Студопедия
Случайная страница | ТОМ-1 | ТОМ-2 | ТОМ-3
АрхитектураБиологияГеографияДругоеИностранные языки
ИнформатикаИсторияКультураЛитератураМатематика
МедицинаМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогика
ПолитикаПравоПрограммированиеПсихологияРелигия
СоциологияСпортСтроительствоФизикаФилософия
ФинансыХимияЭкологияЭкономикаЭлектроника

Выделение РНК

Введение | Глава 1. Обзор литературы | Мышцы. Состав и пластичность | PGC-1 коактиваторы | PGC-1 и окислительный метаболизм | PGC-1 и типы волокон | PGC-1 и физические упражнения | PGC-1 и ангиогенез | PGC-1 и болезнь | Актуальные направления |


Читайте также:
  1. Возможно выделение определенных этапов развития семьи по соответствующим им задачам.
  2. Глава V. ПИТАНИЕ И ПОТОВЫДЕЛЕНИЕ
  3. Зачем природа организовала потовыделение
  4. Значит, нужно потеть в самом прямом смысле этого слова. Ежедневный интенсивный бег 20—30 минут с обильным потовыделением я считаю важнейшей процедурой для здоровья.
  5. Реакции диазосоединений с выделением азота

 

Выделение РНК и ПЦР проводились в лаборатории экологического биомониторинга МГГУ им. М.А.Шолохова.

Работа проводилась в резиновых перчатках во избежание попадания Рназ кожи рук в препараты ДНК.

Стеклянная посуда была прокалена при +1600С в течении 4часов. Пластиковая посуда автоклавировалась в дистиллированной воде.

Клетки для исследования транспортировались в РНК-сохраняющем растворе EverFresh в соотношении 1:3. Перед началом выделения РНК клетки осаждались центрифугированием, супернатант удалялся.

 

Выделение РНК из клеточной культуры набором «YellowSolve»

Реактивы:

1. Лизирующий раствор YellowSolve

2. Хлороформ

3. Депротеинизирующий раствор GгееnСlеап

4. Этиловый спирт 96%

5. Этиловый спирт 80%

Оборудование:

Ход работы:

Суспензию культуры клеток гомогенезировали в 1 мл лизирующего раствора YellowSolve до полного исчезновения комочков клеточного материала. 100мкл суспензии содержали приблизительно10млн клеток.

Лизат центрифугировали 5 минут при 12 тыс. об/мин для удаления возможных примесей внеклеточного материала, полисахаридов и пр. Прозрачный супернатант переносили в чистую пробирку.

К супернатанту добавляли 0.1 мл хлороформа, после чего энергично перемешивали смесь на вортексе и оставляли на столе на 20 минут, встряхивая пробирку примерно каждые 5 минут. При стоянии содержимое пробирки расслаивалось на две фазы. По истечении 20 минут центрифугировали пробирку 5 минут при 12 тыс. об/мин. Образовывалось 2 слоя жидкости. Верхний слой переносили в чистую пробирку, т.к. в нем содержалась РНК. К отобранному верхнему слою добавляли равный объем депротеинизирующего фенолсодержащего раствора GгееnСlеапи энергично встряхивали смесь на вортексе 2-3 минуты, после чего центрифугировали 5 минут при 12 тыс. об/мин.

После центрифугирования снова переносили верхний слой жидкости, содержащей РНК в чистую пробирку, замеряя её объем. Добавляли двойной объем 96%-ного этанола и хорошо перемешивали содержимое пробирки. После чего пробирка помещалась в штатив на 20-30 минут при температуре -200С для формирования осадка РНК. РНК осаждалась центрифугированием при 12 тыс. об./мин. в течение 10-20 мин, после чего отбирался спиртовой супернатант и осторожно, по стенке пробирки, к осадку РНК добавляли 0,5мл 80%-ного этанола. Снова РНК осаждалась центрифугированием при 12 тыс. об./мин. в течение 10-20 мин. Спиртовой супернатант максимально удалялся из пробирки

Все дальнейшие процедуры проводились при температуре +40С. Растворяли осадок РНК в воде, затем отбирали аликвоту и определяли концентрацию РНК спектрофотометрически. Оценивали нативность РНК электрофорезом в 1.2-1.5%-ной агарозе, приготовленной на х1-ном ТВЕ и содержащей 0.3 мкг/мл бромистого этидия.

Препарат РНК можно хранить замороженным в воде при температуре –200С или ниже. Предпочтительно хранение в виде спиртового осадка при температуре –200С

 


Дата добавления: 2015-09-01; просмотров: 42 | Нарушение авторских прав


<== предыдущая страница | следующая страница ==>
Культивирование клеток| Проведение процедуры обратной транскрипции

mybiblioteka.su - 2015-2024 год. (0.006 сек.)