Таким образом, как у прокариот, так и у эукариот гены, кодирующие глюконеогенетические ферменты, скорее регулируются вместе, чем индивидуально и PPAR при этом играют координирующую роль [Ronne H. Glucose repression in fungi / H. Ronne // Trends Genet. – 1995. – Vol. 11, № 1. – P. 12-17.], [Liu F. Bifunctional glyoxylate cycle protein of Caenorhabditis elegans: a developmentally regulated protein of intestine and muscle / F. Liu, J. D. Thatcher, J. M. Barral // Dev. Biol. – 1995. – Vol. 169. – P. 399-414.].
1.2.3. Характеристика структурной организации генетического материала изоцитратлиазы
В настоящее время достаточно охарактеризован ген ИЦЛ метилотрофных дрожжей Pichia pastoris [Menendez J. The ICL1 gene of Pichia pastoris, transcriptional regulation and use of its promoter / J. Menendez, I. Valdes, N. Cabrera // Yeast. – 2003. – Vol. 20, №13. – P. 1097–1108.]. Продукт ген изоцитратлиазы найден скринингом геномной библиотеки P. pastoris. Используя пару вырожденных праймеров, данный ген был клонирован методом полимеразой цепной реакции. Размноженный ген ИЦЛ содержал открытую рамку считывания размером 1563 н.п. Секвенированный белок сотоял из 551 аминокислоты. Молекулярная масса субъединицы составила 60,6 кДa с высокой степенью гомологии ИЦЛ из других источников. Аминокислотная гомология составила 64 % с ИЦЛ Saccharomyces cerevisiae. Нозерн-блоттингом показано, что как у S. Cerevisiae, так и у P. pastoris уровень мРНК ИЦЛ зависят от углеродного источника, используемого для роста клеток [Menendez J. The ICL1 gene of Pichia pastoris, transcriptional regulation and use of its promoter / J. Menendez, I. Valdes, N. Cabrera // Yeast. – 2003. – Vol. 20, №13. – P. 1097–1108.]. Ген ИЦЛ, размером 1458 н.п., был изолирован из метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha [Berardi E. The Hansenula polymorpha isocitrate lyase gene / E. Berardi, A. Gambini, A.R. Bellu // Yeast. – 2003. – Vol. 20, N 9. – P. 803 – 811.]. Данная последовательность нуклеотидов кодирует 486 аминокислот белка с молекулярной массой субъединицы 54,9 kДa. Этот белок короче, чем ИЦЛ из Saccharomyces cerevisiae и Candida tropicalis. Транскрипционное регулирование уровня мРНК главным образом достигнуто репрессией – дерепрессией глюкозы, причём индукция этанолом вносит незначительный вклад в повышение уровня мРНК [Osumi M. Microbody-associated DNA in Candida tropicalis / Osumi M.,Kazama H.,Sato S. // FABS Lett. – 1978. – Vol-90, №2. – P. 309–312.].
Другими исследователями была расшифрована кДНК (длиной 1463 п.н.) из Strongyloides stercoralis. Сиквенс нуклеотидной последовательности кДНК, показал, что она кодирует ИЦЛ. Концептуально полученная (с помощью таблицы генетического кода) аминокислотная последовательность с открытой рамкой считывания кодирует белок размером 450 аминокислотных остатков с молекулярной массой субъединицы 50 kДa. Секвенирование нуклеотидной последовательности показало содержание A/T равное 69 %. Последовательность аминокислот ИЦЛ S.stercoralis сопоставима с таковой последовательностью бифункционального белка ИЦЛ Caenorhabditis elegans, Chlamydomonas reinhardtii и Myxococcus xanthus. Вся кДНК S. stercoralis была экспрессирована в pRSET вектор с использованием промотора бактериофага T7. После чего ИЦЛ была очищена с помощью металафинной хроматографии [Siddiqui A. A. Cloning and expression of isocitrate lyase from human round Strongyloides stercoralis / A. A. Siddiqui, C. S. Stanley, S. L. Berk // Parasite. – 2000. – Vol. 7. – P. 233–236.].
