Примеры подвижных фаз в ТСХ

хлороформ - ацетон 9:1

барбитурат ы

гексан - ацетон 4:1

неподвижная фаза силикагель

метанол - диэтиловый эфир - аммиак 98:1:1

4-

вещества основного характера

24.2.1. Методика получения плоскостной хроматограммы

Методика получения плоскостных хроматограмм включает в се­бя следующие этапы:

• предварительный этап - подготовка сорбента и исследуемой пробы, подготовка подвижной фазы, насыщение хроматографиче- ской камеры;

• нанесение исследуемой пробы на хроматографическую пла­стинку или бумагу;

• хроматографирование;

• высушивание хроматограммы;

• обнаружение пятен (зон) разделённых компонентов пробы.

Нанесение исследуемого раствора на хроматографическую пла­стинку или бумагу проводят градуированным капилляром, микро­шприцом или микропипеткой. Капля наносится касанием капилляра или иглы поверхности пластинки (но не надавливанием, так как при этом можно повредить слой сорбента!). Для предотвращения смыва­ния веществ с пластинки нанесение пятен проводят на линии, нахо­дящейся на расстоянии 1-2 см от нижнего края пластинки. Оптималь­ное количество исследуемого вещества (объём раствора), наносимого на пластинку, обычно определяется экспериментально. Если наноси­мое количество вещества слишком мало, то его можно не заметить при последующем проявлении. Нанесение на пластинку слишком
большого количества вещества приводит к перегрузке сорбента и, как следствие, размы­ванию пятна и уменьшению величины R_f (рис. 24.2).

После нанесения исследуемых веществ на хроматографическую пластинку или бу­магу, последние помещают в хроматографи- ческую камеру и проводят хроматографиро- вание. Обычно процесс хроматографирова- ния ведут до тех пор, пока растворитель не поднимется на расстояние ~10 см от линии старта.

Рис. 24.2. Изменение по­ложения и формы пятна при увеличении количества вещества, нанесённого на пластинку

Способы получения плоскостных хроматограмм

В зависимости от направления движе­ния подвижной фазы различают следующие варианты плоскостной хроматографии (табл. 24.1)

Табл. 24.1.

Способ	Сущность способа
восходящая хроматография	Фронт подвижной фазы перемещается снизу вверх под дейст­вием капиллярных сил. Для получения хроматограммы ис­пользуется наиболее простое оборудование - в качестве хро- матографической камеры можно использовать любую емкость с плоским дном и плотно закрывающейся крышкой, в кото­рую свободно помещается хроматографическая пластинка. Наиболее часто используемый способ получения хромато­грамм.
нисходящая хроматография	Фронт подвижной фазы перемещается сверху вниз в основ­ном под действием сил тяжести. Для получения нисходящей хроматограммы в верхней части хроматографической камеры крепится кювета с хроматографической системой, из которой с помощью фитиля на хроматографическую пластинку посту­пает растворитель.
радиальная хроматография	Исследуемое вещество наносится в центр пластинки. Фронт подвижной фазы перемещается от центра к краю пластинки
двухмерная хроматография .....	После получения хроматограммы проводится повторное раз­деление в направлении, перпендикулярном исходному, с ис­пользованием подвижной фазы другого состава. Часто ис­пользуется в бумажной хроматографии, например, в фар­макогнозии при изучении состава лекарственных расте­ний.

После завершения процесса хроматографирования пластинку извлекают из хроматографической камеры и сушат. Высушенная пла­стинка представляет собой хроматограмму исследуемых веществ.

24.2.2. Анализ плоскостной хроматограммы

Разделяемые компоненты обра­зуют на хроматографической пластин­ке или полоске хроматографической бумаги отдельные зоны (пятна). При­мерный вид плоскостной хромато- граммы показан на рис. 24.3. Зоны ок­рашенных веществ можно обнаружить визуально. Для обнаружения неокра­шенных соединений используют фи­зические (например, облучение УФ- светом), химические (обработка хро­матограммы различными реагентами- проявителями), а в некоторых случаях и биологические методы.

