Студопедия
Случайная страница | ТОМ-1 | ТОМ-2 | ТОМ-3
АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатика
ИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханика
ОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторика
СоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансы
ХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника

Определение уровня IgМ, IgA и IgG в сыворотке человека методом радиальной иммунодиффузии

Читайте также:
  1. I. Определение состава общего имущества
  2. I. Преображение Человека – социальный заказ общества
  3. I. Тела человека
  4. I.3.1. Определение номенклатуры и продолжительности выполнения видов (комплексов) работ
  5. II. Определение зависимости периода собственных колебаний пружинного маятника от массы груза
  6. II. Подъем исторического уровня
  7. II. Подъем исторического уровня.

1. Готовят 1,25-1,5% раствор агар-агара (или синтетической агарозы) в 0,1 М веронал-мединаловом буфере с рН 8,6 (на 1 л воды берут 0,8 г веронала и 4,5 г мединала). Навеску агара (агарозы) заливают буфером и нагревают на водяной бане при 56 °С до полного растворения полимера.

2. В раствор агара добавляют рассчитанное количество (расчет производят, исходя из данных, приведенных в листовке-вкладыше к коммерческим реагентам) антиизотипической антисыворотки,

быстро и тщательно перемешивают. Каждый вариант антиизотипической антисыворотки добавляют в отдельную пробирку с раствором агара (агарозы).

3. Раствор смеси агара (агарозы) с антиизотипической сывороткой быстро выливают на подготовленные обезжиренные стеклянные пластины и кладут их на горизонтальный предметный столик для ровного затвердевания агара/агарозы в гель. Гель прозрачен и бесцветен. На стандартное предметное стекло для микроскопических препаратов (площадью 1875 мм2) требуется примерно 3,2 мл смеси раствора агара с антисывороткой.

 

4. В геле, подложив под стекло с гелем трафарет, специальной трубочкой-пробойником диаметром 2-3 мм делают два (или больше, что зависит от размеров стекол и количества испытуемых биопроб) ряда лунок. Расстояния между центрами лунок - порядка 1,5 см.

5. Заранее рассчитывают и подготавливают растворы калибровочных иммуноглобулинов (иногда называемые стандартами) в трех известных концентрациях.

6. В три лунки (диаметром 2 мм) заливают автоматической пипеткой (дозатором) по 5 мкл калибровочных растворов иммуноглобулинов, в остальные лунки - также по 5 мкл - заливают испытуемые сыворотки.

7. Стекла помещают во влажную, плотно закрываемую посуду и выдерживают в холодильнике при +4 °С 24-48 ч. За это время происходит спонтанная диффузия белков из лунок в гель и образование преципитатов между иммуноглобулинами, содержащимися в испытуемых сыворотках, и антиглобулиновыми антиизотипическими антителами, содержащимися в агаровом геле. Поскольку диффузия свободно идет во всех направлениях, преципитаты имеют форму правильных колец. Преципитаты видны невооруженным глазом, и диаметры колец измеряют в миллиметрах.

8. Для снижения фона образования неспецифических преципитатов пластины можно отмывать раствором с высокой ионной силой - 5% NaCl: в течение 48-72 ч промывочный раствор меняют несколько раз.

9. Если задачи работы требуют долгосрочного хранения препаратов, то гель на стеклах с преципитатами фиксируют и красят анилиновыми красителями, прокрашивающими белки, например кумасси-голубым (на 1 г сухого красителя - 50 мл ледяной уксусной кислоты и 150 мл воды).

Окрашенные препараты с кольцами преципитатов промывают и высушивают.

Внешний вид стекол с результатами РИД и калибровочная кривая показаны на рис. 4.2 (см. также цв. вклейку).

 

Рис. 4.2. Внешний вид стекол с результатами РИД и калибровочная кривая


Дата добавления: 2015-08-13; просмотров: 65 | Нарушение авторских прав


Читайте в этой же книге: Комплементзависимая цитотоксичность | Определение фагоцитарной активности нейтрофилов и макрофагов | Метод оценки хемотаксиса нейтрофилов с использованием камеры Бойдена | Особенности постановки методов оценки хемотаксиса in vitro | Определение выработки активных форм кислорода и оксида азота | Описание метода люминолзависимой хемилюминесценции | Определение содержания NO в супернатантах культуры фагоцитов in vitro | Определение активности миелопероксидазы в лейкоцитах периферической крови | Метод колониеобразования кроветворных клеток в селезенке облученных мышей | Встречная иммунодиффузия по Оухтерлони и Элеку |
<== предыдущая страница | следующая страница ==>
Радиальная иммунодиффузия по Манчини| Иммуноэлектрофорез

mybiblioteka.su - 2015-2024 год. (0.005 сек.)