Показано, что в мышечных клетках, а также клетках кишечника C. elegans в избытке содержится белок с молекулярной массой 106 кДа, который обладает ИЦЛ и МС каталитическими активностями. Данный белок назван бифункциональным белком глиоксилатного цикла. Его кДНК состоит из 3274 п.н.. N-концевой домен белка из 443 аминокислотных остатков и имеет значительную степень гомологии с ИЦЛ бактерий, грибов и растений (71 % гомологии с ИЦЛ E. coli). C-концевой домен состоит из 517 остатков аминокислот. Несмотря на то, что данные по исследованию семейств генов и белков эволюционно сближают животных с грибами, а растения с бактериями, аминокислотные последовательности изоцитратлиазного и малатсинтазного доменов бифункционального белка C.elegans более сходны с последовательностями E. coli, чем S. cerevisiae.
Ввиду того, что ИЦЛ патогенных микроорганизмов рассматривается в качестве мишени для действия лекарственных препаратов, недавно была определена пространственная структура данного фермента из Mycobacterium tuberculosis [Sharma V. Structure of isocitrate lyase, a persistent factor of Mycobacterium tuberculosis. / V. Sharma, G. Sharma // Nat.Struct.Biol. – 2000. – Vol. 7. – P. 663–668.]. Знание структуры фермента чрезвычайно важно для подбора его эффективных ингибиторов.
Изоцитратлиаза (рис.3а) M.tuberculosis имеет гомотетрамерное строение (81A x 86A x 92A). Каждая субъединица фермента состоит из 14 a-спиралей и 14 b-структур. Все субъединицы устойчиво связаны взаимодействием спиралей. Восемь a-спиралей и восемь b-структур, составляющих самый большой домен и основу структуры, формируют a/b-баррель. Активный центр ИЦЛ типично для подобных структур формируется С-концевыми участками b-структур. Плоская молекула глиоксилата в активном центре координационно связывается с ионом Mg2+, а также образует водородные связи с аминокислотными остатками Сер 91, Гли 92, Трип 93 и Арг 228 (рис.3b). Молекула сукцината связывается с другой частью активного центра фермента и формирует водородные связи с Асн 313, Глу 295, Арг 228, Гли 192 (первая карбоксильная группа) и Тир 347, Асн 313, Сер 315, Сер 317, Гис 193 (вторая карбоксильная группа) (рис 3с) [ Sharma V. Structure of isocitrate lyase, a persistent factor of Mycobacterium tuberculosis. / V. Sharma, G. Sharma // Nat.Struct.Biol. – 2000. – Vol. 7. – P. 663–668.].
Рис.3. Пространственная структура изоцитратлиазы M.tuberculosis
(а) гомотетрамер ИЦЛ; (b) Отдельная cубъединица ИЦЛ: α – спираль показана тёмным тоном, β – складчатость - светлым. В активном центре находится Cysteine (Cys 191) ковалентно связанный с ингибитором 3-бромопируватом (BP). Ион Mg 2+ в активном центре представлен сферой; (с) Взаимодействие аналога сукцината, 3-нитропропионата и глиоксилата. Показан активный центр мутанта ИЦЛ C191S, образующий комплекс между глиоксилатом и 3-нитропропионатом. Соответственно обозначены аминокислоты, формирующие активный центр. Информация доступна в Банке данных белка кодами 1F61, 1F81 и 1F8M, соответственно.
1.2.4. Эволюция ферментов глиоксилатного цикла
Ген ИЦЛ обладает большой эволюционной изменчивостью [Ying L.U. Anaerobic Induction of Isocitrate Lyase and Malate Synthase in Submerged Rice Seedlings Indicates the Important Metabolic Role of the Glyoxylate Cycle / L.U. Ying, W.U. Yong-Rui, H. Bin // Acta Biochimica et Biophysica Sinicf. – 2005. – Vol. 37, № 6. – P. 406-414.]. Ранее отмечалось, что в процессе эволюции Caenorhabditis elegans произошло слияние двух белковых комплексов (изоцитратлиазы и малатсинтазы) с образованием фермента с двумя функциональными областями [Liu F. Bifunctional glyoxylate cycle protein of Caenorhabditis elegans: a developmentally regulated protein of intestine and muscle / F. Liu, J. D. Thatcher, J. M. Barral // Dev. Biol. – 1995. – Vol. 169. – P. 399-414.]. Используя эукариотическую последовательность ИЦЛ, не были обнаружены никакие архебактериальные последовательности. Условно ИЦЛ из разных объектов можно разделить на две группы: 1) те, которые содержат эукариотические последовательности от Caenorhabditis и CHlamydomonas, высокогомологичные в β-протеобактериальных геномах; 2) те, которые кодируют в микротельцах ферменты растений и грибов [Schnarrenberger C. Evolution of the enzymes of the citric acid cycle and the glyxylate cycle of higher plants. A case study of andosymbiotic gene transfer / C. Schnarrenberger // Eur. J. Biochem. FEBS – 2002 – Vol. 269. – P. 868–883.].
Рассмотрение вопроса эволюции маркерных ферментов глиоксилатного цикла свидетельствует об обширной горизонтальной передаче бактериальных генов ИЦЛ и МС к эукариотическим организмам [Schnarrenberger C. Evolution of the enzymes of the citric acid cycle and the glyxylate cycle of higher plants. A case study of andosymbiotic gene transfer / C. Schnarrenberger // Eur. J. Biochem. FEBS – 2002 – Vol. 269. – P. 868–883.]. Два гена были сплавлены с образованием бифункционального гена в нематодах и Euglena. Однако, в нематодах изоцитратлиазная область предшествует малатсинтазной, в то время как эвглена имеет обратный порядок доменов [Molecular characterization of a bifunctional glyoxylate cycle enzyme, malate synthase/isocitrate lyase, in Euglena gracilis / M. Nakazawa [et. al.] // Comp Biochem Physiol Biochem Mol Biol. – 2005. – Vol. 141, № 4. – P. 445-452.]. Так как ИЦЛ и МС закодированы в одном и том же опероне у различных бактерий и порядок расположения исследуемых генов также различен, то было предположено, что нематоды и Euglena приобрели данные гены через горизонтальную передачу от бактерий так называемого ace оперона. Данная гипотеза предполагает, что филогенетические деревья, построенные с использованием доменов бифункциональных генов эукариот должны группироваться с соответствующими гомологами из бактерий, имеющими такой же порядок, как в ace опероне. Однако данные исследования не были проведены. В то же время ИЦЛ домен бифункциональных ферментов нематод показал очень высокую (>70%) гомологию с ИЦЛ протеобактерий, в частности с ИЦЛ из рода Brucella и группировался с соответствующими белками из бактерий при построении филогенетических деревьев [Schnarrenberger C. Evolution of the enzymes of the citric acid cycle and the glyxylate cycle of higher plants. A case study of andosymbiotic gene transfer / C. Schnarrenberger // Eur. J. Biochem. FEBS – 2002 – Vol. 269. – P. 868–883.].
В дополнение к достаточно очевидному переносу бифункционального гена ИЦЛ-МС посредством горизонтальной передачи к нематодам, построенное филогенетическое дерево может свидетельствовать о трех других независимых случаях передачи генов от бактерий к эукариотическим организмам – Nematostella, Dictyostelium и Chlamydomonadaceae. Оставшиеся эукариотические ИЦЛ, т.е. из растений, грибов и Tetrahymena формируют четко обозначенные группы с одной из двух копий гена ИЦЛ из Mycobacteria и Anaeromyxobacter dehalogenans [Schnarrenberger C. Evolution of the enzymes of the citric acid cycle and the glyxylate cycle of higher plants. A case study of andosymbiotic gene transfer / C. Schnarrenberger // Eur. J. Biochem. FEBS – 2002 – Vol. 269. – P. 868–883.].
