Кафедра медицини, оздоровчого харчування і безпеки туризму
ОСНОВИ ГЕНЕТИКИ МІКРООРГАНІЗМІВ
Конспект лекції
з дисципліни ”Мікробіологія харчових продуктів”
підготовки фахівців спеціальності 7.091711
“Технологія харчування”
Львів -2006
Основи генетики мікроорганізмів. Конспект лекції з з дисципліни ”Мікробіологія харчових продуктів” підготовки фахівців спеціальності 7.091711 “Технологія харчування”
Рецензент: професор кафедри мікробіології та вірусології Львівської національної академії ветеринарної медицини О.Я. Захарів
Харченко С.М. Мікробіологія: – Київ: Сільгоспосвіта, 1994. – 348 с.
1. Генетика, як наука про спадковість та мінливість мікроорганізмів
Генетика – наука про два різних і незалежних один від одного біологічних процеси – спадковість і мінливість живих організмів. Процеси спадковості й мінливості широко вивчаються у світі мікробів, оскільки мікроорганізми є найзручнішим об'єктом для генетичних досліджень, бо за короткий час утворюють велику кількість генерацій.
Місцем локалізації генетичного матеріалу є ядра в еукаріотних клітинах, а нуклеоїди в прокаріотних. Генетичний апарат у бактерій складається з молекули ДНК, замкненої в кільце, яке міститься в нуклеарній ділянці клітини. Гігантська кільцева молекула ДНК, яка складається із функціонально неоднорідних генетичних детермінант генів, дістала назву бактеріальної хромосоми (рис. 1).
Рис. 1. Бактеріальна клітина, в якій містяться: 1 -нуклеоїд (хромосомна ДНК) і 2 - плазміда (плазмідна ДНК)
Гени прокаріотної клітини складаються із безперервно кодуючої послідовності нуклеотидів, тобто прокаріотам властиве тісне зчеплення генів. Хромосоми бактерій володіють однією групою зчеплення генів. Інформація в генах записана однаковим генетичним кодом для всіх прокаріотів, і принципи її реалізації також однакові у всіх організмів. У структурі гена запрограмовані два основні його вираження (експресії) – транскрипція і трансляція. Гени бактерій складаються із промотора, білок-кодуючої ділянки і термінатора транскрипції.
У багатьох видів бактерій є ще один тип генетичних елементів, що існують у клітині автономно, тобто поза хромосомами. Це плазміди, які є типовими репліконами. Вони мають здатність до саморегуляції незалежно від механізмів, які регулюють розмноження бактеріальної хромосоми. Вважається, що генетична інформація, яка міститься у плазмідах та інших позахромосомних елементах (помірних фагах), не є обов'язковою для життєдіяльності бактерій. Проте ці елементи розширяють можливості існування бактеріального виду.
Плазміди можуть існувати в клітині не тільки в автономному, а й в інтегрованому (об'єднаному) стані з бактеріальною хромосомою (подібно до хромосомних генів). У цьому разі їх називають епісомами. До останніх належать F-фактор, помірні фаги та ін. Кількість плазмідної ДНК у клітині не перевищує відсотків від вмісту ДНК у бактеріальній хромосомі. Головними властивостями плазмід є їхня здатність до автономної реплікації і трансмісивність (здатність до самопередавання). Переважна більшість плазмід складається із трьох груп генів: ділянки ДНК, яка відповідає за автономну реплікацію плазміди в клітині; генів, що забезпечують можливість перенесення плазмід із однієї клітини в іншу, і генів, котрі визначають корисні властивості для клітини-хазяїна. Вивчення молекулярної природи плазмід та їхніх функцій в бактеріальній клітині дозволило успішно використовувати їх у генній інженерії.
Первинним генетичним матеріалом, з якого безпосередньо побудовані хромосоми і гени, а також бактеріальні плазміди є ДНК. Вторинним генетичним матеріалом є РНК. Перед поділом клітини ДНК її геном реплікується і до кожного ланцюга добудовується коплементарний ланцюг. Обидві нові подвійні спіралі ДНК складаються з однієї початкової і однієї заново синтезованої нитки. Таке подвоєння ДНК дозволяє зберігати генетичну інформацію клітини. Для реалізації цієї генетичної інформації ДНК спочатку транскрибується в молекули мРНК, які взаємодіють із рибосомами. В останніх інформація з послідовності нуклеотидів переводиться в послідовність амінокислот.
Виявлення у прокаріотів спільних із вищими організмами закономірностей спадковості і мінливості, тобто принципова схожість у будові та функціях їхніх геномів, дає змогу розглядати результати, які одержують на бактеріях, як загальнобіологічні.
2. Мінливість генетичного матеріалу прокаріотів
Вивчення мінливості бактерій тісно зв’язано з термінами «генотип» і «фенотип». Генотипом, або геномом, називають сукупність усіх генів, які властиві даному організму. Фенотип – це весь комплекс зовнішніх і внутрішніх ознак організму, таких як форма, розміри, забарвлення, хімічний склад, поведінка, макро- і мікроскопічні особливості тощо.
Подібні за генотипом мікроорганізми можуть істотно відрізнятися за фенотипом. Фенотипові відмінності між прокаріотами, що є однаковими за генотипом, називаються модифікаціями.
Здатність організмів змінювати властивості відповідно до зміни умов навколишнього середовища називають мінливістю. Набуті при цьому ознаки носять тимчасовий характер, вони спадково не закріплюються нащадками і зберігаються, поки діє фактор, що їх спричинив. Така мінливість називається неспадковою, або адаптивною, а явище – адаптацією. Доведено, що модифікація (адаптація) є мінливістю, яка відбувається на рівні фенотипу і не зачіплює генотипу клітини.
Поява під впливом різних екологічних факторів у мікробних клітин нових ознак, які спадково закріплюються в новому поколінні називається спадковою мінливістю.
Адаптивні модифікації розширюють можливість організму до виживання і розмноження в ширшому діапазоні довкілля.
Мутації (від лат. mutatio – зміна). Раптові зміни в генетичному апараті клітини, що приводять до появи нових ознак і властивостей, які передаються наступним поколінням, дістали назву мутацій.
Мутації, які виникають у нормальних умовах самовільно і мають випадковий характер як у часі, так і просторі, називаються спонтанними.
Мутації, які виникають після дії на прокаріотні клітини фізичних і хімічних чинників називаються індукованими. Їх можна штучно викликати і вони піддаються контролю. Чинники, які спричиняють мутації (ультрафіолет, радіація, хімічні речовини тощо), називають мутагенами.
Серед мутацій розрізняють генні, які відбуваються лише в одному гені, тобто при генних мутаціях зміни стосуються тільки одного нуклеотиду, і хромосомні, які поширюються на кілька генів. Останні пов'язані зі значними перебудовами в окремих фрагментах ДНК і виявляються в результаті випадання тієї чи іншої кількості нуклеотидів, їх називають дилеції. Мутації, що супроводжуються повертанням ділянки ДНК на 180°, дістали назву інверсій, а якщо під час мутації повторюється який-небудь фрагмент ДНК, то це називають дуплікацією.
За зміною ознак розрізняють морфологічні, фізіологічні і біохімічні мутації.
За напрямом зміни ознаки мутації бувають прямі і зворотні. Перші є змінами в генах бактерій дикого типу. Зворотними називають мутації від мутантного типу до дикого. Зворотні мутації, які приводять до відновлення фенотипу і генотипу, називають прямими. Зворотні мутації, які відновлюють лише фенотип, а генотип лишається мутованим, дістали назву супресорних. При цьому відбувається вторинна пряма мутація в іншому гені, яка пригнічує виявлення першої.
Для захисту генетичного матеріалу, від пошкодження різними мутагенами, у прокаріотів виявлено ефективні системи репарації (відновлення) мутаційних уражень.
Дисоціація. Розщеплення однорідної популяції бактерій за культуральними властивостями на типи, які відрізняються від вихідного зовнішнім виглядом і структурою колоній, а також стійкими змінами окремих фізіолого-біохімічних властивостей називається дисоціацією. Прикладом дисоціації є виникнення різних типів колоній в чистій культурі бактерій: тип S (англ.- smooth – гладенький) – гладенькі, прозорі, з рівними краями, чітко кулясті, і тип R (англ. rough – шорсткий) – сухі, непрозорі, з шорсткою і борознистою поверхнею, контурами неправильної форми і нерівномірними зазубреними краями. Між ними існують перехідні форми, нестійкі типи, які позначають літерами О і М (відповідно проміжні і слизові). Такі культури відрізняються за морфологічними, фізіологічними, антигенними та вірулентними властивостями. У більшості патогенних мікробів тип S вірулентніший, ніж тип R. Винятком є збудник сибірки: у нього R-форми патогенніші і вірулентніші, ніж S-форми. Можливий перехід типу S в тип R. Зворотній перехід спостерігається дуже рідко.
3. Генетичні рекомбінації у бактерій
До спадкової мінливості також належать зміни, які виникають у прокаріотів внаслідок рекомбінації генетичного матеріалу. Це процес генетичної рекомбінації, сутність якого полягає в тому, що із клітини-донора у клітину-реципієнта переноситься частина генетичного матеріалу; при цьому відбувається рекомбінація генів і утворюється рекомбінантна хромосома. Як правило, реципієнтна клітина одержує тільки фрагмент хромосоми донора, а тому вона стає лише частково диплоїдною (або меризиготою). Така часткова передача генетичного матеріалу дістала назву мероміксису.
Генетичні рекомбінації у прокаріотів істотно відрізняються від подібних процесів у еукаріотів. У останніх під час запліднення об'єднуються два повні гаплоїдні набори і утворюється диплоїдна зигота, в якій після низки мітотичних поділів відбувається рекомбінація генетичного матеріалу і редукційний поділ (мейоз), внаслідок якого знову утворюються гаплоїдні клітини (гамети).
Генетичні рекомбінації є невичерпним джерелом мінливості, оскільки в природних умовах прокаріоти перебувають у складі різних асоціацій — біоценозів і паразитоценозів, що створює сприятливі умови для обміну генами. Процес генетичної рекомбінації у бактерій належить до так званих парасексуальних процесів. Відомо три типи таких процесів: трансформація, кон'югація і трансдукція.
Трансформацією (від лат. transformatio – перетворення) називають передачу генетичного матеріалу від донора до реципієнта за допомогою вільної ДНК, виділеної з клітини донора.
Трансформація відбувається у три стадії: 1) контакт ДНК з поверхнею клітини; 2) проникнення ДНК у клітину; 3) з'єднання ДНК донора з відповідною ділянкою хромосоми реципієнта. Трансформація можлива тільки тоді, коли реципієнтна клітина перебуває у стані «компетентності», під час якої вона здатна сприймати ДНК клітини донора. Найчастіше цей період припадає на середину логарифмічної фази росту.
Після проникнення в реціпієнтну клітину фрагмента ДНК клітини донора одна нитка розпадається, а друга вступає в генетичний обмін з реципієнтною ДНК. Інтеграція закінчується утворенням рекомбінантної хромосоми, в якій донорні і реципієнтні ознаки подекуди виявляються тісно зчепленими. Рекомбінантна ДНК далі реплікується як єдина структура.
Розрізняють гомотрансформацію, при якій відбувається перенесення генетичної інформації від донора до реципієнта в межах одного виду, і гетеротрансформацію — перенесення ДНК від одного виду до іншого.
За передачею ознак розрізняють три типи трансдукції: загальну (неспецифічну), специфічну і абортивну. При загальній трансдукції відбувається передача однієї або декількох ознак одночасно. Специфічна трансдукція характеризується перенесенням тільки певної ознаки. При абортивній трансдукції перенесена фагом ділянка ДНК клітини-донора не включається до геному клітини-реципієнта і відповідно прояву нової ознаки не спостерігається.
Явище трансформації у прокаріотів дало змогу встановити роль нуклеїнових кислот як носіїв спадкової інформації. Тепер ДНК відповідних штамів бактерій використовують для трансформації їх властивостей: вірулентності, стійкості проти антибіотиків, зміни антигенного апарату тощо, а також для встановлення філогенетичної спорідненості донора і реципієнта. Трансформацію використовують і в селекції мікроорганізмів.
Трансдукція, або конверсія є процесом перенесення ДНК (хромосоми) від клітини-донора до клітини-реципієнта за допомогою помірного бактеріофага. Цей процес супроводжується зміною генотипу реципієнтної клітини після одержання нею фрагмента геному бактерії-донора. Трансдукцію виявлено у бактерій дизентерії, сальмонел, холерного вібріона, стафілококів, сінної палички та в інших бактерій.
Розрізняють три типи трансдукції: загальну, специфічну і абортивну.
Загальна (генералізована, неспецифічна) трансдукція характеризується перенесенням будь-якого гена або водночас кількох генів, які містяться в різних ділянках бактеріальної хромосоми. Перенесений фагом фрагмент ДНК-донора включається в гомологічну ділянку хромосоми реципієнта шляхом рекомбінації.
Специфічна трансдукція характеризується передачею від донора до реципієнта строго визначених генів. Цей тип трансдукції здійснюється дефективними помірними фагами, у яких частина геному замінена на фрагмент бактеріальної ДНК, що завжди ковалентно зв'язаний з фрагментом фагової ДНК. Такі помірні фаги втрачають частину життєво важливих генів і здатність до лізису щодо трансдукованих бактеріальних клітин.
Абортивна трансдукція відрізняється від інших типів автономною поведінкою фрагмента генома бактерії-донора у разі перенесення його в реципієнтну клітину. Фрагмент ДНК хромосоми донора, занесений фагом, не включається в хромосому реципієнта, а локалізується в цитоплазмі, а це приводить до того, що при поділі клітини цей фрагмент залишається лише в одній із дочірних клітин.
Трансдукцію використовують в гібридологічному аналізі ознак мікроорганізмів, при створенні генетичних карт тощо.
Набуття нових властивостей бактеріями у процесі літичної інфекції під впливом фага дістало назву фагової, або лізогенної конверсії. Конверсія відрізняється від трансдукції тим, що фаг вносить у клітину ген іншої клітини. Прикладом конверсії є утворення дифтерійного токсину у С. diphtheriae тільки за наявності у клітинах специфічного фага. Фагова конверсія є одним із видів мінливості, завдяки якому клітина може набувати нових спадкових ознак.
Кон’югація є процесом спрямованого перенесення генетичного матеріалу від клітини-донора до клітини-реципієнта. В цьому процесі беруть участь нерівноцінні батьківські клітини, їх нерівноцінність полягає в тому, що в клітину реципієнта переноситься тільки частина геному клітини-донора, в результаті чого утворюється неповна зигота, або мерозигота. Вона містить повний геном реципієнта і частину генома клітини-донора, а тому кон'югацію бактерій не можна ототожнювати зі статевим процесом.
Статева диференція бактерій зумовлюється статевим фактором, який позначається буквою «F». Він міститься лише в чоловічих клітинах. Фактор F – це генетичний елемент, який відповідає за успадкування чоловічої статі. Він являє собою дволанцюгову ДНК, замкнену в кільце, і зумовлює утворення у бактерій статевих ворсинок (F-пілі), через канальці яких при кон'югації бактерій відбувається перенесення генетичного матеріалу.
Клітини, які виконують під час кон'югації функцію донора, позначаються F+, а клітини, що відіграють роль реципієнтів – F-. Схрещування клітин F+ x F - супроводжується плодючістю, а клітин F - x F - – безплідністю. При кон'югації бактерій фактор F може переходити в реципієнтну клітину F+ і в цьому випадку вона перетворюється з жіночої на чоловічу.
У кон'югації можна виділити, за послідовністю проходження, такі стадії: а) випадкове зіткнення бактерії-донорі і бактерії-реципієнта під час змішування їхніх штамів; б) зумовлене дією фактора F з'єднання кон'югуючих пар клітин; в) перенесення генетичного матеріалу; г) утворення рекомбінантної хромосоми; д) її реплікація.
Кон'югація може відбуватися не тільки між штамами одного виду, а й між представниками різних видів і родів, що приводить до утворення так званих міжвидових і міжродових рекомбінантів.
Кон'югація є одним із поширених способів передачі генетичної інформації у прокаріотів. Наводяться дані про те, що генетичний обмін, зумовлений кон'югацією, відбувається в природі. З допомогою кон'югації проводять картування хромосом бактерій.
4. Використання досягнень генетики бактерій на практиці
Вивчення генетики мікроорганізмів знайшло своє відображення у спрямованій селекції високопродуктивних штамів, які застосовуватися в різних галузях народного господарства. Використання в селекції мікроорганізмів методів природного добору, індукованого мутагенезу, популяційної мінливості, клонування, гібридизації соматичних клітин тощо дало можливість одержати високопродуктивні штами мікроорганізмів. Останні знайшли широке застосування в мікробіологічній промисловості.
Умовно мікробні виробництва можна розділити на три типи:
• засновані на використанні живої або інактивованої біомаси мікроорганізмів; сюди відноситься виробництво пекарських, винних і кормових дріжджів, вакцин, інтерферонів, гормонів, інтерлейкінів, білково-вітамінних концентратів (БВК), засобів захисту рослин, заквасок для отримання кисломолочних продуктів і силосування кормів, препаратів для удобрення грунтів;
• що виробляють продукти мікробного біосинтезу, до числа яких відносяться антибіотики, гормони, ферменти, амінокислоти, вітаміни;
• виробництва, засновані на отриманні продуктів бродіння, гниття, наприклад утилізація целюлози і різних відходів з метою отримання вуглеводів, біогазу, біоетанолу. Сюди ж відносяться отримання спиртів, органічних кислот, розчинників, а також біотехнологія утилізації неприродних з'єднань.
Багатонадійні перспективи для сільського господарства, біології та медицини й інших галузей народного господарства відкриваються у зв'язку з розробкою і вдосконаленням методів генної і клітинної інженерії, за допомогою яких експериментально доведена можливість передачі не тільки природних генів, а й штучно синтезованих, які кодують синтез різноманітних біологічно активних сполук.
Генна інженерія видозмінила структуру і зміст сучасної промислової мікробіології. По-перше, істотно підвищилася продуктивність промислових мікроорганізмів – продуцентів класичних продуктів шляхом введення додаткових генів, збільшення їх кількості або активності. По-друге, вводячи в мікробну клітку нові гени, вдалося змінити живильні потреби мікроорганізму. Далі мікроорганізми “навчили” синтезувати невластиві їм речовини і таким чином збільшили різноманітність біотехнологічної продукції. Деякі білки людини, клоновані в мікробній клітці, зокрема інсулін, інтерферони, інтерлейкіни, знаходять в даний час терапевтичне застосування. Нарешті, піддалася перегляду вся логіка селекції мікроорганізмів-продуцентів. Так, якщо раніше спочатку шукали активний штам мікроорганізму і потім створювали конкретну біотехнологію з урахуванням фізіологічних властивостей і живильних потреб продуцента, то тепер можна узяти пристосований до умов виробництва штам і ввести в нього генну конструкцію, яка забезпечить ефективний синтез цільового продукту.
До числа важливих практичних досягнень генної інженерії необхідно віднести виділення, клонування і отримання діагностичних препаратів. Сьогодні вже більше 200 нових діагностікумів введені в медичну практику, розроблені способи діагностики такого небезпечного захворювання, як СНІД. Широко застосовуються методи генної діагностики, тобто виявлення дефектних генів, включаючи пренатальну діагностику.
Останнім часом інтенсивно вивчаються методи трансплантації генів за допомогою плазмід, які ще часто називають «генною інженерією в природі». Вони відіграють велику роль у передачі генетичного матеріалу між бактеріями, які належать навіть до віддалених філогенетичних груп. Плазміди є фактично каналом генетичної комунікації в бактеріальному світі. Тепер ведуться роботи з перенесення генів від бактерій до клітин вищих рослин.
В лабораторних умовах одержано рекомбінантні плазміди, які містять гени двох різних бактерій, бактерій і вірусів, бактерій і рослин, бактерій і тварин, бактерій і людини. Дуже важливим є те, що такі рекомбінантні плазміди інтродуковані в бактеріальні клітини, дали експресію.
Важливий внесок мікробної біотехнології в медицину полягає в отриманні профілактичних препаратів, причому цей вид продукції не має дублера в хімічній промисловості.
Методи генної інженерії дозволяють добитися поліпшення властивостей сільськогосподарських рослин шляхом створення так званих трансгенних рослин, тобто таких, які несуть чужорідні гени.
Введення генів в рослини здійснюється за допомогою Ti-плазмід, виділених з агробактерій, які при природному розвитку в природі переносять в заражену рослину частину власних генів, а їх продукти викликають трансформацію, переродження рослинних тканин і утворення наростів, так званих корончатих галлів. Саме ці гени були модифіковані і за допомогою агробактерій перенесені в рослини. В даний час одержано більше 50 видів трансгенних рослин, які придбали стійкість до комах-шкідників, фітопатогенним бактерій, мікроміцетів і вірусів, до пошкоджень при зберіганні, а також рослин, що синтезують гормони, які привертають корисних комах.
Зв'язок біотехнології з проблемами природоохоронного плану багатоманітний і заслуговує спеціального розгляду. Відомо, що основними забруднювачами природних водоймищ є стоки хімічних підприємств, що містять різні синтетичні органічні сполуки, розкладання яких в природі відбувається украй поволі. Мертвим вантажем накопичуються токсичні речовини, так звані ксенобіотики – сполуки, що не включаються в метаболізм живих організмів. Це речовини, створені фантазією людини, яких не знає природа. На допомогу приходять бактерії, різноманітність шляхів метаболізму яких настільки велика, що серед них знайдеться хоча б один представник, здатний утилізувати самі незвичайні, у тому числі і токсичні, сполуки. Спираючись на глибокі знання фізіології бактерій, мікробіологи вивчають шляхи катаболізму ксенобіотиків, можливість їх розкладання і детоксикациі. На основі цих досліджень створюють біотехнологічні способи очищення води від забруднення неприродними сполуками, а також методи, що дозволяють контролювати забруднення навколишнього середовища. Так, спеціальні мікробні продукти для контролю і моніторингу забруднень мають щорічний об'єм продажу близько 10 млн. доларів, а в перспективі цей об'єм може досягти 200 млн. доларів.
Особливої ваги набувають нині методи одержання енергії та переробки відходів промисловості і сільського господарства з метою одержання цінних біопродуктів і захисту біосфери від забруднення за допомогою мікроорганізмів. Мікробіологічна наука і мікробіологічна індустрія можуть зробити помітний внесок у розв'язання енергетичних проблем, які пов'язані зі значним зменшенням запасів нафти і вугілля на нашій планеті.
Контрольні питанння:
Міністерство освіти і науки україни
Львівський інститут економіки і туризму
Кафедра медицини, оздоровчого харчування і безпеки туризму
ОСНОВИ ГЕНЕТИКИ МІКРООРГАНІЗМІВ
Конспект лекції
з дисципліни ”Мікробіологія харчових продуктів”
підготовки фахівців спеціальності 7.091711
“Технологія харчування”
Львів -2006
можливість їх розкладання і детоксикациі. На основі цих досліджень створюють біотехнологічні способи очищення води від забруднення неприродними сполуками, а також методи, що дозволяють контролювати забруднення навколишнього середовища. Так, спеціальні мікробні продукти для контролю і моніторингу забруднень мають щорічний об'єм продажу близько 10 млн. доларів, а в перспективі цей об'єм може досягти 200 млн. доларів.
Особливої ваги набувають нині методи одержання енергії та переробки відходів промисловості і сільського господарства з метою одержання цінних біопродуктів і захисту біосфери від забруднення за допомогою мікроорганізмів. Мікробіологічна наука і мікробіологічна індустрія можуть зробити помітний внесок у розв'язання енергетичних проблем, які пов'язані зі значним зменшенням запасів нафти і вугілля на нашій планеті.
Контрольні питанння:
Основи генетики мікроорганізмів. Конспект лекції з з дисципліни ”Мікробіологія харчових продуктів” підготовки фахівців спеціальності 7.091711 “Технологія харчування”
Рецензент: професор кафедри мікробіології та вірусології Львівської національної академії ветеринарної медицини О.Я. Захарів
Склав:
к.б.н., доц. Шах А.Є.
Розглянуто і затверджено
на засіданні кафедри медицини,
оздоровчого харчування і безпеки туризму
Протокол №_________
від “_____”______________
Завідувач кафедри
к.б.н., доцент
____________А.П. Дідович
бактерій і рослин, бактерій і тварин, бактерій і людини. Дуже важливим є те, що такі рекомбінантні плазміди інтродуковані в бактеріальні клітини, дали експресію.
Важливий внесок мікробної біотехнології в медицину полягає в отриманні профілактичних препаратів, причому цей вид продукції не має дублера в хімічній промисловості.
Методи генної інженерії дозволяють добитися поліпшення властивостей сільськогосподарських рослин шляхом створення так званих трансгенних рослин, тобто таких, які несуть чужорідні гени.
Введення генів в рослини здійснюється за допомогою Ti-плазмід, виділених з агробактерій, які при природному розвитку в природі переносять в заражену рослину частину власних генів, а їх продукти викликають трансформацію, переродження рослинних тканин і утворення наростів, так званих корончатих галлів. Саме ці гени були модифіковані і за допомогою агробактерій перенесені в рослини. В даний час одержано більше 50 видів трансгенних рослин, які придбали стійкість до комах-шкідників, фітопатогенним бактерій, мікроміцетів і вірусів, до пошкоджень при зберіганні, а також рослин, що синтезують гормони, які привертають корисних комах.
Зв'язок біотехнології з проблемами природоохоронного плану багатоманітний і заслуговує спеціального розгляду. Відомо, що основними забруднювачами природних водоймищ є стоки хімічних підприємств, що містять різні синтетичні органічні сполуки, розкладання яких в природі відбувається украй поволі. Мертвим вантажем накопичуються токсичні речовини, так звані ксенобіотики – сполуки, що не включаються в метаболізм живих організмів. Це речовини, створені фантазією людини, яких не знає природа. На допомогу приходять бактерії, різноманітність шляхів метаболізму яких настільки велика, що серед них знайдеться хоча б один представник, здатний утилізувати самі незвичайні, у тому числі і токсичні, сполуки. Спираючись на глибокі знання фізіології бактерій, мікробіологи вивчають шляхи катаболізму ксенобіотиків,
Харченко С.М. Мікробіологія: – Київ: Сільгоспосвіта, 1994. – 348 с.
1. Генетика, як наука про спадковість та мінливість мікроорганізмів
Генетика – наука про два різних і незалежних один від одного біологічних процеси – спадковість і мінливість живих організмів. Процеси спадковості й мінливості широко вивчаються у світі мікробів, оскільки мікроорганізми є найзручнішим об'єктом для генетичних досліджень, бо за короткий час утворюють велику кількість генерацій.
Генна інженерія видозмінила структуру і зміст сучасної промислової мікробіології. По-перше, істотно підвищилася продуктивність промислових мікроорганізмів – продуцентів класичних продуктів шляхом введення додаткових генів, збільшення їх кількості або активності. По-друге, вводячи в мікробну клітку нові гени, вдалося змінити живильні потреби мікроорганізму. Далі мікроорганізми “навчили” синтезувати невластиві їм речовини і таким чином збільшили різноманітність біотехнологічної продукції. Деякі білки людини, клоновані в мікробній клітці, зокрема інсулін, інтерферони, інтерлейкіни, знаходять в даний час терапевтичне застосування. Нарешті, піддалася перегляду вся логіка селекції мікроорганізмів-продуцентів. Так, якщо раніше спочатку шукали активний штам мікроорганізму і потім створювали конкретну біотехнологію з урахуванням фізіологічних властивостей і живильних потреб продуцента, то тепер можна узяти пристосований до умов виробництва штам і ввести в нього генну конструкцію, яка забезпечить ефективний синтез цільового продукту.
До числа важливих практичних досягнень генної інженерії необхідно віднести виділення, клонування і отримання діагностичних препаратів. Сьогодні вже більше 200 нових діагностікумів введені в медичну практику, розроблені способи діагностики такого небезпечного захворювання, як СНІД. Широко застосовуються методи генної діагностики, тобто виявлення дефектних генів, включаючи пренатальну діагностику.
Останнім часом інтенсивно вивчаються методи трансплантації генів за допомогою плазмід, які ще часто називають «генною інженерією в природі». Вони відіграють велику роль у передачі генетичного матеріалу між бактеріями, які належать навіть до віддалених філогенетичних груп. Плазміди є фактично каналом генетичної комунікації в бактеріальному світі. Тепер ведуться роботи з перенесення генів від бактерій до клітин вищих рослин.
В лабораторних умовах одержано рекомбінантні плазміди, які містять гени двох різних бактерій, бактерій і вірусів,
Місцем локалізації генетичного матеріалу є ядра в еукаріотних клітинах, а нуклеоїди в прокаріотних. Генетичний апарат у бактерій складається з молекули ДНК, замкненої в кільце, яке міститься в нуклеарній ділянці клітини. Гігантська кільцева молекула ДНК, яка складається із функціонально неоднорідних генетичних детермінант генів, дістала назву бактеріальної хромосоми (рис. 1).
Рис. 1. Бактеріальна клітина, в якій містяться: 1 -нуклеоїд (хромосомна ДНК) і 2 - плазміда (плазмідна ДНК)
Гени прокаріотної клітини складаються із безперервно кодуючої послідовності нуклеотидів, тобто прокаріотам властиве тісне зчеплення генів. Хромосоми бактерій володіють однією групою зчеплення генів. Інформація в генах записана однаковим генетичним кодом для всіх прокаріотів, і принципи її реалізації також однакові у всіх організмів. У структурі гена запрограмовані два основні його вираження (експресії) – транскрипція і трансляція. Гени бактерій складаються із промотора, білок-кодуючої ділянки і термінатора транскрипції.
У багатьох видів бактерій є ще один тип генетичних елементів, що існують у клітині автономно, тобто поза хромосомами. Це плазміди, які є типовими репліконами. Вони мають здатність до саморегуляції незалежно від механізмів, які регулюють розмноження бактеріальної хромосоми. Вважається, що генетична інформація, яка міститься у плазмідах та інших позахромосомних елементах (помірних фагах), не є обов'язковою для життєдіяльності бактерій. Проте ці елементи розширяють можливості існування бактеріального виду.
4. Використання досягнень генетики бактерій на практиці
Вивчення генетики мікроорганізмів знайшло своє відображення у спрямованій селекції високопродуктивних штамів, які застосовуватися в різних галузях народного господарства. Використання в селекції мікроорганізмів методів природного добору, індукованого мутагенезу, популяційної мінливості, клонування, гібридизації соматичних клітин тощо дало можливість одержати високопродуктивні штами мікроорганізмів. Останні знайшли широке застосування в мікробіологічній промисловості.
Умовно мікробні виробництва можна розділити на три типи:
• засновані на використанні живої або інактивованої біомаси мікроорганізмів; сюди відноситься виробництво пекарських, винних і кормових дріжджів, вакцин, інтерферонів, гормонів, інтерлейкінів, білково-вітамінних концентратів (БВК), засобів захисту рослин, заквасок для отримання кисломолочних продуктів і силосування кормів, препаратів для удобрення грунтів;
• що виробляють продукти мікробного біосинтезу, до числа яких відносяться антибіотики, гормони, ферменти, амінокислоти, вітаміни;
• виробництва, засновані на отриманні продуктів бродіння, гниття, наприклад утилізація целюлози і різних відходів з метою отримання вуглеводів, біогазу, біоетанолу. Сюди ж відносяться отримання спиртів, органічних кислот, розчинників, а також біотехнологія утилізації неприродних з'єднань.
Багатонадійні перспективи для сільського господарства, біології та медицини й інших галузей народного господарства відкриваються у зв'язку з розробкою і вдосконаленням методів генної і клітинної інженерії, за допомогою яких експериментально доведена можливість передачі не тільки природних генів, а й штучно синтезованих, які кодують синтез різноманітних біологічно активних сполук.
Плазміди можуть існувати в клітині не тільки в автономному, а й в інтегрованому (об'єднаному) стані з бактеріальною хромосомою (подібно до хромосомних генів). У цьому разі їх називають епісомами. До останніх належать F-фактор, помірні фаги та ін. Кількість плазмідної ДНК у клітині не перевищує відсотків від вмісту ДНК у бактеріальній хромосомі. Головними властивостями плазмід є їхня здатність до автономної реплікації і трансмісивність (здатність до самопередавання). Переважна більшість плазмід складається із трьох груп генів: ділянки ДНК, яка відповідає за автономну реплікацію плазміди в клітині; генів, що забезпечують можливість перенесення плазмід із однієї клітини в іншу, і генів, котрі визначають корисні властивості для клітини-хазяїна. Вивчення молекулярної природи плазмід та їхніх функцій в бактеріальній клітині дозволило успішно використовувати їх у генній інженерії.
Первинним генетичним матеріалом, з якого безпосередньо побудовані хромосоми і гени, а також бактеріальні плазміди є ДНК. Вторинним генетичним матеріалом є РНК. Перед поділом клітини ДНК її геном реплікується і до кожного ланцюга добудовується коплементарний ланцюг. Обидві нові подвійні спіралі ДНК складаються з однієї початкової і однієї заново синтезованої нитки. Таке подвоєння ДНК дозволяє зберігати генетичну інформацію клітини. Для реалізації цієї генетичної інформації ДНК спочатку транскрибується в молекули мРНК, які взаємодіють із рибосомами. В останніх інформація з послідовності нуклеотидів переводиться в послідовність амінокислот.
Виявлення у прокаріотів спільних із вищими організмами закономірностей спадковості і мінливості, тобто принципова схожість у будові та функціях їхніх геномів, дає змогу розглядати результати, які одержують на бактеріях, як загальнобіологічні.
2. Мінливість генетичного матеріалу прокаріотів
Вивчення мінливості бактерій тісно зв’язано з термінами «генотип» і «фенотип». Генотипом, або геномом, називають
реципієнта. В цьому процесі беруть участь нерівноцінні батьківські клітини, їх нерівноцінність полягає в тому, що в клітину реципієнта переноситься тільки частина геному клітини-донора, в результаті чого утворюється неповна зигота, або мерозигота. Вона містить повний геном реципієнта і частину генома клітини-донора, а тому кон'югацію бактерій не можна ототожнювати зі статевим процесом.
Статева диференція бактерій зумовлюється статевим фактором, який позначається буквою «F». Він міститься лише в чоловічих клітинах. Фактор F – це генетичний елемент, який відповідає за успадкування чоловічої статі. Він являє собою дволанцюгову ДНК, замкнену в кільце, і зумовлює утворення у бактерій статевих ворсинок (F-пілі), через канальці яких при кон'югації бактерій відбувається перенесення генетичного матеріалу.
Клітини, які виконують під час кон'югації функцію донора, позначаються F+, а клітини, що відіграють роль реципієнтів – F-. Схрещування клітин F+ x F - супроводжується плодючістю, а клітин F - x F - – безплідністю. При кон'югації бактерій фактор F може переходити в реципієнтну клітину F+ і в цьому випадку вона перетворюється з жіночої на чоловічу.
У кон'югації можна виділити, за послідовністю проходження, такі стадії: а) випадкове зіткнення бактерії-донорі і бактерії-реципієнта під час змішування їхніх штамів; б) зумовлене дією фактора F з'єднання кон'югуючих пар клітин; в) перенесення генетичного матеріалу; г) утворення рекомбінантної хромосоми; д) її реплікація.
Кон'югація може відбуватися не тільки між штамами одного виду, а й між представниками різних видів і родів, що приводить до утворення так званих міжвидових і міжродових рекомбінантів.
Кон'югація є одним із поширених способів передачі генетичної інформації у прокаріотів. Наводяться дані про те, що генетичний обмін, зумовлений кон'югацією, відбувається в природі. З допомогою кон'югації проводять картування хромосом бактерій.
сукупність усіх генів, які властиві даному організму. Фенотип – це весь комплекс зовнішніх і внутрішніх ознак організму, таких як форма, розміри, забарвлення, хімічний склад, поведінка, макро- і мікроскопічні особливості тощо.
Подібні за генотипом мікроорганізми можуть істотно відрізнятися за фенотипом. Фенотипові відмінності між прокаріотами, що є однаковими за генотипом, називаються модифікаціями.
Здатність організмів змінювати властивості відповідно до зміни умов навколишнього середовища називають мінливістю. Набуті при цьому ознаки носять тимчасовий характер, вони спадково не закріплюються нащадками і зберігаються, поки діє фактор, що їх спричинив. Така мінливість називається неспадковою, або адаптивною, а явище – адаптацією. Доведено, що модифікація (адаптація) є мінливістю, яка відбувається на рівні фенотипу і не зачіплює генотипу клітини.
Поява під впливом різних екологічних факторів у мікробних клітин нових ознак, які спадково закріплюються в новому поколінні називається спадковою мінливістю.
Адаптивні модифікації розширюють можливість організму до виживання і розмноження в ширшому діапазоні довкілля.
Мутації (від лат. mutatio – зміна). Раптові зміни в генетичному апараті клітини, що приводять до появи нових ознак і властивостей, які передаються наступним поколінням, дістали назву мутацій.
Мутації, які виникають у нормальних умовах самовільно і мають випадковий характер як у часі, так і просторі, називаються спонтанними.
Мутації, які виникають після дії на прокаріотні клітини фізичних і хімічних чинників називаються індукованими. Їх можна штучно викликати і вони піддаються контролю. Чинники, які спричиняють мутації (ультрафіолет, радіація, хімічні речовини тощо), називають мутагенами.
Серед мутацій розрізняють генні, які відбуваються лише в одному гені, тобто при генних мутаціях зміни стосуються тільки одного нуклеотиду, і хромосомні, які поширюються на
холерного вібріона, стафілококів, сінної палички та в інших бактерій.
Розрізняють три типи трансдукції: загальну, специфічну і абортивну.
Загальна (генералізована, неспецифічна) трансдукція характеризується перенесенням будь-якого гена або водночас кількох генів, які містяться в різних ділянках бактеріальної хромосоми. Перенесений фагом фрагмент ДНК-донора включається в гомологічну ділянку хромосоми реципієнта шляхом рекомбінації.
Специфічна трансдукція характеризується передачею від донора до реципієнта строго визначених генів. Цей тип трансдукції здійснюється дефективними помірними фагами, у яких частина геному замінена на фрагмент бактеріальної ДНК, що завжди ковалентно зв'язаний з фрагментом фагової ДНК. Такі помірні фаги втрачають частину життєво важливих генів і здатність до лізису щодо трансдукованих бактеріальних клітин.
Абортивна трансдукція відрізняється від інших типів автономною поведінкою фрагмента генома бактерії-донора у разі перенесення його в реципієнтну клітину. Фрагмент ДНК хромосоми донора, занесений фагом, не включається в хромосому реципієнта, а локалізується в цитоплазмі, а це приводить до того, що при поділі клітини цей фрагмент залишається лише в одній із дочірних клітин.
Трансдукцію використовують в гібридологічному аналізі ознак мікроорганізмів, при створенні генетичних карт тощо.
Набуття нових властивостей бактеріями у процесі літичної інфекції під впливом фага дістало назву фагової, або лізогенної конверсії. Конверсія відрізняється від трансдукції тим, що фаг вносить у клітину ген іншої клітини. Прикладом конверсії є утворення дифтерійного токсину у С. diphtheriae тільки за наявності у клітинах специфічного фага. Фагова конверсія є одним із видів мінливості, завдяки якому клітина може набувати нових спадкових ознак.
Кон’югація є процесом спрямованого перенесення генетичного матеріалу від клітини-донора до клітини-
кілька генів. Останні пов'язані зі значними перебудовами в окремих фрагментах ДНК і виявляються в результаті випадання тієї чи іншої кількості нуклеотидів, їх називають дилеції. Мутації, що супроводжуються повертанням ділянки ДНК на 180°, дістали назву інверсій, а якщо під час мутації повторюється який-небудь фрагмент ДНК, то це називають дуплікацією.
За зміною ознак розрізняють морфологічні, фізіологічні і біохімічні мутації.
За напрямом зміни ознаки мутації бувають прямі і зворотні. Перші є змінами в генах бактерій дикого типу. Зворотними називають мутації від мутантного типу до дикого. Зворотні мутації, які приводять до відновлення фенотипу і генотипу, називають прямими. Зворотні мутації, які відновлюють лише фенотип, а генотип лишається мутованим, дістали назву супресорних. При цьому відбувається вторинна пряма мутація в іншому гені, яка пригнічує виявлення першої.
Для захисту генетичного матеріалу, від пошкодження різними мутагенами, у прокаріотів виявлено ефективні системи репарації (відновлення) мутаційних уражень.
Дисоціація. Розщеплення однорідної популяції бактерій за культуральними властивостями на типи, які відрізняються від вихідного зовнішнім виглядом і структурою колоній, а також стійкими змінами окремих фізіолого-біохімічних властивостей називається дисоціацією. Прикладом дисоціації є виникнення різних типів колоній в чистій культурі бактерій: тип S (англ.- smooth – гладенький) – гладенькі, прозорі, з рівними краями, чітко кулясті, і тип R (англ. rough – шорсткий) – сухі, непрозорі, з шорсткою і борознистою поверхнею, контурами неправильної форми і нерівномірними зазубреними краями. Між ними існують перехідні форми, нестійкі типи, які позначають літерами О і М (відповідно проміжні і слизові). Такі культури відрізняються за морфологічними, фізіологічними, антигенними та вірулентними властивостями. У більшості патогенних мікробів тип S вірулентніший, ніж тип R. Винятком є збудник сибірки: у нього R-форми патогенніші і вірулентніші, ніж S-
форми. Можливий перехід типу S в тип R. Зворотній перехід спостерігається дуже рідко.
3. Генетичні рекомбінації у бактерій
До спадкової мінливості також належать зміни, які виникають у прокаріотів внаслідок рекомбінації генетичного матеріалу. Це процес генетичної рекомбінації, сутність якого полягає в тому, що із клітини-донора у клітину-реципієнта переноситься частина генетичного матеріалу; при цьому відбувається рекомбінація генів і утворюється рекомбінантна хромосома. Як правило, реципієнтна клітина одержує тільки фрагмент хромосоми донора, а тому вона стає лише частково диплоїдною (або меризиготою). Така часткова передача генетичного матеріалу дістала назву мероміксису.
Генетичні рекомбінації у прокаріотів істотно відрізняються від подібних процесів у еукаріотів. У останніх під час запліднення об'єднуються два повні гаплоїдні набори і утворюється диплоїдна зигота, в якій після низки мітотичних поділів відбувається рекомбінація генетичного матеріалу і редукційний поділ (мейоз), внаслідок якого знову утворюються гаплоїдні клітини (гамети).
Генетичні рекомбінації є невичерпним джерелом мінливості, оскільки в природних умовах прокаріоти перебувають у складі різних асоціацій — біоценозів і паразитоценозів, що створює сприятливі умови для обміну генами. Процес генетичної рекомбінації у бактерій належить до так званих парасексуальних процесів. Відомо три типи таких процесів: трансформація, кон'югація і трансдукція.
Трансформацією (від лат. transformatio – перетворення) називають передачу генетичного матеріалу від донора до реципієнта за допомогою вільної ДНК, виділеної з клітини донора.
Трансформація відбувається у три стадії: 1) контакт ДНК з поверхнею клітини; 2) проникнення ДНК у клітину; 3) з'єднання ДНК донора з відповідною ділянкою хромосоми реципієнта. Трансформація можлива тільки тоді, коли реципієнтна клітина перебуває у стані «компетентності», під
час якої вона здатна сприймати ДНК клітини донора. Найчастіше цей період припадає на середину логарифмічної фази росту.
Після проникнення в реціпієнтну клітину фрагмента ДНК клітини донора одна нитка розпадається, а друга вступає в генетичний обмін з реципієнтною ДНК. Інтеграція закінчується утворенням рекомбінантної хромосоми, в якій донорні і реципієнтні ознаки подекуди виявляються тісно зчепленими. Рекомбінантна ДНК далі реплікується як єдина структура.
Розрізняють гомотрансформацію, при якій відбувається перенесення генетичної інформації від донора до реципієнта в межах одного виду, і гетеротрансформацію — перенесення ДНК від одного виду до іншого.
За передачею ознак розрізняють три типи трансдукції: загальну (неспецифічну), специфічну і абортивну. При загальній трансдукції відбувається передача однієї або декількох ознак одночасно. Специфічна трансдукція характеризується перенесенням тільки певної ознаки. При абортивній трансдукції перенесена фагом ділянка ДНК клітини-донора не включається до геному клітини-реципієнта і відповідно прояву нової ознаки не спостерігається.
Явище трансформації у прокаріотів дало змогу встановити роль нуклеїнових кислот як носіїв спадкової інформації. Тепер ДНК відповідних штамів бактерій використовують для трансформації їх властивостей: вірулентності, стійкості проти антибіотиків, зміни антигенного апарату тощо, а також для встановлення філогенетичної спорідненості донора і реципієнта. Трансформацію використовують і в селекції мікроорганізмів.
Трансдукція, або конверсія є процесом перенесення ДНК (хромосоми) від клітини-донора до клітини-реципієнта за допомогою помірного бактеріофага. Цей процес супроводжується зміною генотипу реципієнтної клітини після одержання нею фрагмента геному бактерії-донора. Трансдукцію виявлено у бактерій дизентерії, сальмонел,
