Диски. 1-3 мг вещества, предназначенного для испытания, растирают с 150-200 мг, если не указано иначе в частной фармакопейной статье, тщательно измельченного и высушенного калия бромида или калия хлорида (обычно используют калия бромид). Типичные условия высушивания калия бромида: при 105 град. C в вакууме, в течение 12 ч. Обычно такого количества достаточно для приготовления диска диаметром 13 мм и получения спектра подходящей интенсивности. Смесь тщательно перетирают, добиваясь необходимой однородности, и прессуют диск при давлении около 800 МПа (8 т/кв. см) в вакууме (2-3 мм рт. ст.) в течение 2-5 мин. Причиной образования некачественных дисков могут быть такие факторы, как недостаточное или чрезмерное растирание, влага или иные примеси в дисперсионной среде и недостаточное измельчение частиц.
Диск непригоден для испытания, если при визуальном осмотре он
-1
неоднороден по прозрачности или если его пропускание при 2000 см (5 мкм)
составляет менее 75% без компенсации при отсутствии специфической полосы
поглощения.
Суспензии. Небольшое количество вещества, предназначенного для испытания, растирают с минимальным количеством вазелинового масла или другой подходящей жидкости (смешивают 5-20 мг твердого вещества с 1-2 каплями иммерсионной жидкости). Полученную суспензию сжимают между двумя пластинками (NaCl или KBr), прозрачными для инфракрасного излучения.
Газы. Газы исследуют в кювете, прозрачной для инфракрасного излучения, с длиной оптического пути около 100 мм. Откачивают воздух из кюветы и заполняют анализируемым газом через кран или при помощи игольчатого клапана.
Если необходимо, доводят давление в кювете до атмосферного, используя газ, прозрачный для инфракрасного излучения (например, азот или аргон). Для исключения помех, связанных с поглощением воды, углерода диоксида или других атмосферных газов, в канал сравнения помещают идентичную кювету, которая либо вакуумирована, либо заполнена газом, прозрачным для инфракрасного излучения.
Для записи спектра по методу нарушенного полного внутреннего отражения (МНПВО) подготовку образца проводят одним из способов.
Растворы. Вещество растворяют в соответствующем растворителе, соблюдая условия, приведенные в частной фармакопейной статье. Раствор испаряют на поверхности элемента МНПВО, который обычно изготавливают из кристалла бромида йодида таллия (KRS-5), германия или другого минерала с большим показателем преломления.
Твердые вещества. Вещество помещают на поверхность элемента МНПВО таким образом, чтобы получить гомогенный контакт.
Идентификация с использованием стандартных образцов
Образец испытуемого вещества и стандартный образец готовят по одной и
-1
той же методике и записывают спектры в области от 4000 до 400 см (от 2,5
до 25 мкм), в одних и тех же условиях. Полосы поглощения в спектре
испытуемого образца должны соответствовать по положению полосам поглощения
в спектре стандартного образца. Под полосами поглощения подразумевают
минимумы пропускания и максимумы поглощения.
Если спектры, полученные в твердом состоянии, показывают различия в положении полос поглощения, то испытуемую субстанцию и стандартный образец обрабатывают одним и тем же способом так, чтобы они кристаллизовались или получались в одной и той же форме, или обрабатывают способом, указанным в частной фармакопейной статье, а затем снимают спектры.
Идентификация с использованием эталонных спектров
Контроль разрешающей способности. Записывают спектр пленки полистирола
толщиной 0,04 мм. Разность x (рис. 12.2.1 - не приводится) между процентом
-1
пропускания при максимуме пропускания А при 2870 см (3,48 мкм) и минимуме
-1
пропускания B при 2849,5 см (3,51 мкм) должна быть больше 18. Разность у
-1
между процентом пропускания при максимуме пропускания C при 1589 см (6,29
-1
мкм) и минимуме пропускания D при 1583 см (6,32 мкм) должна быть больше
12.
Проверка шкалы волновых чисел. Шкала волновых чисел может быть
проверена с помощью пленки полистирола, которая имеет минимум пропускания
-1
(максимум поглощения) при волновых числах (в см), приведенных в табл.
12.2.1.
Методика. Субстанцию готовят к испытанию в соответствии с инструкцией,
прилагаемой к эталонному спектру. Используя условия, при которых
проводилась проверка разрешающей способности, записывают спектр испытуемого
-1
образца и на него накладывают полосы полистирола при 2849,5 см (3,51
-1 -1
мкм), 1601,2 см (6,25 мкм) и 1028,3 см (9,72 мкм). Сравнивают два
спектра (эталонный и спектр испытуемой субстанции) и полосы полистирола,
указанные выше. При использовании положения полос полистирола в качестве
стандартных величин, положения значимых полос в спектре испытуемой
субстанции и в эталонном спектре должны соответствовать друг другу в
пределах 0,5% от шкалы волновых чисел. Относительная величина полос обоих
спектров должна согласовываться между собой.
Рис. 12.2.1. Типичный спектр полистирола,
используемый для проверки разрешающей способности
Рисунок не приводится.
Таблица 12.2.1
Минимумы пропускания и допустимые пределы для
пленки полистирола
┌───────────────────────────────────┬─────────────────────────────────────┐
│ -1 │ -1 │
│ Минимумы пропускания, см │ Допустимые пределы, см │
├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤
│ 3060,0 │ +/- 1,5 │
├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤
│ 2849,5 │ +/- 1,5 │
├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤
│ 1942,9 │ +/- 1,5 │
├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤
│ 1601,2 │ +/- 1,0 │
├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤
│ 1583,0 │ +/- 1,0 │
├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤
│ 1154,5 │ +/- 1,0 │
└───────────────────────────────────┴─────────────────────────────────────┘
Примеси в газах
Для анализа примесей в газах используют кювету, прозрачную для инфракрасного излучения и имеющую соответствующую длину оптического пути (например, от 1 до 20 м). Кювету заполняют так, как указано в разделе "Газы". Для обнаружения и количественной оценки примесей используют методики, указанные в частных фармакопейных статьях.
12.3. АТОМНО-ЭМИССИОННАЯ И АТОМНО-АБСОРБЦИОННАЯ
СПЕКТРОМЕТРИЯ (ОФС 42-0044-07)
Атомная спектрометрия - эмиссионная и абсорбционная - применяется для определения содержания элемента в испытуемом образце посредством измерения интенсивности одной из эмиссионных линий атомного пара (атомно-эмиссионная спектрометрия) или поглощения излучения атомным паром (атомно-абсорбционная спектрометрия) определяемого элемента путем измерения интенсивности эмиссии (испускания) или абсорбции (поглощения) света при определенной длине волны атомного пара элемента, генерированного из вещества, например, при введении раствора вещества в пламя. Определение проводят при длине волны, соответствующей выбранной эмиссионной или абсорбционной линии.
Точность обоих методов атомной спектрометрии, в зависимости от концентрации вещества, составляет 1-4%, чувствительность определяется свойствами аналитической линии, составом пробы, классом аппаратуры и может достигать 0,001 мкг/мл.
АТОМНО-ЭМИССИОННАЯ ПЛАМЕННАЯ СПЕКТРОМЕТРИЯ (АЭС)
Принцип метода. Анализируемый раствор распыляется в виде аэрозоля в пламя горелки, работающей на горючем газе. Под действием температуры пламени происходит ряд сложных физико-химических процессов: испарение растворителя из капель аэрозоля, испарение твердых частиц, диссоциация молекул, возбуждение атомов и возникновение характеристического излучения атомов. Излучение определяемого элемента отделяется от постороннего с помощью светофильтра или монохроматора, попадает на фотоэлемент и вызывает фототок, который измеряется. Количественное определение элемента методом эмиссионной спектрометрии основано на функциональной зависимости интенсивности спектральной линии (I) от концентрации элемента в растворе (c). Прямопропорциональная зависимость между I и c имеет место лишь в определенной для данного элемента области концентраций. Линейную зависимость I от c может нарушать самопоглощение, ионизация, образование газообразных или трудно диссоциирующих в пламени соединений.
Прибор. Главными составными частями атомно-эмиссионного спектрометра являются: генератор атомного пара определяемого элемента (пламя, плазма, дуга и др.), монохроматор и детектор.
Если генератором является пламя, в качестве растворителя для приготовления испытуемого и стандартного растворов рекомендуется использовать воду. Могут использоваться и органические растворители, если они не влияют на стабильность пламени.
АТОМНО-АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОМЕТРИЯ (ААС)
Принцип метода. Резонансное излучение от лампы с полым катодом проходит через пламя, в которое распыляется анализируемый раствор пробы. Излучение попадает на входную щель монохроматора, установленного таким образом, что из спектра выделяется только резонансная линия определяемого элемента, интенсивность которой измеряется фотоэлектрическим способом. Измеряют уменьшение интенсивности резонансной линии вследствие поглощения ее атомами определяемого элемента, принимая интенсивность неослабленной линии за 100%. Величина поглощения резонансного излучения пропорциональна числу атомов, находящихся в поглощающем слое.
Прибор. Главными составными частями прибора являются: источник излучения, атомный генератор определяемого элемента (пламя, печь и др.), монохроматор и детектор - для считывания сигнала из нагревательной камеры.
Для каждого определяемого элемента должен быть выбран специфический источник, излучающий спектральную линию, которая должна быть абсорбирована. Таким источником излучения обычно является полая катодная лампа, катод которой испускает излучение при возбуждении. Поскольку излучение, абсорбируемое испытуемым элементом, обычно той же длины волны, что и его линия эмиссии, в полой катодной лампе используется тот элемент, который определяется.
Прибор снабжен аспиратором для введения испытуемого образца в пламя, создаваемое газовыми смесями.
Число возбужденных атомов увеличивается с ростом температуры, которая зависит в основном от теплотворной способности создающего пламя газа (табл. 12.3.1).
Таблица 12.3.1
Температура наиболее часто используемых
газовых смесей
Состав газовой смеси | Температура, град. C |
Светильный газ + воздух | |
Ацетилен + воздух | |
Ацетилен + кислород | |
Водород + кислород | |
Ацетилен + закись азота |
Способ введения образца зависит от типа используемого генератора. Если генератором атомного пара является пламя, в качестве растворителя для приготовления испытуемого и стандартного растворов рекомендуется использовать воду. Могут использоваться и органические растворители, если они не влияют на стабильность пламени. При использовании печи может быть также использована техника ввода твердых проб.
В атомно-абсорбционной спектрометрии должна учитываться природа растворителя и концентрация твердых частиц. Идеальным считается растворитель с минимальными помехами в процессах поглощения или эмиссии, при использовании которого в пламени образуются нейтральные атомы. Если имеются значительные различия между поверхностным натяжением или вязкостью испытуемого раствора и стандартного раствора, то эти растворы всасываются и атомизируются с различной скоростью, что обуславливает существенное различие в генерированных сигналах. Концентрация кислоты в растворах также влияет на процессы абсорбции. Таким образом, растворители, используемые для приготовления испытуемого и стандартного растворов в методе ААС, должны быть одними и теми же или максимально похожими и должны образовывать растворы, которые легко всасываются через трубку форсунки аспиратора.
Присутствие в растворе частиц нерастворенного твердого вещества может вызвать помехи при проведении анализа, поэтому общее содержание нерастворимых твердых частиц в растворах должно быть менее 2%.
Атомный пар может быть получен также вне спектрометра, например, методом "холодного пара" для определения ртути или гидридным методом. При определении ртути атомы генерируются при химическом восстановлении, и атомный пар вносится потоком инертного газа в абсорбционную ячейку, расположенную на оптическом пути прибора. В гидридном методе получают гидрид определяемого элемента, который либо смешивается с газом, питающим горелку, либо вносится инертным газом в нагретую абсорбционную ячейку, где он диссоциирует на атомы.
Методика. Прибор выводят на режим в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора и устанавливают требуемую длину волны. В генератор атомного пара вводят холостой раствор и настраивают регистрирующее устройство на нулевое значение в случае атомно-эмиссионного спектрометра и на максимальное светопропускание в случае атомно-абсорбционной спектрометрии. Вводят стандартный раствор определяемого элемента с наибольшей концентрацией и подбирают чувствительность для получения подходящего значения регистрируемого сигнала.
Испытуемый раствор готовят, как указано в частной фармакопейной статье.
Определения проводят путем сравнения со стандартными растворами известной концентрации определяемого элемента одним из двух методов: методом калибровочной кривой или методом стандартных добавок.
Каждый раствор вводят в генератор прибора не менее трех раз и записывают установившееся показание. Каждый раз промывают прибор холостым раствором и проверяют, чтобы показание прибора возвращалось к первоначальному значению для холостого раствора.
В случае использования печи в качестве генератора атомного пара между измерениями ее отжигают.
Метод калибровочной кривой. Готовят не менее трех стандартных растворов определяемого элемента таким образом, чтобы ожидаемое значение концентрации испытуемого раствора находилось внутри диапазона концентраций стандартных растворов. Все реагенты, используемые при приготовлении испытуемого раствора, прибавляют к стандартным растворам и холостому раствору в таких же концентрациях.
Строят калибровочную кривую зависимости среднего значения результата измерения (I), полученного для стандартных растворов, от концентрации (c) и определяют концентрацию элемента в испытуемом растворе по калибровочной кривой.
Метод стандартных добавок. Равные объемы испытуемого раствора помещают не менее, чем в три мерные колбы одинаковой вместимости. Во все колбы, кроме одной, прибавляют пропорционально увеличивающиеся объемы стандартного раствора, содержащего известную концентрацию определяемого элемента (стандартные добавки), и доводят объемы растворов используемым растворителем до метки. При этом значение регистрируемого сигнала растворов со стандартными добавками должно находиться в линейной области калибровочной кривой.
Рассчитывают параметры линейного уравнения прямолинейной зависимости среднего значения результата измерения от концентрации раствора методом наименьших квадратов и вычисляют концентрацию определяемого элемента в испытуемом растворе.
Расчет концентрации может быть произведен графическим методом. Для этого строят график зависимости среднего значения результата измерения от добавленного количества определяемого элемента. Экстраполируют линию, соединяющую эти точки на графике, до пересечения с осью абсцисс. Расстояние от начала координат до полученной точки пересечения дает концентрацию определяемого элемента в испытуемом растворе.
При использовании техники ввода твердых проб условия проведения анализа должны быть указаны в частной фармакопейной статье.
При использовании АЭС и ААС для определения концентрации элемента в анализируемых образцах наряду с приведенными выше методами (калибровочной кривой и стандартных добавок) могут быть использованы метод сравнения и метод ограничивающих растворов или другие валидированные методы.
Реактивы и эталонные растворы. Вода должна быть деионизированной на ионообменных смолах, продистиллированной непосредственно перед употреблением и должна соответствовать требованиям, предъявляемым к воде очищенной.
Ниже приведены растворы солей, катионы которых обозначены названиями элементов, наиболее часто нормируемых в фармацевтическом анализе.
Кальций. 1,001 г кальция карбоната, высушенного до постоянной массы при температуре 105 град. C, растворяют в 25 мл 1 М раствора хлористоводородной кислоты и доводят объем раствора водой до 1000,0 мл. Раствор содержит 400 мкг ионов Ca в 1 мл.
Срок годности раствора - 1 мес., хранение при комнатной температуре.
Калий. 1,1440 г калия хлорида, высушенного до постоянной массы при температуре 130 град. C, растворяют в небольшом количестве воды и доводят объем раствора водой до 1000,0 мл. Раствор содержит 600 мкг ионов К в 1 мл.
Срок годности раствора - 2 мес., хранение при комнатной температуре.