Таким образом, рассмотрев наиболее вероятные сценарии эволюции ИЦЛ, авторы выделили следующие этапы:
1) раннее приобретение гена ИЦЛ редками эукариот от бактерий наиболее вероятно от митохондриальных эндосимбионтов;
2) эволюция вставки, возможно, с внутренней дупликацией с последующей радиальной дивергенцией;
3) обратный горизонтальный перенос ИЦЛ гена от ранних эукариот к бактериям (возможно, предку Micobacterium);
4) потеря гена ИЦЛ в начале эволюции животных;
5) по крайней мере, пять независимых горизонтальных переносов генов от бактерий к эукариотам, приводящие к смешению наследственной формы ИЦЛ с различными бактериальными формами у Dictyostelium, Euglena, кишечнополостных и нематод.
В случае нематод и Euglena, а также, вероятно, кишечнополостных, горизонтальная передача генов сопровождалась слиянием ИЦЛ и МС генов, находящихся, как правило, в ace опероне бактерий. Возможно, слияние генов произошло до их горизонтальной передачи в геноме бактерий. Альтернативный сценарий происхождения ИЦЛ эукариотического типа у бактерий, вероятно, объясняется также горизонтальной передачей гена, но ранним прокариотам. Это хорошо согласуется с наличием у многих бактерий двух генов: ИЦЛ эукариотического типа и типично бактериальной ИЦЛ [Evolution of glyoxylate cycle enzymes in Metazoa: evidence of multiple horizontal transfer events and pseudogene formation / F.A. Kondrashov [et. al.] // Biol Direct. – 2006. – Vol. 1, № 31. – P. 658-667.], [Schnarrenberger C. Evolution of the enzymes of the citric acid cycle and the glyxylate cycle of higher plants. A case study of andosymbiotic gene transfer / C. Schnarrenberger // Eur. J. Biochem. FEBS – 2002 – Vol. 269. – P. 868–883.].
1.3. Особенности метаболизма нетрадиционной культуры амаранта
1.3.1. Морфо-физиологические и биохимические свойства амаранта
Анатомия и морфология амаранта разнообразна в зависимости от вида, места обитания и условий его выращивания. Высота растений достигает от 0,4 до 3 м. Стебель у подавляющего большинства видов амаранта прямостоячий (диаметром до 5 см), реже встречается лежачий. Листья очередные, яйцевидные. Корень стержневой, достигающий до 90 см в глубину. Особенностью амаранта является небольшой размер семян (масса 1000 штук около 0,6 – 1,0 г), покрытых твердой оболочкой, окрашенной в черный, светлооранжевый и красноватый цвет. Периферически кольцевой зародыш семени окружен эндоспермом. Семена амаранта имеют характеристики и свойства, сходные с зерном злака, но так как амарант не принадлежит к их семейству, его часто называют псевдозлаком. Цветы собраны в соцветия, располагающиеся в пазухах листьев и имеющие разнообразные цветовые оттенки [П.Ф. Кононков Амарант – перспективная культура ХХI века / П.Ф. Кононков, В.К. Гинс, М.С. Гинс. – Москва: Издательство Российского университета дружбы народов, 1999. – 296 с.].
Особенностью культуры амаранта является высокая эффективность фотосинтеза, которая обеспечивает быстрый прирост биомассы. В процессе онтогенеза наблюдается возрастание активности фотосинтетического аппарата амаранта и содержания компонентов хлоропластов до стадии цветения, а в фазу созревания – снижение изучаемых характеристик.
Для амаранта характерен C4 – тип фотосинтеза, когда фиксация СО2 происходит в цикле C4 – дикарбоновых кислот (цикл Хэтча-Слэка). C4 – путь включает две стадии: карбоксилирование, локализованное в клетках мезофилла, и декарбоксилирование, протекающее в клетках обкладки [Землянухин А. А. Глиоксилатный цикл растений / А. А. Землянухин, Л. А. Землянухин, А. Т. Епринцев, А. У. Игамбердиев. – Воронеж: Изд-во Воронеж. гос. ун-та, 1986. – 148 с.]. Акцептором углекислоты при этом служит трехуглеродное, богатое энергией соединение – фосфоенолпируват (ФЕП). Реакция карбоксилирования катализируется ферментом ФЕП – карбоксилазой в присутствии ионов магния и неорганического фосфата. [Епринцев А.Т. Распространение глиоксилатного цикла у организмов различных таксономических групп / А.Т. Епринцев, М.Ю. Шевченко, В.Н. Попов // Успехи современной биологии. — М., 2008.— Т. 128, № 3. - С. 271-280.].
Одной из особенностей амаранта является его способность использовать минимальное количество воды на жизнеобеспечение клеточных функций: на 50-25% меньше по сравнению с пшеницей и хлопчатником при синтезе равного количества белка. Амарант имеет низкую величину транспирации воды, что позволяет ему экономно расходовать влагу в неблагоприятных условиях вегетации. На образование одного и того же количества сухого вещества у амаранта расходуется в среднем в два раза меньше воды по сравнению с зерновыми, и в 3 раза меньше по сравнению с бобовыми. Стабильность водного режима амаранта при минимальной влагообеспеченности почвы является основой высокой засухоустойчивости данной культуры, что особенно важно при неблагоприятных изменениях климата [П.Ф. Кононков Амарант – перспективная культура ХХI века / П.Ф. Кононков, В.К. Гинс, М.С. Гинс. – Москва: Издательство Российского университета дружбы народов, 1999. – 296 с.].
Повышенные давление и концентрация СО2 снижают транспирацию у амаранта и сои, тогда как фотосинтетическая ассимиляция СО2 у амаранта в данных условиях не изменяется. Однако, при одновременном повышении давления и температуры у С3 и С4 – растений снижается содержание общего азота и белков [П.Ф. Кононков Амарант – перспективная культура ХХI века / П.Ф. Кононков, В.К. Гинс, М.С. Гинс. – Москва: Издательство Российского университета дружбы народов, 1999. – 296 с.].
Амарант устойчив к повышенным температурам. Повышение температуры до 400С ингибирует электронтранспортные реакции и фотосинтетическую ассимиляцию в хлоропластах у С3 – растений, тогда как у амаранта в этих условиях фотосинтетический аппарат функционирует с высокой эффективностью. Это вызвано тем, что при высокой температуре у С3 – растений закрываются устьица и доступ СО2 в растительную клетку прекращается. Этот эффект известен как полуденная депрессия фотосинтеза, характерная для С3 – растений. У амаранта устьица листа не закрываются в часы максимального притока световой энергии, повышенной температуры и низкой влажности воздуха, что создает оптимальные условия для интенсивного синтеза органических соединений [П.Ф. Кононков Амарант – перспективная культура ХХI века / П.Ф. Кононков, В.К. Гинс, М.С. Гинс. – Москва: Издательство Российского университета дружбы народов, 1999. – 296 с.].
На величину фотосинтетической и биологической продуктивности влияет фотопериод. Амарант – растение короткого дня, т.е. чем короче световой день, тем быстрее созревает амарант с достаточно высокой биологической и семенной продуктивностью. При продолжительном световом дне созревание семян амаранта задерживается, зато хорошо развивается вегетативная часть растения, давая большую массу листьев, стеблей и соцветий. Таким образом, важным преимуществом многих видов амаранта перед злаками является их высокая фотосинтетическая продуктивность, зависимая от фотопериода [П.Ф. Кононков Амарант – перспективная культура ХХI века / П.Ф. Кононков, В.К. Гинс, М.С. Гинс. – Москва: Издательство Российского университета дружбы народов, 1999. – 296 с.].
