Студопедия
Случайная страница | ТОМ-1 | ТОМ-2 | ТОМ-3
АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатика
ИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханика
ОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторика
СоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансы
ХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника

Амплификация фрагментов генома H.pylori.

Читайте также:
  1. А. Междисциплинарность или перетасовывание фрагментов?
  2. Амплификации фрагментов генома энтеробактерий
  3. Сознание —замечательная вещь. Его можно поделить на тысячу фрагментов. На миллион. На миллион миллионов.
  4. Сравнительный анализ результатов детекции H.pylori. полученных традиционными и молекулярно-биологическими методами.
  5. Увидеть в мифическом Змее мёбиусную бесконечность, волну, фрактальность Вселенной и генома деревенский знахарь или пастух не может.

Выявление H.pylori с использованием ПЦР тест-системы «Helicobacter» фирмы «Ниармедик» (Москва).

После адаптации тест системы (см. главу Формирование материальной базы для проведения исследований исследование проводили по следующей схеме:

1. Готовили в микропробирке объемом 1,5 мл (тип «Эппендорф») реакционную смесь, для этого смешивали в расчете на 1 исследование:

2,5 мкл 10-кратного буферного раствора;

1,5 мкл раствора БСА с концентрацией 17 мг/мл;

2 мкл смеси dNTP

4 мкл раствора праймеров - по 2мкл каждого,

3 мкл деионизованной воды.

2. Разносили реакционную смесь в 0,5 мл микропробирки по 16 мкл, согласно количеству исследуемых образцов и контролей.

3. Наслаивали на поверхность каждой реакционной смеси по 30 мкл стерильного вазелинового масла.

4. Вносили под масло по 7 мкл проб и контролей согласно маркировке.

5. Помещали смеси в амплификатор, денатурировали нагреванием при 95° С в течение 4 мин.

6. На стадии паузы добавляли в каждую пробирку по 2 мкл разведенной непосредственно перед употреблением бидистиллированной водой Tag- полимеразы (2 единицы активности).

7. Проводили амплификацию по следующей программе:

денатурация ДНК 94°С 1 мин.  
отжиг праймеров 66°С 1 мин. 35 циклов
синтез фрагмента 72°С 2,5 мин.  

 

Выявление Н.ру1оп с использованием ПЦР тест-системы «АмплиСенс- НеИсоЬа^ег ру1оп-520» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

ПЦР-детекция Н.ру1оп с использованием ПЦР тест-системы «АмплиСенс-НеПсоЬайег ру1оп-520» ФГУН ЦР1ИИЭ Роспотребнадзора проводилась согласно инструкций производителя.

Выявление Н.ру1оп с использованием ПЦР тест-системы «Хеликопол II» фирмы Литех г. Москва.

ПЦР детекция Н.ру1оп с использованием ПЦР тест-системы «Хеликопол II» фирмы Литех г. Москва проводилась в соответствии с инструкциями производителя.

Амплификация гена CagA Н.ру1оп с помощью тест-системы «ДиаГен- НеИсоЬаМег» фирмы «Диагенис» г. Москва.

ПЦР детекция гена CagA Н.ру1оп с помощью тест-системы «ДиаГен- НеНсоЬас1ег» фирмы «Диагенис» г. Москва проводилась согласно инструкций производителя.

Амплификация гена УасА Н.ру1оН с использование набора «Хеликопол УА» фирмы Литехг. Москва.

После адаптации тест системы (см. главу Формирование материальной базы для проведения исследований исследование проводили по следующей схеме:

1. Готовили реакционную смесь для амплификации из расчета на 1 пробу: буфер — Змкл, аЫТР - 3 мкл,

праймеры (з1/з2, ш1, ш2) — 2 мкл, Тац-полимеразы - 0,2 мкл, дистилированной воды — 16,8 мкл.

2. После добавления Тац-полимеразы, которое производится в последнюю очередь тщательно перемешивали смесь пипетированием.

3. Добавляли по 25 мкл смеси во все пробирки, подготовленные для амплификации, наносили по 25-30 мкл минерального масла.

4. Вносили по 5 мкл анализируемых образцов и контролен в соответствующие пробирки под слой масла.

5. Центрифугировали в течение 3-5 сек при 1500-3000 об/мин и переносили пробирки в прогретый до температуры 94° С амплификатор.

6. Проводили амплификацию по следующей программе:

«горячий старт» 94°С 3 мин. 1 цикл
денатурация ДНК 94°С 1 мин. 52°С 1 мин. 72°С 2 мин. 30 циклов
отжиг праймера
синтез фрагмента
завершение синтеза 72°С 5 мин. 1 цикл

 

Амплификация фрагментов геномов возбудителей вирусных гепатитов. Использование ПЦР тест систем производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора для выявления вирусов гепатитов В, С, D, G, TTV и определения генотипов la, lb, 2, За ВГС.

Для ПЦР-детекции вирусов гепатитов В, С, D, G, TTV и определения генотипов la, lb, 2, За ВГС применялись тест-системы серии «АмплиСенс». Исследование проводили согласно инструкций разработчика. Амплификация фрагментов геномов возбудителей НУГИ. Использование ПЦР тест систем производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора для выявления U.urealyticum, М.hominis, С.trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II, папилломавирусов генотипов 16, 18,31,33,35,45

Применялись тест-системы серии «АмплиСенс». Исследование проводили согласно инструкций разработчиков.

Выявление продуктов амплификации методом электрофореза

Электрофоретическое разделение продуктов амплификации осуществлялось в соответствии с руководством. Маниатис с соавт [46]. Электрофорез проводили при напряжении 120В в течение 25 мин.


2.2. Результаты собственных исследований 2.2.1.Формирование материальной базы для проведения исследований

На момент начала наших исследований практическая ПЦР диагностика в Российской Федерации находилась на стадии становления, достаточного опыта работ не имелось, поэтому на исходном этапе значительное внимание было уделено решению ряда методических проблем - выбору приборной базы, методов подготовки клинического материала к исследованию, подбору и адаптации ПЦР тест-систем.


Дата добавления: 2015-07-20; просмотров: 109 | Нарушение авторских прав


Читайте в этой же книге: Сложности, возникающие при использовании ПНР в практической диагностике. | Диагностика хеликобактерной инфекции | Разработка ПЦР тест-системы для экспресс-детекции шигелл и энтероинвазивных эшерихий | Адаптация ПЦР тест-системы для выявления генов токсина и адгезинов V.holerae. | Выбор и адаптация ПЦР тест систем для выявления возбудителей вирусных гепатитов и НУГИ. | Изучение распространенности генов факторов патогенности бактериальных возбудителей ОКИ с использованием молекулярно- биологических методов | Использование ПЦР тест-систем для детекции бактерий родов Shigella и Salmonella в санитарно-эпидемиологической и клинической практике. | Изучение эффективности панели отечественных ПИР тест-систем для выявления наиболее значимых бактериальных возбудителей ОКИ в Нижегородском регионе | Алгоритм использования метода ПНР в диагностике бактериальных ОКИ | Выявление H.pylori в различных типах клинического материала |
<== предыдущая страница | следующая страница ==>
Амплификации фрагментов генома энтеробактерий| Выбор приборов для проведения ПЦР и фиксирования результатов.

mybiblioteka.su - 2015-2024 год. (0.007 сек.)