13. Физико-химические свойства белков: молекулярная масса, кислотно-основные свойства белков. Заряд белковой молекулы, изоэлектрическая точка. Буферные свойства белков.Устойчивость белков в

13. Физико-химические свойства белков: молекулярная масса, кислотно-основные свойства белков. Заряд белковой молекулы, изоэлектрическая точка. Буферные свойства белков.
Устойчивость белков в биологических жидкостях организма человека обусловливают два фактора: заряд и водная оболочка – для гидрофильных белков и только заряд – для гидрофобных белков. Для каждого белка характерна по крайней мере одна трехмерная структура, в которой он стабилен и проявляет биологическую активность при физиологических условиях (рН, температура). Эта структура называется нативной конформацией белка.
Для белков характерны следующие основные физико-химические свойства: высокая вязкость растворов, незначительная диффузия, способность к набуханию в больших пределах, оптическая активность, подвижность в электрическом поле, низкое осмотическое давление и высокое онкотическое давление, способность к поглощению лучей при 280 нанометрах (10–9 м). Онкотическое давление крови обусловлено присутствием белков и равно 0,02…0,04 атм, т.е. 30 мм рт.ст.
Онкотическое давление определяет распределение воды и минеральных веществ между кровью и тканями.
Белки как и аминокислоты амфотерны. Благодаря наличию свободных амино- и карбоксильных групп. В зависимости от содержания функциональных групп они имеют различных заряд в растворах, перемещаясь к катоду или аноду. На этом основана их очистка методом электрофореза.
Молекулы белков не в состоянии проходить через полупроницаемые искусственные мембраны (пергамент, коллодий, целлофан), а также через биомембраны.
Белки относят к высокомолекулярным соединениям, их молекулярная масса колеблется от 6000 (нижний предел) до 1 000 000 и выше.
При изменении внешних условий белки теряют нативную структуру.
Денатурация – изменение уникальной структуры белковой молекулы, приводящее к потере характерных свойств (растворимости, электрофоретической подвижности, биологической активности и т.д.) Наиболее ярким признаком денатурации является резкое снижение биологической активности, при этом разрушаются в основном невалентные водородные и дисульфидные связи и не затрагиваются пептидные связи. При непродолжительном действии возможен возврат биологической активности, т.е. ренатурация белка с полным восстановлением исходной структуры и нативных свойств.

Область рН, в которой белки являются электронейтральными, называется изоэлектрической точкой. Изоэлектрическая точка большинства белков лежит в пределах 5,5…7,0. В изоэлектрической точке белки наименее устойчивы и легко выпадают в осадок, обладая наименьшей растворимостью. Устойчивость белковой молекулы определяется наличием зарядов в полипептидной цепи, а также образованием гидратной оболочки. Отсутствие заряда и снятие гидратной оболочки приводит к сближению белковых молекул, в результате чего они слипаются, увеличиваются в размерах и выпадают в осадок под действием собственной силы тяжести. Это явление называется коагуляцией.
Коагуляция является обратимой, если после снятия действия реагента белок возвращается в исходное состояние. Если же изменения необратимы, то и коагуляция называется необратимой. Примерами обратимой коагуляции является высаливание, т.е. осаждение белков растворами нейтральных солей (хлорида натрия, сульфата аммония). Такие соли нейтрализуют электрический заряд белка, разрушают его гидратную оболочку, и белок выпадает в осадок. При добавлению к такому белку воды он снова переходит в растворенное состояние. Процесс, обратный коагуляции, называется пептизацией.
Необратимую коагуляцию (денатурацию) вызывает температура, соли тяжелых металлов, концентрированные неорганические кислоты. При растворении белков в воде образуются коллоидные растворы, которые обладают низким осмотическим давлением: они непрозрачны, способны рассеивать свет (эффект Тиндаля), опалесцировать (в проходящем свете – розовые, в отраженном – голубые).
Для белков характерен ряд цветных реакций: биуретовая, ксантопротеиновая, Сакагучи и т.п.