Важной особенностью амаранта является пластичность, благодаря которой проявляется сильная изменчивость не только морфо-физиологических свойств растения, но и биохимического состава и содержания веществ в листьях и семенах. Широкая изменчивость содержания разнообразных веществ амаранта определяется в первую очередь условиями выращивания растений: климатом данного региона, агротехникой культивирования, фазой развития растений и его генотипом. Выявлены виды амаранта с высоким содержанием белка, хлорофиллов, каротиноидов, амарантина, рутина и пектина, которое значительно изменялось в зависимости от вида [П.Ф. Кононков Амарант – перспективная культура ХХI века / П.Ф. Кононков, В.К. Гинс, М.С. Гинс. – Москва: Издательство Российского университета дружбы народов, 1999. – 296 с.].
1.3.2. Химический состав амаранта
Семена амаранта по содержанию важнейших биологически активных веществ превосходят традиционные культуры. В состав семян амаранта входят белки – 15-18%, липиды – 6-10%, крахмал – 56-64%, клетчатка – 3-4%.
Белок, выделенный из семян амаранта, близок к идеальному белку. Он имеет сбалансированный аминокислотный состав, за исключением лейцина, который является дефицитной аминокислотой, чем выгодно отличается от аминокислотного состава зерновых культур [П.Ф. Кононков Амарант – перспективная культура ХХI века / П.Ф. Кононков, В.К. Гинс, М.С. Гинс. – Москва: Издательство Российского университета дружбы народов, 1999. – 296 с.].
Главным компонентом белка амаранта является глутаминовая кислота и аргинин, кроме того он богат лизином, треонином, изолейцином. Высокое содержание незаменимых аминокислот – 34,5% обусловлено преимущественно лизином 4,3 – 6,5%, изолейцином 3,3- 3,8% и суммой тирозина с фенилаланином 6,3-8,1% [Магомедов И.М. Физиологические основы конкурентоспособности амаранта / И.М. Магомедов // Успехи современного естествознания. – 2008. – № 5 – С. 57-59.].
Исследование запасных глобулинов семян Amaranthus hypochondriacus К 343, показало, что они представляют собой двенадцати угольники, состоящие из двух кольцеобразных шестигранников, расположенных параллельно друг другу. Из различий аминокислотного состава растительных белков зерновых культур и амаранта, содержащего в большом количестве лизин, треонин, валин, вытекает возможность повышения их биологической ценности в результате смешивания и совместного потребления белков, дополняющих друг друга по аминокислотному составу [П.Ф. Кононков Амарант – перспективная культура ХХI века / П.Ф. Кононков, В.К. Гинс, М.С. Гинс. – Москва: Издательство Российского университета дружбы народов, 1999. – 296 с.]. Белок семян амаранта в смеси с другими зерновыми культурами может стать ценным пищевым продуктом в рационе питания, покрывающим дефицит белка и повышающим физиологическую и питательную ценность за счет взаимного обогащения белков.
Семена амаранта содержат от 6% до 10% масла. Жирнокислотный состав масла из семян амаранта подобен маслу зерновых культур (зародышей пшеницы, овса, рисовой мучки) и представлен как насыщенными, так и ненасыщенными жирными кислотами.
Масло амаранта на 81% состоит из триглицеридов. Содержание неомыляемых веществ в нем достигает более 8%, стериновых эфиров – около 5%, диглицеридов – 1,8%, фосфолипидов- около 4%. Преобладающим стеролом в масле амаранта является ситостерол [П.Ф. Кононков Амарант – перспективная культура ХХI века / П.Ф. Кононков, В.К. Гинс, М.С. Гинс. – Москва: Издательство Российского университета дружбы народов, 1999. – 296 с.].