фронт элюэнта

Q

L

^x2

^x1

линия старта

Рис. 24.3. Примерный вид плоско стной хроматограммы

Некоторые из реагентов, исполь­зуемых для проявления хроматограмм, показаны в табл. 24.2.

Табл. 24.2.

Некоторые реагенты-проявители, используемые в плоскостной хроматографии

Реагент	Обнаруживаемые вещества	Аналитический эффект
Нингидрин	Аминокислоты, пептиды, первичные амины	Синее (пурпурное, коричневое и др.) окрашивание
Реактив Драгендорфа K[Bil4]	Третичные амины и чет­вертичные аммониевые соединения	Тёмно-оранжевые пятна на жёл­том фоне
Раствор SbCl3 в хлороформе	Стероиды	Фиолетовое окрашивание
FeCl3	Фенолы, легкоокисляю- щиеся вещества (аналь­гин, амидопирин и др.)	Сине-фиолетовое, красно- фиолетовое и др. окрашивание на жёлтом фоне
2,4-Динитро- фенилгидразин	Альдегиды, кетоны	Жёлтое окрашивание, переходя­щее в красно-коричневое при об­работке 10%-ным NaOH

Положение отдельных хроматографических зон на хромато- грамме характеризуют с помощью величины R_f, равной отношению расстояния, пройденного зоной вещества от стартовой линии до цен­
тра зоны (x), к расстоянию от стартовой линии до границы фронта растворителя к концу опыта (L)

x

R_f =

L

Величина R_f может принимать значения от 0 до 1. Если R_f = 0, то вещество остаётся на старте, если R_f = 1, то оно поднимается с фрон­том растворителя. Величина R_f является качественной хроматографи- ческой характеристикой вещества. Она зависит от природы вещества, подвижной и неподвижной фазы, условий хроматографирования и, в определённых пределах, не зависит от концентрации вещества.

Подвижность разделяемых веществ можно также сравнить с подвижностью вещества, принятого за стандарт

Величина R_f связана с коэффициентом распределения вещества (D) и коэффициентом емкости неподвижной фазы по отношению к данному веществу (k') следующими уравнениями:

V D = ^mVs

f 1 - ll V ^Rf J

k ' =^1^-^Rf Rf

Рис. 24.4. Расчёт эффектив­ности разделения в плоскост­ной хроматографии

Для того чтобы оценить эффектив­ность разделения в плоскостной хрома­тографии, измеряют расстояние от стар­товой линии до нижнего края пятна дан­ного вещества (x') и расстояние от ниж­ней до верхней границы этого пятна (w) - рис. 24.4. Число теоретических тарелок (N) и высоту эквивалентную теоретиче­ской тарелке (H) рассчитывают по фор­мулам:

	L
	H = —
	N

Коэффициент разделения (а) и раз­решение (R_S) в плоскостной хроматогра­фии рассчитывают следующим образом:

24.2.3. Практическое применение

Плоскостная хроматография используется, главным образом, для обнаружения и идентификации веществ.

г> ч. У о о		о • V /

окраска зоны вещества либо появление окраски при взаимодействии с реагентом-проявителем

использование других методов анализа /

4 2 PPM

о

положение зоны вещества (величина Rf)

⁴ Щ

ОБНАРУЖЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВЕЩЕСТВ

использование стандартных веществ

lgC

С целью количественного определения веществ тонкослойную и бумажную хроматографию применяют значительно реже.

24.3. Колоночная жидкостная хроматография

В колоночной жидкостной хроматографии сорбент находится в стеклянной или металлической трубке (колонке).

В классическом варианте колоночной хроматографии исполь­зуются сорбенты с диаметром частиц более 100 мкм. Колонка может иметь длину до нескольких метров. Элюент продвигается по колонке под действием силы тяжести.

В высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) используются сорбенты, обладающие особыми свойствами (однород­ность частиц, ненабухаемость и т.д.). Диаметр частиц этих сорбентов не превышает 50 мкм. Часто в ВЭЖХ применяют сорбенты с различ­ными привитыми группами (см. рис. 24.1). Скорость движения под­вижной фазы и эффективность разделения в ВЭЖХ значительно вы­ше, чем в классическом варианте хроматографии.

24.3.1. Устройство жидкостного хроматографа

Основные узлы жидкостного хроматографа показаны на рис.

24.5.

ввод пробы Рис. 24.5. Принципиальная схема жидкостного хроматографа

Подвижная фаза подаётся в колонку с помощью насоса. Блок подачи элюента может включать в себя также систему дегазации, уст­ройство для градиентного элюирования, измерители давления. До по­падания в насос подвижная фаза должна быть профильтрована и освобождена от растворённых в ней газов ("дегазирована"), так как пузырьки газа при попадании в колонку приводят к снижению её эф­фективности, а при попадании в детектор вызывают беспорядочные колебания нулевой линии.

Ввод пробы в жидкостный хроматограф может проводиться с помощью петлевого дозатора, микрошприца (роль шприца может вы­полнять сам насос) и др.

Хроматографические колонки в ВЭЖХ, в отличие от газохрома- тографических колонок, прямые. Они имеют длину 10 - 30 см и внут­ренний диаметр 4 - 6 мм, а в микроколоночных хроматографах, соот­ветственно, 5 - 7 см и 1-2 мм. Корпус колонки представляет собой ци­линдрическую трубку, изготовленную из стекла, нержавеющей стали или полимерного материала. На верхнем и нижнем концах колонки расположены фильтры, представляющие собой диски из пористой не­ржавеющей стали. Назначение фильтров - удерживание сорбента в колонке и задержка механических примесей, которые могут находить­ся в подвижной фазе.

В табл. 24.3 перечислены детекторы, наиболее часто используе­мые в ВЭЖХ.

Табл. 24.3

Характеристика некоторых детекторов, используемых в жидкостных хроматографах

Детектор	Измеряемый сигнал	Определяемые вещества
дифференциальный рефрактометр	разность показателей прелом­ления элюата и элюента	универсальный
УФ-детектор с фик­сированной длиной волны (254 нм)	разность между поглощением элюата и элюента при 254 нм	вещества, поглощающие электромагнитное излу­чение с длиной волны 254 нм
спектрофотометри- ческий	разность между поглощением элюата и элюента при вы­бранной длине волны	вещества, поглощающие излучение с выбранной длиной волны
флуоресцентный	интенсивность испускаемого света	вещества, обладающие флуоресценцией
кондуктометриче- ский	низкочастотная электропро­водность элюата	ионы
потенциометриче- ский	разность потенциалов ионо- селективного электрода и электрода сравнения	ионы
вольтамперометри- ческий	сила тока при постоянном по­тенциале электродов	вещества, способные к электрохимическому окислению или восста­новлению

24.3.2. Практическое применение

Высокоэффективная жидкостная хроматография используется для разделения, в том числе и препаративного выделения, обнаруже­ния и идентификации, а также количественного определения веществ различной химической природы (как полярных, так и неполярных, как ионов, так и молекул, как низкомолекулярных, так и высокомолеку­лярных).

В фармацевтическом анализе метод ВЭЖХ используется чаще, чем метод газовой хроматографии, поскольку многие лекарственные вещества представляют собой сложные органические соединения, имеющие высокие температуры кипения или разрушающиеся при на­гревании. Основные области применения ВЭЖХ в фармацевтическом анализе:

• идентификация лекарственных веществ, присутствующих в лекарственных формах;

• определение примесей в лекарственных веществах (как в ин­дивидуальных образцах, так и в лекарственных формах);

• количественное определение лекарственных веществ, вхо­дящих в состав лекарственных форм (особенно в случае лекарст­венных форм сложного состава или при малом содержании опреде­ляемого компонента);

• определение лекарственных веществ в биологических объек­тах.

24.4. Характеристика отдельных видов жидкостной хроматографии

Хроматографическое разделение в жидкостной хроматографии может быть обусловлено различными процессами: адсорбцией, рас­пределением веществ между двумя несмешивающимися жидкими фа­зами, ионным обменом, распределением молекул в соответствии с их размерами и т.д

24.4.1. Ионообменная хроматография

В основе ионообменной хроматографии лежит процесс обмена ионов, связанных с неподвижной фазой, на ионы элюента, попадаю­щие в колонку.

Дата добавления: 2015-09-07