Штаммы и среды.

Тема: Выделение и очистка белка pkb5

Экспериментальная часть

Штаммы и среды.

В работе использовали штамм E.coliBL21(DE3)pLysS, с плазмидой pET32a:Pkb5 (рис), содержащей каталитический домен протеинкиназы pkb5 Bifidobacterium longum.

Для выращивания клеток E.coli использовали питательные среды LB и TB.

Таблица 1-Питательные среды, использованные для выращивания E.coli

Название	Состав (на 1 литр)
LB агаризованная	25 г сухой среды LB растворяли в дистиллированной H2O, рН 7,2-7,4 доводили NaOH; добавляли 2,0% агара
TB	24 г дрожжевого экстракта, 12 г бакто-триптона, 4 мл глицерина растворяли в дистиллированной H2O (900 мл), рН 7,2-7,4 доводили KOH. Отдельно готовили следующий раствор; 12,54 г K2HPO4, 2,31 г KH2PO4 доводили до 100 мл дистиллированной H2O; после автоклавирования объединяли растворы

Среды стерилизовали в автоклаве при избыточном давлении 0,8 ати в течение 40 минут.

Для поддержания штамма E.coliBL21(DE3)pLysS, содержащего плазмиду pET32a:Pkb5, проводили моноклоновый рассев на чашках Петри с агаризованной средой LB с добавлением хлорамфеникола(30 мкг/мл) и ампициллина (150 мкг/мл).

Для наработки биомассы клетки E.coliBL21(DE3)pLysS, содержащие плазмиду pET32a:Pkb5, выращивали в колбах на среде ТВ с добавлением хлорамфеникола и ампициллина.

На первом этапе выращивали ночные культуры на среде ТВ. На втором этапе в колбы с 150 мл свежей среды вносили по 1,5 ночной культуры. Выращивание проводили в аэрируемых условиях при 250 об/мин и температуре 37⁰С до оптической плотности OD₆₀₀ = 0,6 (~2 часа), затем индуцировали экспрессию добавлением ИПТГ (изопропил - β-D-тиогалактозид) до конечной концентрации 0,5 мМ. Далее проводили культивирование при 28⁰С в течение 18 часов, после чего биомассу осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 6 000 об/мин, промывали 1M Tris-HCl (pH 7,6-8,0) и замораживали при -20⁰С.

Рис. Схема конструкции плазмиды pET32a: Pkb5.

Дата добавления: 2015-10-21