Амарантовое масло характеризуется необычно высоким содержанием сквалена. Сквален – природный ациклический тритерпен с шестью двойными (ненасыщенными) связями, 2,6,10,15,19,23 – гексаметил – 2,6,10,14,18,22 – тетракозагексаен [Магомедов И.М. Физиологические основы конкурентоспособности амаранта / И.М. Магомедов // Успехи современного естествознания. – 2008. – № 5 – С. 57-59.].
Сквален выполняет в организме роль регулятора липидного и стероидного обмена, являясь предшественником целого ряда стероидных гормонов, холестерина и витамина А.
Также в семенах амаранта содержится значительное количество полисахаридов, представленных в основном крахмалом от 48% до 69%. Крахмал амаранта по своим параметрам является уникальным – гомополисахарид α – D – глюкозы, является основным хранилищем углеводов для всех высших растений. Для крахмала амаранта вследствие малого размера гранул характерна повышенная набухаемость при низкой растворимости и пониженное субстратное сродство к ферменту α – амилазе [Магомедов И.М. Физиологические основы конкурентоспособности амаранта / И.М. Магомедов // Успехи современного естествознания. – 2008. – № 5 – С. 57-59.]. Амарантовый крахмал может быть отнесен вследствие высокого содержания амилопектина к "восковым видам ", которые характеризуются высокой вязкостью и желатинизацией при высоких температурах.
Соотношение содержания амилозы и амилопектина является главной различительной составляющей гранул амарантового крахмала между различными разновидностями и в пределах генетических наследственных признаков тех же самых разновидностей.
Молекула амилозы представляет собой линейный полимер, состоящий из α – D – глюкопиранозидных фрагментов, связанных между собой α (1→ 4) связями. Степень полимеризации составляет от 500 до 2000 глюкозидных остатков. Амилопектин в отличие от амилозы является разветвленным компонентом крахмала. Он образован цепями α – D – глюкопиранозных остатков (длина от 17 до 25 единиц), которые соединены между собой α (1→6) связями [П.Ф. Кононков Амарант – перспективная культура ХХI века / П.Ф. Кононков, В.К. Гинс, М.С. Гинс. – Москва: Издательство Российского университета дружбы народов, 1999. – 296 с.].
Амилопектин может быть разрушен β – амилазой по α (1→4) связям с образованием β –декстринов и изоамилазой, которая атакует α (1→6) связи, до мальтозы. Молекулярный вес амилопектина изменяется в пределах от 50 до 500×106. Эти значения зависят от происхождения крахмала, метода, использованного для разделения крахмала на амилозу и амилопектин, и метода использованного для определения молекулярной массы.
Кроме главных составных частей – амилозы и амилопектина, в крахмале может присутствовать небольшое количество примесей (неуглеводных составляющих: белка, жира, зольных веществ, которые, несмотря на незначительные количества, могут влиять на функциональные свойства крахмала) [П.Ф. Кононков Амарант – перспективная культура ХХI века / П.Ф. Кононков, В.К. Гинс, М.С. Гинс. – Москва: Издательство Российского университета дружбы народов, 1999. – 296 с.].
Первое определение свободных сахаров в семенах амаранта было выполнено методом ГЖХ. Было обнаружено содержание сахарозы (~1,6%), раффинозы (~0,8%) и стахиозы (~0,2%). Основной извлекаемый сахар во всех видах амаранта – сахарозы. Количество сахара такое же как и в пшенице, просе, но меньше чем для дикого риса.
Изучено влияние окраски, сорта и видовой принадлежности семян амаранта на содержание клетчатки. Установлено, что массовая доля клетчатки в светлоокрашенных семенах колебалась от 3,9 до 4,9%, а в темноокрашенных образцах – от 14,3% до 16,5%. Суммарное количество водорастворимых углеводов в исследуемых образцах – 2,75% - 4,0%.
Общее содержание минеральных веществ в различных видах амаранта обычно выше, чем в зерне других злаков. Установлено, что общее содержание микроэлементов в двух образцах A.hypochondriacus и в восьми образцах A. Cruentus было следующим: Mn –29 и 31, Cu –7 и 6, B – 9 и 9,Al – 41 и 41, Zn –36 и 35, Sr – 2 и 5,Pb – 3 и 3.Si – 30 и 27 частей на миллион. Содержание микроэлементов: P –от 4,2 до 7,5, K –от 3,0 до 7,8, Ca – от 1,7 до 4,6, Mg –от 2,4 до 5,4, S – от 160 до 200,Na – от 310 до 370, Fe – от 84 до 205 частей на миллион [Магомедов И.М. Физиологические основы конкурентоспособности амаранта // Успехи современного естествознания. – 2008. – № 5 – С. 57-59.].
Таким образом, аналитический обзор литературных данных позволяет указать на необходимость исследований этой важной для жизни человека культуры. Ценность амаранта обусловлена уникальным биохимическим составом семян и полезными компонентами, присутствующими в продуктах его первичной переработки. Амарантовое масло содержит значительные количества сквалена (до 8%), обладающего фармакологическим действием. Несмотря на значительный интерес исследователей в последнее десятилетие к данной культуре в Центрально – Черноземном регионе амарант остается в значительной мере экзотической культурой. Подобная ситуация объясняется отсутствием адаптированных к нашим условиям сортов, обеспечивающих урожай семян, то есть являющихся «зерновой» культурой.
Важнейшей нерешенной проблемой остается послеуборочное созревание и хранение семян амаранта, позволяющее использовать его в хозяйственной деятельности продолжительное время.
Амарант обладает комплексом хозяйственно – полезных признаков, высокой продуктивностью и конкурентоспособностью. Одно из важнейших свойств амарантового масла – наличие в нем значительных количеств сквалена, обладающего ярко выраженным фармацевтическим действием.
Изучение физиологических и биохимических особенностей интродуцированных сортов амаранта позволит успешно культивировать это растение в нашем регионе.
Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ
Целью работы являлось идентификация генов изоцитратлиазы и анализ их экспрессии в проростках семян амаранта сорта «Рыжик».
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить динамику активности изоцитратлиазы в проростках семян амаранта сорта «Рыжик»;
2. Определить изоферментный состав ИЦЛ;
3. Исследовать субклеточную локализацию изоцитратлиазы;
4. Провести ОТ-ПЦР анализ кДНК из проростков амаранта для идентификации генов, кодирующих ИЦЛ;
5. Секвенировать участки генов изоцитратлиазы из объекта исследования;
6. Исследовать экспрессию генов изоцитратлиазы.
2.2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.2.1. Объект исследования
Объектом исследования данной экспериментальной работы являются прорастающие семена амаранта (Amaranthus caudatus L., сорт «Рыжик»), выращенные гидропонным способом при температуре 25°С.
2.2.2. Методы исследования
2.2.2.1. Определение активности изоцитратлиазы
Активность ИЦЛ (К.Ф. 4.1.3.1) определяли спектрофотометрическим методом на СФ-2000. Спектрофотометрирование проводили в среде калориметрирования с добавлением 20 мкл гомогената. Среда спектрофотометрирования для изоцитратлиазы: 50 ммоль/л Tris HCl буфер, рН 7,5; 5 мМ изоцитрат натрия; 5 мМ MgCl2; 4 ммоль/л фенилгидразин солянокислый. Данный метод основан на образовании комплекса фенилгидразина с глиоксилатом, поглощающим при 324 нм [Kornberg H. L. Synthesis of cell constituents from C2-units by a modigied tricarboxylic acid cycle / H. L. Kornberg, H. A. Krebs // Nature – 1957. – Vol. 179. – P. 988-991.].
Дата добавления: 2015-11-04; просмотров: 34 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |