в различных физиологических периодах жизни многих организмов [Епринцев А.Т. Распространение глиоксилатного цикла у организмов различных таксономических групп / А.Т. Епринцев, М.Ю. Шевченко, В.Н. Попов // Успехи современной биологии. — М., 2008.— Т. 128, № 3. - С. 271-280.].
1.1.4.2.Субклеточная локализация изоцитратлиазы
Вопрос о локализации ферментов глиоксилатного цикла в настоящее время остается невыясненным, так как имеющиеся данные носят противоречивый характер. Для высших растений показано, что в жирозапасающих тканях все ферменты глиоксилатного цикла (возможно, за исключением аконитазы, локализованной в цитозоле) присутствуют, вероятно, только в глиоксисомах. Однако, недавние исследования указали на то, что оба маркерных фермента глиоксилатного цикла были найдены в митохондриальной фракции Euglena gracilis в ходе изоплотностного центрифугирования [Lowry O.H. Protein meacuament with the folin pihend reagent / O.H. Lowry, H.J. Rosebrough, A.H. Papp, B.J. Bandace // J. Biologi. – 1951. – Vol. 193. – P. 265–275.]. При протекании глиоксилатного цикла у водорослей и грибов в глиоксисомах выявляется только активность изоцитратлиазы и малатсинтазы, тогда как ферменты, общие с циклом Кребса – цитратсинтаза, аконитаза и малатдегидрогеназа – в глиоксисомах этих организмов отсутствуют [Siddiqui A. A. Cloning and expression of isocitrate lyase from human round Strongyloides stercoralis / A. A. Siddiqui, C. S. Stanley, S. L. Berk // Parasite. – 2000. – Vol. 7. – P. 233–236.]. У Ascaris lumbricoides ферменты глиоксилатного цикла локализованы в определенном типе митохондрий, ответственных за протекание данного цикла. В нематоде Coenorhabditis elegans активность глиоксисомальных ферментов изоцитратлиазы и малатсинтазы обнаруживается в глиоксисомоподобных микротельцах [Jameel S.H. Caenorhabditis elegans: purification of isocitrate lyase and the isolation and cell-free translation of poly (A+) RNA./ S. H. Jameel, B. McFadden // Exp. Parasitol. – 1985. – Vol. 59. – P. 337-346.].
Более поздние исследования субклеточной локализации ферментов глиоксилатного цикла в тканях высших животных указывают на пероксисомы. Работа глиоксилатного цикла в данных органоидах подтверждается обнаружением активностей ферментов во фракции пероксисом при изоплотностном центрифугировании [Игамбердиев А.У. Микротельца в метаболизме растений / А.У. Игамбердиев. – Воронеж: Изд-во Воронеж. гос. ун-та, 1990. – 148 с.], а также данными световой микроскопии и гистохимии о заметном увеличении количества пероксисом и их тесной связи с липидными и новообразованными гликогеновыми включениями в состояниях, способствующих индукции глиоксилатного цикла [Епринцев А.Т. Глиоксилатный цикл: универсальный механизм адаптации? / А.Т. Епринцев, В.Н. Попов, М.Ю. Шевченко. – М.: ИКЦ «Академкнига», 2007. – 228 с.].
1.1.4.3. Распространение глиоксилатного цикла
1.1.4.3.1. Рапространение глиоксилатного цикла у микроорганизмов, низших растений и грибов
Глиоксилатный цикл открыт Корнбергом и Кребсом в 1957 году в клетках бактерий рода Pseudomonas [Kornberg H. L. Synthesis of cell constituents from C2-units by a modigied tricarboxylic acid cycle / H. L. Kornberg, H. A. Krebs // Nature – 1957. – Vol. 179. – P. 988-991.]. Главной функцией данного метаболического пути в прокариотах является обеспечение роста, когда единственным источником углерода являются C2-соединения, такие как этанол и ацетат.
Глюкоза не всегда доступна для микроорганизмов, которые, как правило, утилизируют простые углеродные соединения. Глиоксилатный цикл шунтирует две декарбоксилирующие реакции цикла трикарбоновых кислот и позволяет использовать C2-соединения в качестве субстрата для глюконеогенеза[Kornberg H. L. Synthesis of cell constituents from C2-units by a modigied tricarboxylic acid cycle / H. L. Kornberg, H. A. Krebs // Nature – 1957. – Vol. 179. – P. 988-991.].
Дата добавления: 2015-11-04; просмотров: 28 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |