Убивает ли наносеребро микроорганизмы?

Рогаткин Д.А., Смирнова О.Д.

Обретение за короткий период времени многими микроорганизмами устойчивости (резистентности) к антибактериальным препаратам (антибиотикам) дало уже повод некоторым ученым говорить о серьезном кризисе современной антибактериальной терапии. Приобретенная резистентность сегодня считается биологической закономерностью, которая, хотя и в разной степени, но справедлива для всех микроорганизмов. К химиопрепаратам адаптируются не только бактерии, но и все остальные микроорганизмы – грибы, вирусы. Это, в частности, заставляет врачей постоянно искать новые подходы к профилактике и лечению гнойно-воспалительных заболеваний. Например, широкое применение находят сегодня физические методы воздействия: фотодинамическая терапия, NO-терапия, воздействие низкочастотным ультразвуком, потоком плазмы. Для борьбы гнойно-воспалительными заболеваниями постоянно разрабатываются и новые классы антибиотиков.

В поисках новых антибактериальных препаратов давно представляют интерес исследования, посвященные антибактериальной активности серебра (Ag), т.к. развитие резистентности к таким препаратам пока под вопросом. Еще в древнем мире представления об обеззараживающих свойствах серебра получили большое распространение. К примеру, по свидетельству Геродота 2.5 тысячи лет назад персидский царь Кир II Великий (558-529 гг. до н. э.) во времена своих походов использовал для хранения запасов воды сосуды из серебра. Этой же водой промывали раны его воинам. Согласно историческим данным, так они скорее заживали и не гноились. В древнем Египте в лечебных целях серебро использовали и напрямую: египетские воины накладывали его в виде тонких пластин на раны. Да и на Руси издавна существует поверье, что серебряные ложки, монеты и крестики, чернея, «забирают» на себя из окружающего пространства «негативную энергию, шлаки и токсины», хотя с научной точки зрения хорошо известно, что почернение серебра – это обычный результат его соединения с серой с образованием сульфида серебра (Ag₂S). Так что с точки зрения классической химии если серебро что-то и «забирает на себя» из окружающего его пространства (воздуха, воды), то это «что-то» - не более чем обыкновенная сера.

Тем не менее, уже в XVI-XVII веках начинается «научно обоснованное» применение серебра в медицине, в первую очередь раствора азотнокислого серебра – ляписа (AgNO₃). Это произошло после того как врачи Ян-Баптист ван Гельмонт и Франциск де ла Бое Сильвий научились получать его взаимодействием Ag с азотной кислотой. Со второй половины XIX века после открытия немецким гинекологом К. Креде мощного антигонобленорейного эффекта у 1% раствора ляписа серебру стали приписывать различное антимикробное действие. Например, 23 августа 1897 г. немецкий хирург Б. Креде, продолжив исследования своего отца, доложил на ХII Международном съезде врачей в Москве о широких возможностях применения препаратов серебра в гнойной хирургии и о хороших результатах лечения септической инфекции внутривенным их введением. Тогда же Б. Креде совместно с химиками предложил рецепты и первых коммерческих лекарственных форм коллоидных препаратов, содержащих серебро: препаратов колларгол и протаргол, известных под этими названиями и сегодня. Причем до 1928г., до момента открытия А.Флемингом пеницилина, различные растворы солей серебра были, видимо, практически единственными «антибиотиками», применявшимися в медицинской практике. Неоднократно и наш журнал обращался к тематике антибактериальной активности Препаратов серебра (см. журналы «Химия и жизнь» №……).

Фармакологические свойства этих и других препаратов серебра, согласно данным литературы, определяются биологической активностью ионов серебра (Ag⁺), образующихся при диссоциации его соединений в воде или другом полярном растворителе. В протарголе (протеинате серебра[1]), например, диссоциирует в растворе оксид серебра и белковые соединения серебра. Как часто пишут (или переписывают из одного «первоисточника» в другой) «ионы серебра способны блокировать сульфгидрильные группы ферментных систем микроорганизмов», «взаимодействуют с молекулами ДНК», «при реакции с белками образуют альбуминаты» и т.д., что приводит к угнетению роста и размножения микроорганизмов. Еще опытами Л.А.Кульского в 1980-х годах было показано, что в зависимости от исходной концентрации микробы «поглощают» из раствора от 50 до 90% серебра. В свое время в СССР ионы серебра даже пытались применять для обеззараживания питьевой воды, однако впоследствии отказались от этой затеи, т.к. «серебрянная вода» оказалась на практике очень нестандартна и не стабильна по своим параметрам. Более того, при многолетнем (2–4 года) контакте с серебром и его солями, когда они поступают в организм человека малыми дозами, но длительно, может развиться необычное заболевание – аргирия. Более же существенные дозы серебра при приеме внутрь могут вызвать тяжелые острые отравления, сопровождающиеся химическим ожогом слизистой оболочки полости рта, желудка, пищевода, приводить к судорогам, коллапсу, расстройству дыхания. Так что бесконтрольный прием ионов серебра весьма опасен[2].

Серебро – тяжелый металл. Но в электрохимическом ряду напряжений оно стоит правее водорода и не замещает водород (хотя, справедливости ради, надо заметить, что ртуть в этом случае водород-таки замещает!)... Поэтому магическая фраза «серебро взаимодействует с сульфгидрильными группами белков-ферментов бактерий с образованием слабодиссоциирующих меркаптидов» (как то и должно быть для всех металлов левее водорода) требует пояснений. Теоретически такая реакция может быть записана в виде:

R—SH + Ag⁺ → R—S-Ag + H⁺ ,

сульфгидрильная группа меркаптид

однако для ее протекания необходимы некоторые особые условия.

С другой стороны, стремительное развитие нанотехнологий и наноматериалов в современном обществе вызвало острые дискуссии по поводу возможной токсичности разного рода наночастиц. Сегодня приставка «нано», пожалуй, - наиболее популярный научный бренд, обозначающий все что угодно (вещества, технологии и пр.), все, что может быть рассмотрено и проанализировано в масштабах от единиц до сотен нанометров (многие вирусологи, оптики, химики и молекулярные биологи до последнего времени даже и не подозревали, что работают на уровне каких-то «нанотехнологий»!). В газетах и журналах разного уровня имеются многочисленные сообщения о большой токсичности углеродных нанотрубок, наночастиц двуокиси титана, оксида цинка и ряда других наноматериалов. В том числе ряд публикаций содержит сведения о достаточно сильной токсичности и наночастиц серебра.

Особые свойства наночастиц принято связывать с их большой удельной поверхностью и, соответственно, с большой поверхностной энергией. Поэтому априори полагается, что активность металлов в нанофазах возрастает не только количественно, но и качественно. Соответственно, по-новому может встать вопрос и об антибактериальной защите на основе серебра: меньшее количество наносеребра, не опасное для человека, может теоретически, будучи более токсичным, лучше убивать микроорганизмы. Получение нанофазного серебра – не очень сложная технологическая задачка. Самого серебра для сотен литров раствора требуются считанные граммы. Вот и появились десятки, если не сотни рекламных сообщений, фирм и коммерсантов, предлагающих различную «серебряную» воду в качестве «новой» антимикробной панацеи.

К нам в лабораторию медико-физических исследований ГУ МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского, при которой функционирует виварий с лабораторными животными, стали поступать предложения проверить такую воду с наночастицами серебра на предмет ее обеззараживающих свойств на животных. Причем, в силу упавшего уровня образования (к этой проблеме журнал «Химия и жизнь» также уже неоднократно обращался – см. номера …. – и вот вам реальный пример из жизни лабораторий), для такой проверки предлагались самые невероятные методики. Например, предлагалось моделировать на животных хирургические раны, одну группу животных поить и обрабатывать их раны поставляемой фирмой специальной стерильной «серебряной водой», а другую группу животных поить и обрабатывать обычной «грязной» водой чуть ли не из уличных луж. И затем сравнить результаты заживления ран у этих двух групп животных... Очень дорогостоящий и сомнительный по доказательству эксперимент. Нам, почему-то, очень жалко стало наших мышек. Понятно, что любое сравнение в обработке ран стерильной и «грязной» водой будет не в пользу последней вне зависимости, использовалось в стерильной воде серебро или нет…

Между тем, те, кто еще имеет фундаментальное профессиональное образование в области микробиологии, хорошо знают, что существует стандартный и весьма простой микробиологический тест на чувствительность к антибиотикам: высевается культура микроорганизмов в специальной чашке Петри на питательной подложке (кровяной агар, например) и затем на этой культуре проводится простой эксперимент: капается в нее антибиотический раствор или кладется таблетка антибиотика и смотрится дальнейшее развитие культуры в присутствии антибиотика. В качестве примера на рис. 1 показана чашка Петри с кровяным агаром, не засеянным микробной культурой, а на рис. 2 – та же чашка Петри с микробной культурой (кишечная палочка E.coli) и таблетками антибиотиков (оксициллин, ампициллин, цефотаксим, имипенем). Вокруг эффективных таблеток четко видны зоны гибели микроорганизмов. Нужны еще какие-то доказательства? Все просто и наглядно. Эксперимент легко воспроизводим в любой лаборатории мира, поэтому всегда сомнительные таблетки, препараты и технологии можно независимо проверить в России, Европе, Китае, хоть и в Австралии. Где угодно. И сделать независимый вывод. Эффективный препарат окажется эффективным, а фиктивный – ну, сами понимаете…. И не надо мучить никаких животных (кроме несчастных микроорганизмов, конечно).

Ровно это мы и решили проделать несколько раз с растворами наносеребра в нашем институте. Мы уже предвкушали интересную и прорывную научную работу, уникальные графики зависимости процента погибших микроорганизмов от концентрации наночастиц серебра в растворе, обнаруженные принципиальные различия в действии нанофазного серебра на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы и т.д., и т.п. Мы обратились за помощью к нашему ведущему микробиологу, зав. лабораторией микробиологии к.м.н. Русановой Е.В., биологу, к.б.н. Петрицкой Е.Н. (очень хотелось бы упомянуть, что они самым активным образом принимали непосредственное участие в этой работе и были тоже ее и основными идеологами и соисполнителями) и ряду других научных сотрудников МОНИКИ и совместными усилиями взяли, да и поставили этот несложный эксперимент. На свой страх и риск.

Мы взяли несколько штаммов бактерий. Из грамотрицательных бактерий были использованы контрольные штаммы Escherichia coli (26941), а также Klebsiella pneumoniae (АТСС №43062), обладающие капсулой. Из грамположительных был выбран золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus 209 P), как микроорганизм с факторами патогенности выше, чем у других стафилококков. Из грибов использовали клинические штаммы Candida albicans. В качестве основного объекта для исследования использовался коллоидный раствор наночастиц серебра «Серебряный щит» производства московского ООО «Фрактал-М»[3] с концентрацией наночастиц 50 мг/л и 100 мг/л и диаметром частиц порядка 15 + 5 нм. Оговоримся сразу, что определение концентрации, формы и размера наночастиц серебра в коллоидном растворе проводилось на предприятии-изготовителе и, по средней оценке, это соответствует расстоянию между частицами 4,6·10^{-6 м. Следует также подчеркнуть, что концентрация в 100 мг/л коллоидного раствора наночастиц серебра является практически предельно достижимой. Более сильной концентрации раствор коллоидного серебра получить можно, однако он будет уже седиментационно и агрегативно не устойчив: частицы будут слипаться и выпадать в осадок. Если при изготовлении раствора использовать поверхностно активные вещества, которые способны обеспечить более высокие устойчивые концентрации, они могут повлиять на и исказить результаты эксперимента на токсичность. Поэтому мы хотели начать исследования именно с таких предельных концентраций в 50 и 100 мг/л, надеясь на них получить максимальный антимикробный или, как минимум, бактериостатический эффект. А уже затем снижать концентрацию и наблюдать эффект, строить графики и зависимости.}

В качестве объектов сравнения использовались: раствор ионов серебра, полученный с помощью бытового прибора «Георгий» с концентрацией 0.5 мг/л, раствор Протаргола 1%, раствор фурацилина 0,02%, пластинки из цельных кусочков серебра, ну и те самые различные антибиотики (оксициллин, ампициллин, цефотаксим, имипенем и т.п.), которые уже упоминались.

Основное исследование с коллоидным раствором нанофазного серебра и объектами сравнения проводилось в 2 сериях по 3 опыта в каждой. При проведении первой серии опытов использовались суспензии 5ЕД по оптическому стандарту мутности (около 5·10³ КОЕ, что соответствовало концентрации, способной вызывать воспалительную реакцию), полученные из суточной агаровой культуры, эмульгированной в физиологическом растворе. Полученную суспензию равномерно засевали по поверхности чашки Петри с кровяным агаром для культивирования S.aureus, E.coli, K.pneumoniae и со средой Сабуро для C.albicans. Далее засеянные чашки маркировали, разделяя на сектора с номерами. Один сектор оставался в чашке всегда контрольным, другие сектора использовались в качестве экспериментальных, куда прикапывался коллоидный раствор наночастиц серебра. После этого чашки помещали в термостат на 24 часа при 37 градусах Цельсия.

При проведении второй серии опытов использовались суспензии 5ЕД по оптическому стандарту мутности, полученные из суточной агаровой культуры, непосредственно эмульгированной в растворе наночастиц серебра с концентрациями 50 мг/л и 100 мг/л. Затем полученную суспензию высеивали на агар сразу после получения, через 2 часа и через 24 часа инкубации при 37 градусах. После чего чашки также помещали в термостат на 24 часа.

По окончании инкубации ожидали получения эффекта… Однако отмечался уверенный равномерный рост культуры на всех засеянных секторах первой серии опыта и ровный газон во второй серии, без видимых отличий от сектора контроля (см., например, рис. 1б) вне зависимости от выбора культуры S.aureus, E.coli, K.pneumoniae или C.albicans. Таким образом, исследуемые коллоидные растворы наночастиц серебра с концентрациями в 50 и 100 мг/л не оказали в нашем случае никакого бактерицидного влияния на ростовые свойства изученных культур микроорганизмов в границах поставленного опыта. На рис. 3 можно видеть чашку Петри, поделенную на три сектора, где первый и второй сектора – сектора с прикапанным раствором наночастиц серебра с концентрациями в 50 и 100 мг/л соответственно, а 3-й сектор – контрольный. Очевидно, что микроорганизмы никак не прореагировали на нанофазное серебро. Просто они его не заметили. Видимо, у них тоже плохое «образование», и их никто не предупредил, что они должны были начать погибать в присутствии наносеребра.

«Ничего себе!» - подумали мы, и для сравнения на тех же культурах попробовали увидеть антимикробное действие ионов серебра, полученных с помощью бытового прибора «Георгий». Согласно техническому описанию на прибор концентрация ионов серебра при его исправной работе в том режиме, что мы использовали, должна была составлять величину 500 мкг/л, втрое большую, чем известная концентрация, при которой ионы серебра в опытах других авторов давали положительный эффект. Мы поверили описанию на прибор и не проверяли сами концентрацию ионов в обработанной воде. Нечем, на самом деле, нам ее было проверить в лаборатории. Но и дома, ведь, мы не проверяем такие приборы, а просто верим их инструкциям… Проведенное нами исследование было выполнено снова в полном соответствии со всеми стандартами исследования, принятыми в классической клинической микробиологии и очерченными выше. Однако и здесь результата мы не получили… Не получили мы никакого результата и с цельными кусочками серебра[4]. Поэтому и не приводим эти результаты здесь, т.к. нечего нам приводить. Зато (ура!) красивые и ожидаемые результаты были получены с Протарголом, Фурацилином и антибиотиками. На рисунке 2 и 4 это очень хорошо видно. Наконец-то! Не подвели нас стандартные фармакологические препараты…

Хотя в серьезной научной литературе есть убедительные доказательства антимикробного действия именно ионов серебра, с полными и убедительными экспериментальными данными (см. например, N.Simonetti “Electrochemical Ag+ for Preservative Use” // Applied and Environmental Microbiology, No.12, 1992. – pp.3834-3836), полученные нами результаты, особенно по наносеребру и аппарату «Георгий», заставили нас в этом немного усомниться. Да, мы не знаем точно, работал ли в нужном режиме аппарат «Георгий» и был ли он исправен, т.е. были ли вообще ионы серебра в воде в этом эксперименте. Но наночастицы серебра в коллоидном растворе точно были. И в Протарголе ионы серебра точно есть. Это же стандартный и серийно выпускаемый препарат. И он очень хорошо действует. Правда в Протарголе есть еще и щелочной коллоид. Вот в чем загвоздка... На самом деле такие известные лекарственные препараты на основе ионов серебра, как Протаргол, Колларгол или ляпис помимо катионов серебра в растворе содержат еще и анионы каких-то молекул. Для ляписа это, например, анион NO₃^- . А что если и отрицательно заряженные ионы в растворе действуют на микроорганизмы?

Для ответа на этот вопрос, после убедительного подтверждения антибактериальных свойств Протаргола против отсутствия результатов для коллоидного серебра и кусочков серебра, мы поставили дополнительную серию экспериментов. Мы попробовали посмотреть воздействие на рост грамположительных бактерий S.aureus (209 P) и грамотрицательных E.coli (26941) водных растворов замещения AgNO₃ на нитраты других металлов - NaNO₃, Sn(NO₃)₂, Co(NO₃)₂ и Zn(NO₃)₂ в эквимолярных концентрациях 1% раствора ляписа, то есть 0.052 моль/л. Исходные культуры в данном случае высевали также в чашках Петри на кровяном агаре с исходной концентрацией 5_*10⁵ КОЕ. Но чашки делили на 4 сектора. В центр каждого сектора поверх посеянной бактериальной культуры раскапывали один из 4-х указанных растворов в количестве 30 мкл (рис.5). Эксперимент для надежности был повторен 3 раза. В результате ночной культивации культур в течение 18 часов было обнаружено, что в местах прикапывания 0.052 – Молярных растворов нитратов Zn и Sn рост обеих бактериальных культур (S.aureus, E.coli) полностью подавлялся, аналогично действию Протаргола. Для нитратов же Na и Co такого видимого явного эффекта обнаружить не удалось.

Таким образом, в результате очевидно предположить, что, аналогичное 1% раствору AgNO₃ бактерицидное действие оказывают нитраты и ряда других металлов в эквимолярных концентрациях 0.052 М, что свидетельствует в пользу неспецифического и синергетического действия нитрат-анионов в совокупности с катионами металлов, в частности катионами Ag, Zn, Sn на бактериальные клетки. Относительно низкие предельно достижимые концентрации ионов серебра в концентрации 0.0046 М после аппарата «Георгий» и 0.0009 М для коллоидного раствора наночастиц сами по себе не оказывают ощутимого антибактериального действия на культуры Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli и Staphylococcus aureus. Коллоидные растворы использовавшегося нами нанофазного серебра в концентрации до 100 мг/л не обладали никаким антимикробным действием.

В итоге мы пришли к выводу, что если серебро и способно хоть как-нибудь само по себе ингибировать рост микроорганизмов, то в концентрациях много больших, чем просто способно раствориться в воде, выше чем 0,5 мг/л. Кстати, по официальным данным ВОЗ, нижний предел действия серебра находится на концентрации 0,3 мг/л (с неясным, вообще говоря, механизмом ингибирования и устойчивости такой суспензии), что опасно для человека, а пределом безопасности полагают концентрацию ионов серебра в питьевой воде ниже 0,05 мг/л (СанПиН 2.1.4.1074-01 «Вода питьевая»). В любом случае, предел растворимости ионов серебра в нейтральной воде составляет 4∙10^-5 мг/л, - как то и содержится в морской воде. Суспензия наночастиц серебра не способна дать концентрацию ионов серебра выше, даже при общем среднем содержании этого металла в количестве 100 мг/л. Серебро само по себе очень плохо растворяется в воде. Надо понимать, что при электролитической диссоциации для электронейтральности раствора катионы серебра должны быть уравновешены каким-то анионом, скажем, ОН^- группами воды. А это щелочные свойства раствора получаются, если содержание этих групп выше 10^-7 Моль. И щелочь тоже убивает микроорганизмы в общем случае.

При растворении в воде препарат Протаргол, например, образует щелочные отрицательно заряженные золи, обладающие относительной устойчивостью.

Поэтому, мы теперь не очень верим, что только серебро убивает бактерии. И уж точно не будем использовать наносеребро и серебряную посуду для обеззараживания своей воды. А Вы – как хотите…

Благо сейчас столько предлагают в продаже различных вариантов – серебряную, кластерную, «живую» и прочую «заколдованную». Хотите поэкспериментировать на себе?

3. Замена ионов серебра на натрий или магний в 1% AgNO₃ приводит к ослаблению или полному отсутствию антибактериальных свойств, а замена ионов серебра на металлы Zn и Sn приводит к сохранению бактерицидных свойств препарата.

.

Рис. 1. Пример с кровяным агаром в чашке Петри, не засеянным микробной культурой.

.

Рис. 2. Чашка Петри с кишечной палочкой E.coli на кровяном агаре в эксперименте с антибиотиками.

.

Рис. 3. Чашка Петри с культурой K.pneumoniae на кровяном агаре в эксперименте с коллоидным раствором наночастиц серебра. Сектор I – концентрация наночастиц 50 мг/л, сектор II – 100 мг/л, сектор III – контроль.

.

б

а

Рис. 4. Подавление роста микроорганизмов E.coli растворами

Протаргола (а) и Фурацилина (б).

.

Рис. 5. Пример с кровяным агаром и культурой S.aureus в дополнительном эксперименте с растворами замещения. Сектора 1-4 – прокапаны растворы замещения соответственно РЗ№1-РЗ№4.

.

Рис. 6. Дополнительный эксперимент с растворами замещения и культурой E.coli. Сектор 1- РЗ№1, сектор 2 – РЗ№2, сектор 3 РЗ№3, сектор 4 - РЗ№4.

[1] Протаргол представляет собой коллоидный раствор оксида серебра, получаемый из нитрата серебра и защищенный щелочным (натриевым) альбуминатом на основе сывороточного альбумина и желатина. Препарат содержит около 8% серебра, а 90% протаргола составляет его защитный коллоид. При растворении в воде протаргол образует катионы Ag⁺ и щелочные отрицательно заряженные золи, обладающие довольно значительной устойчивостью и содержащие небольшое количество частиц, имеющих микроскопические размеры и являющихся продуктами частичной коагуляции коллоида.

[2] В США, Австралии и ряде других развитых стран мира сегодня никакие коллоидные препараты серебра не считаются официально лекарственными препаратами, а продаются свободно в магазинах в виде биологически активных добавок к пище. В санитарных же нормах России серебру присвоен класс опасности 2, т.е. у нас оно на самом деле классифицировано как высокоопасное вещество. Предельно допустимая концентрация (ПДК) серебра в питьевой воде определена в 50 мкг/л в России (СанПиН 2.1.4.1074-01 «Вода питьевая») и в 100 мкг/л согласно нормам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ). Более того, по последним данным ВОЗ способность гарантированно убивать определенные бактерии наблюдается при концентрациях ионов серебра в растворе только свыше 150 мкг/л, т.е. втрое больше, чем безопасная для человека концентрация (данные Википедии, раздел «Серебра протеинат»).

[3] Справедливости ради надо отметить, что фирма ООО «Фрактал-М», насколько нам известно, не рекламирует «антибактериальные» свойства своего наносеребра и не обращалась к нам по поводу его тестирования, а просто любезно предоставила нам в распоряжение коллоидные растворы наночастиц серебра для экспериментов.

[4] У верующих христиан существует убеждение, что освященный серебряный крест обладает сильным бактерицидным действием. Поэтому в ходе работ нам поступали предложения провести подобный эксперимент в сравнении с обычным куском серебра. Однако, как с точки зрения науки, так и с классической теологической точки зрения, такой эксперимент по определению не может дать никакого положительного результата. Вопрос существование Бога – это вопрос веры, а не научного опыта. Поэтому, согласно и научным, и классическим религиозным представлениям, никакой естественнонаучный эксперимент не может дать положительный ответ на вопрос о существовании Бога. Соответственно, результат указанного эксперимента заведомо известен. Он также заведомо отрицательный. Поэтому мы и не проводили такой эксперимент…

Дата добавления: 2015-11-26