14. Растворимость, коллоидные свойства, денатурация и оптические свойства белков.
Белки - природные высокомолекулярные органические соединения, построенные из остатков 20 аминокислот, которые соединены пептидными связями в полипептидные цепи. В процессах жизнедеятельности всех организмов белки выполняют структурную, регуляторную, каталитическую, защитную, транспортную, энергетическую и другие функции. Белки - основа кожи, шерсти, шелка и других натуральных материалов, важнейшие компоненты пищи человека и корма животных. Названию белки, наиболее принятому в отечественной литературе, соответствует термин протеины (от греч. proteios — первый).
Растворимость белков в воде зависит от всех перечисленных выше свойств белков: формы, молекулярной массы, величины заряда, соотношения полярных и неполярных функциональных групп на поверхности белка. Кроме этого, растворимость белка определяется составом растворителя, т.е. наличием в растворе других растворённых веществ. Например, некоторые белки легче растворяются в слабом солевом растворе, чем в дистиллированной воде. С другой стороны, увеличение концентрации нейтральных солей может способствовать вьшадению определённых белков в осадок. Денатурирующие агенты, присутствующие в растворе, также снижают растворимость белков.
Свойства белковых растворов определяются большими размерами молекул, т.е. белки являются коллоидными частицами и образуют коллоидные растворы.
К свойствам белковых растворов относятся:1. Рассеивание света вследствие дифракции на коллоидных частицах – опалесценция. Особенно это заметно при прохождении луча света через белковый раствор, когда виден светящийся конус (эффект Тиндаля).2. Белковые растворы в отличие от истинных обладают малой скоростью диффузии.3. Неспособность белковых частиц проникать через мембраны, поры которых меньше диаметра белков (полунепроницаемые мембраны). Это используется в диализе. Очистка белковых препаратов от посторонних примесей лежит в основе работы "искусственной почки" при лечении острой почечной недостаточности.4. Создание онкотического давления, то есть перемещение воды в сторону более высокой концентрации белка, что проявляется, например, как формирование отеков при повышении проницаемости сосудистой стенки.5. Высокая вязкость в результате сил сцепления между крупными молекулами, что проявляется, например, при образовании гелей и студней
Денатурация белков (от лат. de- — приставка, означающая отделение, удаление и лат. nature — природа; не путать с лат. denaturatus — лишенный природных свойств) — термин биологической химии, означающий потерю белками их естественных свойств (растворимости, гидрофильности и др.) вследствие нарушения пространственной структуры их молекул.Процесс денатурации отдельной белковой молекулы, приводящий к распаду её «жёсткой» трёхмерной структуры, иногда называют плавлением молекулы. Механизмы денатурацииПрактически любое заметное изменение внешних условий, например, нагревание или обработка белка кислотой приводит к последовательному нарушению четвертичной, третичной и вторичной структур белка. Обычно денатурация вызывается повышением температуры, действием сильных кислот и щелочей, солей тяжелых металлов, некоторых растворителей (спирт), радиации и др.Денатурация часто приводит к тому, что в коллоидном растворе белковых молекул происходит процесс агрегации частиц белка в более крупные. Визуально это выглядит, например, как образование «белка» при жарке яиц.
РенатурацияРенатурация (высаливание) — процесс, обратный денатурации, при котором белки возвращают свою природную структуру. Нужно отметить, что не все белки способны ренатурировать; у большинства белков денатурация необратима.

15. Методы выделения и очистки белков. Получение индивидуальных белков из биологического материала (тканей, органов, клеточных культур) требует проведения последовательных операций, включающих:

дробление биологического материала и разрушение клеточных мембран;

фракционирование органелл, содержащих те или иные белки;

экстракцию белков (перевод их в растворённое состояние);

разделение смеси белков на индивидуальные белки.

1. Методы разрушения тканей

и экстракции белков

Для разрушения биологического материала используют методы: гомогенизации ткани, метод попеременного замораживания и оттаивания, а также обработку клеток ультразвуком.

Гомогенизация биологического материала

Ткань, находящуюся в буферном растворе с определённым значением рН и концентрацией солей, помещают в стеклянный сосуд (гомогенизатор) с пестиком. Вращающийся пестик измельчает и растирает ткань о притёртые стенки сосуда.

Метод замораживания и оттаивания ткани

В результате попеременного замораживания и оттаивания образующиеся кристаллы льда разрушают оболочки клеток.

После разрушения ткани нерастворимые части осаждают центрифугированием. Последующее центрифугирование гомогената с разной скоростью позволяет получить отдельные фракции, содержащие клеточные ядра, митохондрии и другие органеллы, а также надосадочную жидкость, в которой находятся растворимые белки цитозоля клетки. Искомый белок будет содержаться в одной из этих фракций.

Экстракция белков, связанных с мембранами, и разрушение олигомерных белков на протомеры

Если искомый белок прочно связан с какими-либо структурами клетки, его необходимо перевести в раствор. Так, для разрушения гидрофобных взаимодействий между белками и липидами мембран в раствор добавляют детергенты; чаще всего используют тритон Х-100 или додецилсульфат натрия.

Механизм действия детергентов описан в разделе "Денатурация белков". При действии детергентов обычно разрушаются и гидрофобные взаимодействия между протомерами в олигомерных белках.

Удаление из раствора небелковых веществ

Нуклеиновые кислоты, липиды и другие небелковые вещества можно удалить из раствора, используя их Особенные физико-химические свойства. Так, липиды легко удаляются из раствора добавлением органических растворителей, например ацетона. Однако воздействие должно быть кратковременным, так как ацетон вызывает денатурацию некоторых белков. Нуклеиновые кислоты осаждают добавлением в раствор стрептомицина.

2. Методы очистки белков

Наиболее трудоёмкий этап получения индивидуальных белков - их очистка от других белков, находящихся в растворе, полученном из данной ткани. Часто изучаемый белок присутствует в небольших количествах, составляющих доли процента от всех белков раствора.

Так как белки обладают конформационной лабильностью, при работе с белками следует избегать денатурирующих воздействий, поэтому выделение и очистка белков происходят при низких температурах.

На первых стадиях очистки белков целесообразно использовать методы, учитывающие какую-либо характерную особенность данного белка, например термостабильность или устойчивость в кислых растворах. Первыми методами очистки необходимо удалить из раствора основную массу балластных белков, которые значительно отличаются от выделяемого белка физико-химическими свойствами. Впоследствии применяют всё более тонкие методы очистки белка.

Очистка белков избирательной денатурацией

Большинство белков денатурирует и выпадает в осадок уже при кратковременном нагревании раствора до 50-70 °С или подкислении раствора до рН 5. Если выделяемый белок выдерживает эти условия, то с помощью избирательной денатурации можно удалить большую часть посторонних белков, отфильтровав выпавшие в осадок-белки, или осадить их центрифугированием.

Высаливание
Метод очистки белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочно-земельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.
Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония - (NH4)2SO4. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит

Для разделения белков часто используют хроматографические методы, основанные на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства.
Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор".
Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы.

Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул.
Так как гелевая структура сефадекса легко деформируется под давлением, гели стали заменять более жёсткими матрицами (сефактил, той-оперл), представляющими сферические гранулы с разными размерами пор. Выбор размеров пор в гранулах зависит от целей хроматографии.
Ультрацентрифугирование
Метод разделения также основан на различии в молекулярных массах белков. Скорость седиментации веществ в процессе вращения в ультрацентрифуге, где центробежное ускорение достигает 100 000-500 000 g, пропорционально их молекулярной массе. На поверхность буферного раствора, помещённого в кювету, наносят тонкий слой смеси белков. Кювету помещают в ротор ультрацентрифуги. При вращении ротора в течение 10-12 ч более крупные молекулы (с большей молекулярной массой) оседают в буферном растворе с большей скоростью. В результате в кювете происходит расслоение смеси белков на отдельные фракции с разной молекулярной массой. После расслоения белковых фракций дно кюветы прокаливают иглой и по каплям собирают содержимое небольшими порциями в пробирки.
Электрофорез белков
Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-).

Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так, при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, α1 глобулины, α2-глобулины, β-глобулины и γ-глобулины. Электрофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёрным). Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе.

Ионообменная хроматография

Так же как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий.

В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы.

Различают положительно заряженные анионообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например карбоксиметилцеллюлозу (КМ-цел-люлозу), содержащую анионные группы.

Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли, чаще всего NaCI, и разными значениями рН. Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли элюируются белки, слабо связанные с анионообменником. Постепенное увеличение концентрации соли или изменение рН, что меняет заряд белковой молекулы, приводит к выделению белковых фракций, в одной из которых находится искомый белок.
Аффинная хроматография, или хроматография по сродству

Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К ли-ганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом. Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом.
Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.

3. Очистка белков от низкомолекулярных
примесей

Для удаления низкомолекулярных соединений, в частности сульфата аммония после высаливания, применяют диализ. Метод основан на том, что через полупроницаемую мембрану, пропускающую низкомолекулярные вещества, не проходят белки, имеющие более высокую молекулярную массу. В стакан большой ёмкости (около 1 л) с буферным раствором помещают полупроницаемый мешочек, заполненный раствором белка с солью.
Скорость выхода соли из мешочка в буферный раствор пропорциональна градиенту его концентраций по обе стороны от мембраны. По мере выхода соли из мешочка буферный раствор в стакане меняют.

16.Некоторые природные пептиды и белки (окситоцин, вазопрессин, адренокортикотропный гормон, инсулин, гастрин, глюкагон, глютатион и др.), их биологические функции.
ОКСИТОЦИН, пептидный гормон млекопитающих; кристаллич. в-во; хорошо раств. в воде; рI 7,7.
Окситоцин образуется в передних ядрах гипоталамуса, хранится в заднем гипофизе (нейрогипофизе), куда транспортируется с помощью спец. белка-переносчика нейрофизина. Выделение окситоцина стимулируют растяжение матки на поздних сроках беременности, а также раздражение соска при лактации.
В переднем гипоталамусе др. классов позвоночных образуются нонапептиды, обладающие нек-рыми св-вами окситоцина и отличающиеся от него только аминокислотными остатками в положениях 4 и 8.
Осн. физиол. действие окситоцина-стимуляция гладких мышечных волокон молочных желез и матки. Биол. эффект осуществляется посредством взаимод. молекул окситоцина с рецепторами цитоплазматич. мембран органов-мишеней и активации в них фермента аденилатциклазы, катализирующей образование циклич. аденозинмонофосфата (цАМФ), внутриклеточный эффект к-рого опосредован через цАМФ-зависимую протеинкиназу. За связывание окситоцина с рецепторами клеток ответственна кольцевая часть молекулы и прежде всего остаток Ilе. Противодействует влиянию окситоцина на мышцы матки прогестерон, подавляет секрецию окситоцина адреналин.
ВАЗОПРЕССИН (от лат. vas - сосуд и presso - давлю) пептидный гормон гипофиза. Первичная структура вазопрессина у большинства млекопитающих, в т.ч. у человека.
У нек-рых животных Arg заменен на Lys (лизин-вазопрессин). Вазопрессин близок по хим. строению окситоцину. У низших позвоночных (птицы, амфибии и рыбы) в гипофизе обнаружен прир. аналог вазопрессина - вазотоцин (аргинин-вазотоцин), у к-рого в положении 3 находится Не (как у окситоцина) и к-рый обладает биол. активностью как вазопрессина, так и окситоцина. При разрыве цикла и отсутствии Arg или Lys вазопрессин теряет биол. активность.
Вазопрессин усиливает реабсорбцию воды в почечных канальцах, уменьшая мочеотделение и повышая осмотич. концентрацию мочи (антидиуретич. действие). Ключевая стадия в механизме действия вазопрессина - активация фермента аденилатциклазы и образование под ее влиянием циклич. 3',5'-аденозинмонофосфата.
Вазопрессин вырабатывается нейросекреторными клетками супраоптич. ядра гипоталамуса, по аксонам этих клеток достигает задней доли гипофиза, откуда под влиянием соответствующих стимулов поступает в кровь. В аксонах вазопрессин находится в комплексе с белком-носителем нейрофизином. Биосинтез вазопрессина происходит с участием рибосом. Вначале синтезируется высокомол. гликозилированный белок пропрессофизин, являющийся общим предшественником для вазопрессина и нейрофизина. В результате последующего специфич. ограниченного протеолиза пропрессофизина образуется вазопрессин и нейрофизин. Недостаточность вазопрессина в организме обусловливает развитие несахарного диабета (поэтому вазопрессин применяется для его лечения). Препараты вазопрессина выделяют из гипофиза животных либо синтезируют.
АДРЕНОКОРТИКОТРОПИН (кортикотропин, адренокоргикотропный гормон, АКТГ), пептидный гормон гипофиза.
Осн. физиол. ф-ция адренокортикотропина - стимуляция биосинтеза и секреции стероидных гормонов корой надпочечников. Механизм действия включает специфич. связывание адренокортикотропина с рецепторами плазматич. мембраны клеток, стимуляцию в плазматич. мембране фермента аденилатциклазы, осуществляющей превращение АТФ в циклич. аденозинмонофосфат. Последний активирует в цитоплазме протеинкиназу, катализирующую серию р-ций фосфорилирования, в результате чего резко увеличивается скорость образования кортикостероидов, а также синтез специфич. белка, необходимого для стимуляции лимитирующей стадии синтеза стероидов - превращения холестерина в прегненолон. Адренокортикотропин обладает также меланоцитостимулирующей активностью, к-рая обусловлена присутствием в его молекуле 13 аминокислотных остатков N-концевого участка, повторяющих последовательность аминокислот вмеланоцитостимулирующем гормоне. Кроме того, адренокортикотропин активирует липазу жировой ткани и повышает выход своб. жирных к-т из жировых депо в кровь.
Адренокортикотропин вырабатывается специализиров. клетками передней доли гипофиза. Вначале синтезируется высокомол. гликозилированный белок-предшественник - проопиомеланокортин. Специфич. ограниченный протеолиз этого белка приводит к образованию адренокортикотропина. Секреция адренокортикотропина регулируется гипоталамусом, в к-ром вырабатывается пептид кортиколиберин, стимулирующий выделение адренокортикотропина в кровь.

ИНСУЛИН, белковый гормон, вырабатываемый поджелудочной железой и регулирующий уровень сахара (глюкозы) в крови; препараты инсулина применяются для лечения сахарного диабета. Гормон синтезируется в бета-клетках, которые входят в отдельные гормон-секретирующие группы клеток поджелудочной железы, называемые островками Лангерганса. Слово «инсулин» (от лат. insula – остров) указывает на «островковое» происхождение гормона.

Молекула инсулина состоит из двух аминокислотных цепей; А-цепь содержит 21 аминокислоту, В-цепь – 30. Цепи соединены друг с другом двумя дисульфидными мостиками (т.е. каждый образован двумя атомами серы), а третий дисульфидный мостик связывает отдаленные друг от друга аминокислоты А-цепи. Соединенные цепи частично изгибаются и сворачиваются в глобулярную структуру, и такая конфигурация молекулы гормона важна для проявления его биологической активности.

Инсулин – важнейший регулятор промежуточного обмена веществ. Главное его действие заключается в снижении уровня сахара в крови: он облегчает поглощение и использование глюкозы мышечными и жировыми клетками и тормозит образование новых молекул глюкозы в печени. Кроме того, он способствует запасанию глюкозы в клетках в форме гликогена, а также накоплению других веществ – потенциальных источников энергии (жира, белка), тормозят их распад и утилизацию организмом.

АСТРИН (от греч. gaster - желудок), пептидный гормон желудочно-кишечного тракта. Первичная структура гастрина человека:

Обладает сильными кислотными св-вами из-за наличия в молекуле пяти остатков Glu. Гастрин может существовать в десульфированной (без сульфогруппы в положении 12) форме. Полную биол. активность прир. гастрина сохраняет его фрагмент 6-17.

Основная физиол. ф-ция гастрина-стимуляция секреции к-ты в желудке. Гастрин вырабатывается специализиров. клетками, рассеянными по слизистой оболочке почти всего пищеварит. тракта. В наиб. кол-ве эти клетки локализуются в антральном отделе желудка и в двенадцатиперстной кишке. В организме вначале синтезируется высокомол. белок-предшественник-прогастрин, включающий аминокислотную последовательность гастрина-34. В результате специфич. ограниченного протеолиза прогастрина образуется гастрин-34, а из него гастрин-17. Освобождение гастрина происходит под влиянием парасимпатич. нервной системы и разл. компонентов пищи.

ГЛЮКАГОН, пептидный гормон поджелудочной железы и желудочно-кишечного тракта. Глюкагон обладает слабыми основными св-вами (изоэлектрич. точка 7,5-8,5), ограниченно раств. в воде и весьма стоек в водных р-рах при рН 3-9. У всех позвоночных структуры глюкагонов идентичны или близки (кроме глюкагона рыб, к-рые неактивны для млекопитающих).
Осн. ф-ция глюкагона-стимуляция расщепления гликогена в печени, в результате чего происходит повышение концентрации глюкозы в крови. Глюкагон стимулирует также липолиз жировой ткани и выработку инсулина поджелудочной железой и сокращение сердечной мышцы. По своему действию глюкагон-антагонист инсулина. Вырабатывается глюкагон специализиров. клетками поджелудочной железы (т. наз.клетками островков Лангерганса) и слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки. Препараты глюкагона (их получают из поджелудочной железы животных или синтезируют) находят применение при определении гликогена в печени и для компенсации отдельных форм гипогликемии.

ГЛУТАТИОН (Lглутамил-L-цистеинилглицин), бесцв. кристаллы; т. пл. 190°С (с разл.); раств. в воде, не раств. в этаноле и эфире. При кипячении в воде образует пирролидонкарбоновую к-ту и цистеинилглицин, при взаимод. с нитррпруссидом натрия в щелочной среде дает красную окраску. Под действием мягких окислителей (напр., иода) легко окисляется в дисульфид, что используют для количеств. определения глутатиона (окислит.-восстановит. потенциал пары глутатион/дисульфид —0,24 В при рН 7).

Специфич. метод определения глутатиона основан на его способности активировать превращ. метилглиоксаля в молочную к-ту под действием фермента глиоксалазы.

Глутатион найден у животных, растений, микроорганизмов. Его внутриклеточная концентрация составляет 0,5-10 мМ, что существенно выше концентрации своб. цистеина. Биол. ф-ции глутатиона: защищает SH-группы ферментов и др. белков от окисления; восстанавливает Н2О2 и др. пероксиды; связывает своб. радикалы; участвует в тиол-дисульфидном обмене и в обезвреживании мн. чужеродных для организма соед. (см. Глутатионтрансферазы); восстанавливает рибонуклеотиды в дезоксирибонуклеотиды; переносит аминокислоты через мембрану клеток (см.Г лутамилтрансфераза); является кофактором ряда ферментов, напр. глиоксалазы и формальдегиддегидрогеназы.

17. Скорость химических реакций и сущность явления катализа.Теоретические основы и особенности ферментативного катализа. Термодинамические и кинетические характеристики ферментативного катализа.
Скорость химической реакции, величина, характеризующая интенсивность реакции химической. Скоростью образования продукта реакции называется количество этого продукта, возникающее в результате реакции за единицу времени в единице объёма (если реакция гомогенна) или на единице площади поверхности (если реакция гетерогенна). Для исходных веществ аналогичным образом определяется скорость их расходования. Количества веществ выражают в молях. Катализ (от греч. katálysis — разрушение), изменение скорости химических реакций в присутствии веществ (катализаторов), вступающих в промежуточное химическое взаимодействие с реагирующими веществами, но восстанавливающих после каждого цикла промежуточных взаимодействий свой химический состав. Реакции с участием катализаторов называются каталитическими. Основным фактором, определяющим скорость химического превращения, является энергия активации (Е) — разность энергий активного комплекса и исходных реагирующих молекул. Если предположить, что реакция не нарушает равновесного распределения энергии между молекулами, то вероятность образования активного комплекса, а следовательно, и скорость реакции в первом приближении пропорциональна exp (—E/RT), где R — газовая постоянная, Т — абсолютная температура. Отсюда следует, что скорость реакции тем больше, чем меньше Е, и вследствие экспоненциальной зависимости возрастает значительно даже при небольшом снижении Е. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ (биокатализ), ускорение биохим. р-ций при участии белковых макромолекул, называемых ферментами (энзимами). Ферментативный катализ- разновидность катализа, хотя термин "ферментация" (брожение)известен с давних времен, когда еще не было понятия хим. катализа. В простейшем случае ур-ние р-ции с участием фермента имеет вид: E+S-->ES-->E+P где E - фермент, S - субстрат, ES - фермент-субстратный комплекс (т. наз. комплекс Михаэлиса), P- продукт р-ции. Превращение субстрата в продукт происходит в комплексе Михаэлиса. Часто субстрат образует ковалентные связи с функц. группами активного центра, в т. ч. и с группами кофермента (см. Коферменты). Важнейшие особенности ферментативного катализа - эффективность, специфичность и чувствительность к регуляторным воздействиям. Ферменты увеличивают скорость хим. превращения субстрата по сравнению с неферментативной р-цией в 109-1012 раз. Столь высокая эффективность обусловлена особенностями строения активного центра. Принято считать, что активный центр комплементарен переходному состоянию субстрата при превращении его в продукт. Благодаря этому стабилизируется переходное состояние и понижается активац. барьер р-ции. Активность ферментов регулируется в процессе их биосинтеза (в т.ч. благодаря образованию изоферментов, к-рые катализируют идентичные р-ции, но отличаются строением и каталитич. св-вами), а также условиями среды (рН, т-ра, ионная сила р-ра) и многочисленными ингибиторами и активаторами, присутствующими в организме. Ингибиторами и активаторами могут служить сами субстраты (в определенных концентрациях), продукты р-ции, а также конечные продукты в цепи последоват. превращений в-ва.

18.Классификация и номенклатура ферментов. Химическая природа ферментов, их функциональные группы. Активный и аллостерический центры. ФЕРМЕНТЫ (от лат. fermentum - закваска) (энзимы), белки, выполняющие роль катализаторов в живых организмах. Осн. ф-ции ферментов- ускорять превращение в-в, поступающих в организм и образующихся при метаболизме (для обновления клеточных структур, для обеспечения его энергией и др.), а также регулировать биохим. процессы (напр., реализацию ге-нетич. информации), в т. ч. в ответ на изменяющиеся условия.

Классификация ферментов. Исторически многим ферментам присваивались тривиальные названия, часто не связанные с типом катализируемой р-ции. Для преодоления возникших трудностей в сер. 20 в. были разработаны классификации и номенклатура ферментов. По рекомендации Международного биохим. союза, все ферменты в зависимости от типа катализируемой р-ции делят на 6 классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы и лигазы. Каждый класс делится на подклассы, в соответствии с природой функц. групп субстратов, подвергающихся хим. превращению. Подклассы, в свою очередь, делятся на подпод-классы в зависимости от типа участвующего в превращении фермента. К оксидоредуктазам относятся ферменты, катализирующие окислит.-восстановит. р-ции. Ферменты этого типа переносят атомы H или электроны. Многие оксидоредуктазы являются ферментами дыхания и окислительного фосфорилирования. Трансферазы катализируют перенос функц. групп (CH3, COOH, NH2, CHO и др.) от одной молекулы к другой. Гидролазы катализируют гидролитич. расщепление связей (пептидной, гликозидной, эфирной, фосфодиэфирной и др.). Лиазы катализируют негидролитич. отщепление групп от субстрата с образованием двойной связи и обратные р-ции. Эти ферменты могут отщеплять CO2, H2O, NH3 и др.
Изомеразы катализируют образование изомеров субстрата, в т. ч. цис-, транс-изомеризацию, перемещение кратных связей, а также групп атомов внутри молекулы.
Лигазы - ферменты, катализирующие присоединение двух молекул с образованием новых связей (С — С, С — S, С — О, С — N и др.), как правило, сопряженное с расщеплением пирофос-фатной связи, напр. у АТФ. На пов-сти белковой глобулы фермента или, чаще, в спец. щели, углублении и т. п. выделяют относительно небольшой участок, наз. активным центром. Он представляет собой совокупность функц. групп аминокислотных остатков, непосредственно взаимодействующих с субстратом. В активный центр фермента, кроме функц. групп, могут входить небелковые составляющие - коферменты. Такой комплекс наз. холо -ферментом, а его белковую часть - апоферментом. Аминокислотные остатки, входящие в активный центр, относятся к наиб. консервативным в данной группе ферментов. В активном центре можно выделить субстрат - связывающий участок и собственно каталитически активные группы ферментов. К последним, напр., в подподклассе сериновых протеаз относятся функц. группы остатков серина-195, гистидина-57 и аспарагиновой к-ты-102. Кроме того, в качестве каталитически активных групп ферментов выступают группа SH цистеина, группа COOH глугаминовой к-ты, фенольный гидроксил тирозина и др., а также функц. группы коферментов - никотинамидное кольцо никотинамидных коферментов, альдегидная группа (в виде альдимина) пиридоксальфосфата, тиазолино-вое кольцо тиаминпирофосфата, ионы металлов (напр., Zn2+, Co2+, Mn2+) и др. Помимо активного центра, в молекуле фермента может присутствовать также аллостерический центр (или центры) (от греч. allos – другой, иной и steros – пространственный, структурный), представляющий собой участок молекулы фермента, с которым связываются определенные, обычно низкомолекулярные, вещества (эффекторы, или модификаторы), молекулы которых отличаются по структуре от субстратов.

Присоединение эффектора к аллостерическому центру изменяет третичную и часто также четвертичную структуру молекулы фермента и соответственно конфигурацию активного центра, вызывая снижение или повышение энзимати-ческой активности. Ферменты, активность каталитического центра которых подвергается изменению под влиянием аллостерических эффекторов, связывающихся с аллостерическим центром, получили название аллостерических ферментов.

Дата добавления: 2015-11-04