Студопедия
Случайная страница | ТОМ-1 | ТОМ-2 | ТОМ-3
АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатика
ИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханика
ОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторика
СоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансы
ХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника

Задание 5. Количественное определение концентрации белка биуретовым методом

Читайте также:
  1. I.2 Определение понятия фразеологизма
  2. III. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОИЗВОДСТВА
  3. А) Определение расчетных усилий в ветвях колонны
  4. А) Определение требуемой площади поперечного сечения колонны.
  5. А. Задание.
  6. А. Определение ценной бумаги
  7. Автокорреляционный прием сигналов ОФМ. Прием методом сравнения фаз

Принцип метода: Метод основан на образовании в щелочной среде окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей белков с ионами двухвалентной меди. Существуют 2 разновидности метода: при одной из них определяют от 2 до 10 мг белка в пробе; при другой (микрометод) - от 0,1 до 2 мг. Для протекания этой реакции необходимо наличие, по крайней мере, двух пептидных связей:

Комплексное соединение, образующееся в результате взаимодействия белков с биуретовым реактивом

Колориметрический анализ проводят сравнением поглощения света исследуемым раствором с поглощением проб стандартного ряда (калибровочная кривая). В качестве стандарта часто используют раствор бычьего сывороточного альбумина в воде или буферном растворе.

Ход работы:

1. Производят разбавление стандартного белкового раствора с концентрацией 2 мг/мл следующим образом:

№ пробы Объем раствора белка, мл Объем дист. воды, мл Концентрация белка, мг/мл Содержание белка в пробе, мг Ед. погло-щения (OD)
  3,0  
  0,3 2,7 0,2 0,6  
  0,6 2,4 0,4 1,2  
  0,9 2,1 0,6 1,8  
  1,5 1,5 1,0 3,0  
  2,0 1,0 1,32 4,0  
  3,0 2,0 6,0  
8(задача) 3,0 ? ?  

Проба №1 содержит вместо белка воду и называется контрольной. Объем всех исследуемых проб должен быть одинаковым и в данном случае составляет 3 мл.

2. Во все пробы добавляют по 2 мл биуретового реактива, тщательно перемешивают и выдерживают 30 мин при комнатной температуре.

3. После этого пробы фотометрируют на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм (500-560 нм, зеленый светофильтр) против фотометрического контроля, которым является проба №1. Показания прибора (оптическая плотность, OD, А) заносят в таблицу и затем строят калибровочную кривую, откладывая по оси ординат значения оптической плотности, а по оси абсцисс - концентрацию (или содержание) белка. Калибровочный график должен иметь вид прямой, выходящей из начала координат.

4. Параллельно с пробами для калибровочной кривой ставятся и опытные пробы *. Объем исследуемого белка (опытной пробы) – 3 мл.

* Необходимо помнить, что интенсивность окраски определяется концентрацией вещества, но зависит также от температуры и времени развития окраски. Поэтому опытные и стандартные пробы должны быть обработаны в строго определенных одинаковых условиях.

Расчеты концентрации белка в опытных пробах проводят, пользуясь калибровочным графиком. Если оптическая плотность пробы выходит за его пределы, необходимо заново приготовить образец белка таким образом, чтобы попасть на калибровочную кривую.


Дата добавления: 2015-09-07; просмотров: 180 | Нарушение авторских прав


<== предыдущая страница | следующая страница ==>
Задание 2. Необратимые реакции осаждения белков| Задание 6. Количественное определение концентрации белка по методу Лоури

mybiblioteka.su - 2015-2024 год. (0.006 сек.)