Количественные аналитические методы определения микотоксинов

Количественные аналитические методы определения микотоксинов представлены химическими, радиоиммунологическими и иммуноферментными методами. Химические методы являются в настоящее время наиболее распространенными и состоят из двух стадий: стадии выделения и стадии количественного определения микотоксинов. Стадия выделения включает экстракцию (отделение микотоксина от субстрата) и очистку (отделение микотоксина от соединений с близкими физико-химическими характеристиками). Окончательное разделение микотоксинов проводится с помощью различных хроматографических методов, таких как газовая (ГХ) и газожидкостная (ГЖХ), тонкослойная хроматография (ТСХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и масс-спектрометрия. Количественную оценку содержания микотоксинов проводят путем сравнения интенсивности флуоресценции при ТСХ в ультрафиолетовой области спектра (максимум возбуждения 360-365 нм) со стандартами. Афлатоксины В₁ и В₂ обладают синей флуоресценцией (максимум эмиссии 425 нм), афлатоксины G₁ и G₂ сине-зеленой флуоресценцией (максимум эмиссии 450 нм). Флуоресцентные методы анализа имеют высокую чувствительность и позволяют обнаружить афлатоксины В₁ и G₁ на уровне 1-2 мкг/кг, афлатоксины В₂ и G₂ на уровне 0,5-1 мкг/кг и афлатоксин М₁ на уровне 0,5-1 мкг/кг. Отбор проб производится в соответствии с нормативными документами на данный вид продукции. Анализ необходимо произвести в течение 3 суток с момента отбора при условии хранения проб при температуре, предусмотренной для хранения данного вида продукции. Количество пробы, отбираемой для анализа, составляет не менее 100 г. Все более широкое применение находят радиоиммунохимические и иммуноферментные методы, что связано с их высокой чувствительностью. Эти методы основаны на получении антисывороток к коньюгатам микотоксинов с бычьим сывороточным альбумином. Иммуноферментный анализ (ИФА) – относится к группе иммунохимических методов биохимического исследования. Метод основан на специфическом взаимодействии антитела (Ат) с антигеном (Аг) – специфические компоненты реакции. В разных вариантах постановки метода АГ или АТ, помечается так называемой ферментной меткой. Последняя представляет собой очищенный фермент высокой активности, присоединенный посредством физико-химического взаимодействия к молекуле ат или аг. Фермент используется для визуализации иммунного взаимодействия. На последнем этапе постановки реакции добавляется субстрат, на который воздействует фермент с образованием специфического продукта. Еще одним принципиальным условием постановки метода является отделение, образующегося иммунного комплекса от других составляющих реакционной среды. Это достигается, как правило, адсорбцией одного из специфических компонентов реакции на каком-то носителе (чаще всего на материале из которого изготовлена емкость, в которой ставится реакция). Затем посредством отмывания от мешающих компонентов в реакционной среде остается только искомый иммунный комплекс, с ферментной меткой к которому добавляется субстрат. Теоретически метод основывается на одном из фундаментальных законов химии - законе действия масс. Применительно к данному методу используется частный вывод из закона – количество меченого антигена, связавшегося с антителами, будет обратно пропорционально количеству определяемого антигена. Радиоиммунологический метод диагностирования (РИМ) основан на применении радиоизотопной метки антигенов или антител. Обычно используется твердофазовый вариант РИМ. при котором антигены или антитела (в зависимости от задачи исследования) адсорбируются на твердом носителе, (целлюлоза, полистеролы и др). Сущность метода в том, что определяется количество известного меченого антигена (антитела) до и после его контакта с искомыми антителами (или антигенами).
Если последние соответствуют меченому антигену (антителу) и использованным в опыте антителам (антигену), часть или все активные центры антител (антигенов) будут блокированы этим искомым антигеном (антителом), и добавленный затем меченый антиген (антитело) остаются несвязанными или связанными, лишь частично, что и будет зарегистрировано радиометрически.

Дата добавления: 2015-12-08