Натрий. 0,5084 г натрия хлорида, высушенного до постоянной массы при температуре 130 град. C, растворяют в небольшом количестве воды и доводят объем раствора водой до 1000,0 мл. Раствор содержит 200 мкг ионов Na в 1 мл.
Срок годности раствора 2 мес., хранение при комнатной температуре.
Цинк. 2,5 г гранулированного цинка растворяют в 20 мл 5 М раствора хлористоводородной кислоты и доводят объем раствора водой до 500,0 мл. Раствор содержит 5 мг ионов Zn в 1 мл.
Срок годности раствора - 2 мес., хранение при комнатной температуре.
Свинец. 0,1600 г свинца нитрата растворяют в 5 мл 32% раствора азотной кислоты и доводят объем раствора водой до 1000,0 мл. Раствор содержит 100 мкг ионов Pb в 1 мл.
Срок годности раствора 1 мес., хранение при комнатной температуре.
Медь. 1,000 г меди электролитической растворяют в небольшом объеме 50% раствора азотной кислоты и доводят объем раствора 1% азотной кислотой до 1000,0 мл. Раствор содержит 1 мг ионов Cu в 1 мл.
Срок годности раствора - 1 мес., хранение при комнатной температуре.
Допускается использование других реактивов и эталонных растворов для спектрального анализа, аттестованных компетентным уполномоченным органом.
Эталонные, а также приготовленные на их основе растворы сравнения хранят в посуде, позволяющей сохранять концентрацию этих растворов неизменной (например, в посуде из кварца, тефлона, чистого полиэтилена и т.п.). Чашки и тигли для озоления проб должны быть изготовлены из кварца.
12.4. ФЛУОРИМЕТРИЯ (ОФС 42-0045-07)
Флуориметрия (или флуоресцентная спектрофотометрия) основана на измерении флуоресценции - интенсивности флуоресцентного света, излучаемого испытуемым образцом в возбужденном состоянии, которое было достигнуто поглощением лучевой энергии в результате воздействия ультрафиолетового, видимого или других видов электромагнитного излучения. Флуоресценция органических соединений охватывает спектральную область от 250 до 800 нм, т.е. области: УФ (частично), видимую и начало ближнего ИК.
Энергия молекул, поглотивших лучевую энергию и находящихся в возбужденном состоянии, может высвобождаться в виде тепла или излучения при той же или большей длине волны по сравнению с поглощаемым излучением. Поэтому свет, излучаемый флуоресцентным раствором, имеет максимум интенсивности, смещенный в более длинноволновую область по сравнению с возбуждающим излучением, обычно на 20-30 нм.
Поскольку поглощение и испускание излучения осуществляется благодаря
переходу электронов между различными уровнями энергии или молекулярными
орбитами, между поглощением и испусканием света имеется задержка во
времени. Этот интервал (продолжительность возбужденного состояния)
-9 -8
составляет от 10 до 10 с для большей части флуоресцирующих растворов.
Короткое время жизни флуоресценции отличает этот тип люминесценции от
фосфоресценции, которая представляет собой долгоживущее свечение, имеющее
-3
время жизни от 10 с до нескольких мин.
Флуориметрия является более чувствительным методом анализа, чем абсорбционная спектрофотометрия, и позволяет определять флуоресцирующие вещества в растворах с концентрацией, которая составляет примерно от 1/10 до 1/100 от концентрации, используемой в абсорбционной спектрофотометрии.
Интенсивность флуоресценции обозначается символом I и представляет собой эмпирическое выражение флуоресцентной активности в условных единицах, пропорциональных отклику детектора.
Флуоресцентный спектр испускания представляет собой графическое изображение спектрального распределения излучения, испускаемого активированным веществом, в координатах: интенсивность испускаемого излучения - ордината, длина волны - абсцисса.
Флуоресцентный спектр возбуждения представляет собой графическое изображение спектра активации в координатах: интенсивность испускаемого излучения - ордината, длина волны активирующего излучения - абсцисса.
Приборы. Для проведения флуориметрического анализа используют приборы двух типов: фильтрационный флуориметр и спектрофлуориметр.
Фильтрационный флуориметр состоит из источника излучения, первичного фильтра, камеры для образца, вторичного фильтра и системы детектирования флуоресценции. У большей части таких приборов детектор помещен под углом 90 град. к возбуждающему лучу. Геометрия прямого угла позволяет возбуждающему излучению пройти через испытуемый образец, не "загрязняя" произведенный сигнал, передаваемый на детектор флуоресценции. Однако детектор все-таки получает возбуждающее излучение, искаженное в результате рассеивающих свойств самих растворов, а также из-за присутствия в растворе пыли или других твердых частиц. Для устранения этого остаточного рассеяния используются фильтры. Первичный фильтр отбирает коротковолновое излучение, способное к возбуждению испытуемых образцов, вторичный фильтр пропускает флуоресценцию в длинноволновой области, но блокирует рассеянное возбуждение.
Большинство флуориметров в качестве детекторов используют фотоумножители разных типов. Каждый тип детектора имеет специальные характеристики (спектральная область максимальной чувствительности, усиление, электрические шумы). Фототок усиливается и регистрируется измерительным прибором или самописцем.
Спектрофлуориметры отличаются от фильтрационных флуориметров тем, что вместо фильтров используются монохроматоры типа призмы или решетки. Для аналитических целей эти приборы более предпочтительны. В спектрофлуориметрах монохроматоры снабжены щелями. Узкая щель дает высокое разрешение и спектральную чистоту, широкая щель обеспечивает высокую чувствительность. Выбор размера щели определяется разделением между длинами волн возбуждения и испускания и необходимой чувствительностью.
Кюветы, используемые для измерения флуоресценции, представляют собой кюветы цилиндрической формы или прямоугольные кюветы, отполированные со всех четырех вертикальных сторон. Обычно объем испытуемых образцов составляет 2-3 мл, но к некоторым приборам прилагаются кюветы вместимостью от 100 до 300 мкл или капиллярные держатели для еще меньшего объема.
Измерение флуоресценции. Практически флуоресценцию определяют в
-5
растворах с концентрацией от 10 М и менее, когда между интенсивностью
флуоресценции и концентрацией вещества наблюдается прямолинейная
зависимость. При более высоких концентрациях значительная часть
поступающего света абсорбируется образцом вблизи поверхности кюветы, и
интенсивность света, достигающего центра, уменьшается. При этом образец
действует как "внутренний фильтр", в результате чего линейность нарушается.
Все замеры интенсивности флуоресценции должны быть скорректированы с растворителем.
Интенсивность флуоресценции в значительной степени зависит от длины волны возбуждающего света, величины pH испытуемого раствора, температуры, характера растворителей и присутствия в растворе посторонних частиц.
Твердые частицы, влияющие на флуоресценцию (могут поглощать некоторую долю возбуждающей энергии, дезактивировать возбужденные молекулы или завышать измеряемую величину из-за многократных отражений в кювете с образцом), удаляют центрифугированием или фильтрованием. В последнем случае следует учесть, что некоторые сорта фильтровальной бумаги содержат флуоресцирующие примеси.
Для некоторых веществ эффективность флуоресценции может снизиться на 1-2% при повышении температуры на градус. В таких случаях следует использовать термостатированные кюветы с контролируемой температурой. В рутинном анализе может оказаться достаточным сделать измерение быстро, чтобы не произошло нагревания образца от источника облучения.
Флуоресцентные вещества чувствительны к свету. При выдержке во флуориметре они могут подвергаться фотораспаду с образованием других флуоресцирующих продуктов. Такие эффекты обнаруживаются по отклику детектора в зависимости от времени и могут быть снижены применением фильтров или экрана после источника света.
Изменение растворителя может заметно повлиять на интенсивность и спектральное распределение флуоресценции. Многие соединения, флуоресцирующие в органических растворителях, фактически не флуоресцируют в воде, поэтому для того, чтобы решить, является вещество флуоресцентным или нет, надо исследовать его в различных растворителях.
Дата добавления: 2015-09-29; просмотров: 22 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |