Конфокальная сканирующая оптическая микроскопия.

Марголин 389с.

Оптическая микроскопия использовала все достижения как техники и технологии, так и информационных и компьютерных технологий. Это привело к значительному усовершенствованию имеющейся аппаратуры и методик ее использования, что, в свою очередь, привело к появлению новых методов, в частности, кон­фокальной микроскопии. Конфокальный микроскоп отличается от классического оптического микроскопа тем, что в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объек­та, а полноценное изображение строится путем сканирования (движения образца или перестройки оптической системы). Та­ким образом, в своеобразной форме реализуется принцип рас­тровой электронной микроскопии, что позволяет сколь угодно долго регистрировать и обрабатывать сигнал с каждой отдельно взятой точки.

В классическом микроскопе в фотоприемное устройство попа­дает свет из различных точек образца. В конфокальном микроско­пе для того, чтобы регистрировать свет только от одной точки, после объективной линзы располагается диафрагма малого разме­ра таким образом, что свет, испускаемый анализируемой точкой, проходит через диафрагму и будет зарегистрирован, а свет от ос­тальных точек в основном задерживается диафрагмой, как это показано на рис. 7.28.

Рис. 7.28. Схема прохождения лучей в конфокальном оптическом микроскопе

Еще одна особенность заключается в том, что осветитель со­здает не равномерную освещенность поля зрения, а фокусирует свет в анализируемую точку. Это может достигаться расположени­ем второй фокусирующей системы за образцом, но при этом тре­буется, чтобы образец был прозрачным. Кроме того, объективные линзы обычно имеют высокую стоимость, поэтому использова­ние второй фокусирующей системы для подсветки мало предпоч­тительно. Альтернативой является использование светоделитель­ной пластинки, так чтобы и падающий и отраженный свет фоку­сировались одним объективом. Такая схема к тому же облегчает юстировку.

Применение конфокальной схемы должно приводить к уве­личению контрастности изображения за счет того, что «паразит­ный» свет от точек, соседних с анализируемой точкой, переста­ет попадать в детектор. Платой за увеличение контрастности бу­дет необходимость применения достаточно сложных схем скани­рования: либо путем прецизионного передвижения образца, либо путем передвижения самого светового пучка. На конфокальном микроскопе изображение увидеть или охватить сразу глазом, как в обычной оптике, невозможно. Изображение получается только на экране компьютера. Область фокусировки в конфокальном мик­роскопе в 10 раз меньше, чем в обычном микроскопе, потому что диафрагма на приемнике имеет очень маленький рабочий размер.

Рассмотрим теперь, каким образом и насколько количествен­но изменяется контрастность при применении конфокальной микроскопии. Так как в конфокальном микроскопе свет дважды проходит через объектив, функция размытия точки (далее обо­значаемая PSF) будет представлять собой произведение независи­мых вероятностей того, что фотон попадет в точку с ее координа­тами либо фотон будет зарегистрирован из этой точки.

Если использовать критерий Рэлея для разрешения, то полу­чится, что разрешение в конфокальном микроскопе увеличивает­ся, но не существенно. Для конфокального микроскопа имеем выражение для разрешения r:

В то время как для обычного микроскопа:

Однако основным достоинством конфокального микроскопа является не увеличение разрешения в смысле критерия Рэлея, а существенное увеличение контрастности. В частности, для обыч­ной PSF в фокальной плоскости отношение амплитуды в первом боковом максимуме к амплитуде в центре составляет 2%, а для конфокального микроскопа это отношение будет составлять 0,04 %. Из этого следует, что тусклый объект с интенсивностью, напри­мер, в 200 раз меньшей, чем у яркого объекта, в обычном микро­скопе обнаружить невозможно, хотя расстояние между объектами может быть существенно больше того расстояния, которое пред­писано критерием Рэлея. В то же время в конфокальном микро­скопе такой объект должен хорошо регистрироваться.

Важным параметром является размер диафрагм в фокальной плоскости облучающей и собирающей линз. Изображение диаф­рагмы в плоскости объекта определяет, из каких областей свет регистрируется фотодетектором. Очевидно, что уменьшение раз­мера диафрагмы приводит к уменьшению количества проходяще­го света, увеличивает уровень шума и в конечном итоге может свести на «нет» все достигнутые преимущества по контрастности. Таким образом, встает вопрос об оптимальном выборе размера диафрагмы и разумном компромиссе.

Диафрагма с размером отверстия меньше пятна Эйри просто приводит к потере интенсивности и никак не влияет на разреше­ние. Диафрагма с размером отверстия в одно пятно Эйри позво­ляет максимально использовать разрешающую способность объек­тивной линзы. Однако диафрагма с размером отверстия примерно в 3 — 5 раз больше пятна Эйри представляется наиболее подходя­щим компромиссом. Следует понимать, что обсуждаемый здесь размер имеет смысл размера изображения в плоскости объекта, а поэтому реальный размер отверстия в диафрагме зависит от уве­личения линзы. В частности, при использовании 100-кратной линзы диафрагма с отверстием 1 мм будет спроецирована в плоскость объекта в круг радиусом 10 мкм.

Развитием идеи конфокальной микроскопии явилась разработка конфокального лазерного сканирующего микроскопа (KJICM), что было вызвано потребностью в более чувствительных и метрологи­чески строгих методах анализа формы и пространственной струк­туры наблюдаемых объектов. Принципиальная схема КЛСМ с ос­новными функциональными связями показана на рис. 7.29.

Основной особенностью КЛСМ является возможность послой­ного изображения исследуемого объекта с высоким разрешением и низким уровнем шумов. Достигается это путем пошагового ска­нирования объекта сфокусированным пучком света от когерент­ного источника или передвижением столика с использованием специальных флуоресцентных зондов и специальных методов ог­раничения световых потоков.

Рис. 7.29. Структурная схема KJICM:

1 — сканирующий столик; 2 — исследуемый образец; 3, 6 — объективы; 4 — сканирующее устройство; 5 — светоделительная пластина; 7, 9 — игольчатые ди­афрагмы; 8 — приемник излучения; 10 — лазер; 11 — блок управления; 12 — компьютер; 13 — привод для сканирования по оси z.

Использование в КЛСМ точечной диафрагмы, размеры кото­рой согласованы с увеличением микроскопа и длиной волны, дает возможность повысить разрешение более чем на 10%. Очевидно, что разрешение КЛСМ и соответственно возможности анализа тон­ких структур могут превышать аналогичные возможности обычного микроскопа не более чем на 40 % в условиях сканирования пре­парата тонким лучом. Разрешающая способность KЛCM зависит от способа микроскопирования и освещения. Разрешение KЛCM оп­ределяется как оптической системой, так и электронным трактом обработки информации. Поэтому в конструкции KЛCM, его схе­мах должны быть согласованы такие параметры, как разрешение оптической системы, шаг сканирования, характеристики детекто­ра, а также должны быть выбраны оптимальные алгоритмы обра­ботки и соответствующее программное обеспечение.

В общем случае глубина резкости KЛCM зависит от апертуры, длины волны, когерентности источников света и размеров иголь­чатой диафрагмы. Игольчатая диафрагма является основным эле­ментом конструкции, отличающим KЛCM от других типов мик­роскопов. Игольчатые диафрагмы предназначены для создания условий максимальной или полной фильтрации света, попадаю­щего в плоскость формирования изображения от точек, не совпа­дающих с фокальной плоскостью или находящихся рядом с анализируемым элементом объекта в фокальной плоскости.

Выбор оптимального диаметра игольчатой диафрагмы важен для получения требуемых характеристик прибора. Соотношения для оценки латерального разрешения и глубины резкости KJICM получаются в предположении, что игольчатая диафрагма имеет малое отверстие, являясь светящейся точкой. Реально размер иголь­чатой диафрагмы конечен и от него зависят поперечное разреше­ние прибора, яркость освещенных элементов препарата, смещен­ных относительно фокальной плоскости по оси z, и глубина рез­кости. При малых диаметрах игольчатой диафрагмы све­товой поток становится малым, что уменьшает отношение сиг­нал/шум и снижает контрастность. При больших диаметрах эф­фективность игольчатой диафрагмы снижается за счет уменьше­ния апертуры.

Дата добавления: 2015-10-28