Методика виділення і очищення фракції бластодерм зародків в’юна

Виділення бластодерм із зародків та їх дисоціацію до ізольованих клітин проводили по методиці, яка опублікована раніше. Ікру без оболонок попередньо відмивали декілька раз безкальцієвим розчином Стейнберга (5 ммоль буфер трис-Cl (рН=7,4), 120 ммоль NaCl, 1,3 ммоль KCl, 2 ммоль MgSO₄´7H₂O), потім поміщали в пробірки для центрифугування, у яких попередньо з допомогою нашаровування створювали градієнт сахарози: нижній шар має концентрацію 0,5 моль, верхній – 1 моль. У градієнті сахарози ікра занурюється на границі між шарами і в такому стані центрифугують 2-3 хв при 6500 g. Такої швидкості достатньо для того, щоб бластодерми відділилися від жовтка. Ізольовані бластодерми переміщуються в верхній шар сахарози, а жовток осаджується на дно пробірки. Ізоляти забирають із сахарози кінчиком піпетки і відмивають безкальцієвим розчином Стейнберга (у співвідношенні 1:10), залишають стояти 5 хв і потім повторюють процедуру 2 рази [18].

Виділення гетерогенної фракції ПМ із клітин зародків в’юна здійснювали при 0–4оС. Клітини, зібрані центрифугуванням при 100 g протягом 2 хв, суспендували в десятикратному об’ємі безкальцієвого розчину Стейнберга. Гомогенізацію проводили за допомогою гомогенізатора Поттера-Ельвенгейма в розчині, котрий містив 10 ммоль трис-Cl (рН=7,4), 5 ммоль MgCl2, 130 ммоль KCl (позначається дальше як ТМК) до руйнування не менше 95% клітин. До ТМК додавали сахарозу до кінцевої концентрації 40% (густина 1,18), після чого суміш центрифугували 20 хв при 10 000 g на центрифузі Jouan MR1812. Надосадову рідину, в якій знаходилася гетерогенна фракція ПМ, відбирали, а осад, котрий містив ядра та інші субклітинні компоненти з густиною вище 1,18 відкидали.

Слід зазначити, що на вихід ПМ суттєвий вплив здійснював спосіб зберігання клітин зародків в’юна і режим їх обробки. Оптимальним є збереження ізольованих клітин не більше 12-14 годин у безкальцієвому розчині Стейнберга в холодильнику. Після їх гомогенізації процес очищення мембран необхідно завершити в один день. Збереження клітин, гомогенату чи продуктів на проміжних етапах очищення суттєво понижує вихід мембран, який визначається по кількості білка. Очищенні ПМ можна зберігати при –20–70^оС декілька місяців [12].

2.3. Визначення Na⁺/K⁺-АТФазної активності зародків в’юна

Перед початком експерименту аліквоти суспензії мембранного препарату переносили в стандартне середовище інкубації наступного складу (ммоль/л): NaCl – 125,0; KCl – 30,0; MgCl2 – 3,0; CaCl2 – 0,01; АТР-Na2 – 3; Трис-HCl – 50,0 (рН 7,4; 21 0С). Питому активність Na⁺/K⁺-АТФази визначали за умов додавання до цього середовища відповідних інгібіторів: 1 мМ NaN3 (інгібітор АТФази мітохондрій, 0,1 мМ тапсигаргіну (інгібітор Ca²⁺, Mg²⁺-АТФази ендоплазматичного ретикулума) та 1 мМ уабаїну (інгібітор Na⁺/K⁺-АТФази плазматичної мембрани). У стандартне середовище інкубації також додавали 1 мМ EGTA для хелатування ендогенних іонів Са²⁺.

Як контроль на кількість ендогенного неорганічного фосфору у мембранах зародків використовували суспензію мембранного препарату у середовищі Гольтфретера. Ферментативну реакцію ініціювали введенням у реакційне середовище аліквоти (10 мкл) суспензії мембранного препарату, а зупиняли додаванням 10% ТХО.

Питому активність АТФазної системи досліджуваних клітин оцінювали за різницею вмісту неорганічного фосфату (Р_н), що утворився в середовищі інкубації різного складу за наявності та відсутності фрагментів мембран з урахуванням поправки на вміст ендогенного Р_і в мембранному препараті й виражали в мкмолях Р_і у перерахунку за год на 1 мг білка. Кількість продукту реакції Р_і визначали за модифікованим методом Фіске-Суббароу. Вміст білка в суспензії мембранного препарату визначали за методом О. Lowry [31].

Питому Na⁺/K⁺–ATФазну активність мембран зародків (у мкмолях Рі/год на 1 мг білка) розраховували за формулою [12]:

A = 6P_н/аМ,

де: Р_н – вміст фосфору в пробі, знайдений по кривій;

а – вміст білка в пробі;

М – молекулярна маса фосфору.

Статистичне опрацювання даних здійснювали з використанням програмного пакета для персональних комп’ютерів Microsoft Excel. Визначали такі основні статистичні показники, як середнє арифметичне значення (М), стандартну похибку (m) та середнє квадратичне відхилення (s).Достовірність змін встановлювали за t-критерієм Стьюдента.

Стимуляцію риб проводили гонадотропіном хоріогонічним виробництва Московського ендокринного заводу. У дослідженнях використовували реактиви вітчизняного виробництва кваліфікації х.ч., а також Трис (SERVA), EGTA (ACROS), оуабаїн (FLUKA), ATФ–Na₂ (ACROS), тапсиргагін (SIGMA), ортованадат, NaN₃ (MERK). Перед використанням всі розчини фільтрували через фільтр діаметром пор 0,22 мкм (SIGMA) [12].

Дата добавления: 2015-07-17