1.Строение белков: первичная, вторичная, третичная и четвертичная структуры.

1.Строение белков: первичная, вторичная, третичная и четвертичная структуры.

Молекулы белков могут иметь различные пространственные конфигурации, и в их строении различают четыре уровня структурной организации.

Последовательность аминокислот в составе полипептидной цепи представляет первичную структуру белка. Она уникальна для любого белка и определяет его форму, свойства и функции.
Большинство белков имеют вид спирали в результате образования водородных связей между—CO- и —NH- группами разных аминокислотных остатков полипептидной цепи. Водородные связи малопрочные, но в комплексе они обеспечивают довольно прочную структуру. Эта спираль — вторичная структура белка.

Третичная структура — трехмерная пространственная «упаковка» полипептидной цепи. В результате возникает причудливая, но для каждого белка специфическая конфигурация —глобула. Прочность третичной структуры обеспечивается разнообразными связями, возникающими между радикалами аминокислот.

Четвертичная структура характерна не для всех белков. Она возникает в результате соединения нескольких макромолекул с третичной структурой в сложный комплекс. Например, гемоглобин крови человека представляет комплекс из четырех макромолекул белка.
Такая сложность структуры белковых молекул связана с разнообразием функций, свойственных этим биополимерам.
Нарушение природной структуры белка называют денатурацией. Она может происходить под воздействием температуры, химических веществ, лучистой энергии и других факторов. При слабом воздействии распадается только четвертичная структура, при более сильном — третичная, а затем — вторичная, и белок остается в виде полипептидной цепи.
Этот процесс частично обратим: если не нарушена первичная структура, то денатурированный белок способен восстанавливать свою структуру. Отсюда следует, что все особенность строение макромолекулы белка определяются его первичной структурой.

Кроме простых белков, состоящих только из аминокислот, есть еще и сложные белки

2.Физико-химические свойства белков: ионизация белков в растворе, гидратация и растворимость.

Ионизация. Белки имеют в своём составе радикалы лизина, аргинина, гистидина, глутаминовой и аспарагиновой кислот, содержащие функциональные группы, способные к ионизации (ионогенные группы). Кроме того, на N- и С-концах полипептидных цепей имеются α-амино- и α-карбоксильная группы, также способные к ионизации. Суммарный заряд белковой молекулы зависит от соотношения ионизированных анионных радикалов Глу и Асп и катионных радикалов Лиз, Apr и Гис.

Степень ионизации функциональных групп этих радикалов зависит от рН среды. При рН раствора около 7 все ионогенные группы белка находятся в ионизированном состоянии. В кислой среде увеличение концентрации протонов (Н+) приводит к подавлению диссоциации карбоксильных групп и уменьшению отрицательного заряда белков: -СОО- + Н+ → -СООН. В щелочной среде связывание избытка ОН" с протонами, образующимися при диссоциации NH3+с образованием воды, приводит к уменьшению положительного заряда белков:

-NH3+ +ОН- → -NH2 + H2O.

Значение рН, при котором белок приобретает суммарный нулевой заряд, называют"изоэлектрическая точка" и обозначают как pI. В изоэлектрической точке количество положительно и отрицательно заряженных групп белка одинаково, т.е. белок находится в изоэлектрическом состоянии.

Так как большинство белков в клетке имеет в своём составе больше анионогенных групп (-СОО-), то изоэлектрическая точка этих белков лежит в слабокислой среде. Изоэлектрическая точка белков, в составе которых преобладают катионогенные группы, находится в щелочной среде. Наиболее яркий пример таких внутриклеточных белков, содержащих много аргинина и лизина, - гистоны, входящие в состав хроматина.

Белки, имеющие суммарный положительный или отрицательный заряд, лучше растворимы, чем белки, находящиеся в изоэлектрической точке. Суммарный заряд увеличивает количество диполей воды, способных связываться с белковой молекулой, и препятствует контакту одноимённо заряженных молекул, в результате растворимость белков увеличивается. Заряженные белки могут двигаться в электрическом поле: анионные белки, имеющие отрицательный заряд, будут двигаться к положительно заряженному аноду (+), а катионные белки - к отрицательно заряженному катоду (-). Белки, находящиеся в изоэлектрическом состоянии, не перемещаются в электрическом поле.

Гидратация белков и факторы, влияющие на их растворимость

Белки — гидрофильные вещества. Если растворять сухой белок в воде, то сначала он, как всякое гидрофильное высокомолекулярное соединение, набухает, а затем молекулы белка начинают постепенно переходить в раствор. При набухании молекулы воды проникают в белок и связываются с его полярными группами. Плотная упаковка полипептидных цепей разрыхляется. Набухший белок можно считать как бы обратным раствором, т. е. раствором молекул воды в высокомолекулярном веществе — белке. Дальнейшее поглощение воды приводит к отрыву молекул белка от общей массы и растворению. Но набухание не всегда ведет к растворению; некоторые белки, например коллаген, так и остаются в набухшем виде, поглотив большое количество воды.

Растворение связано с гидратацией белков, т. е. связыванием молекул воды с белками. Гидратная вода так прочно связана с макромолекулой белка, что отделить ее удается с большим трудом. Это говорит не о простой адсорбции, а об электростатическом связывании молекул воды с полярными группами боковых радикалов кислых аминокислот, несущих отрицательный заряд, и основных аминокислот, несущих положительный заряд.

Однако часть гидратной воды связывается пептидными группами, которые образуют с молекулами воды водородные связи. Например, полипептиды с неполярными боковыми группами тоже набухают, т. е. связывают воду. Так, большое количество воды связывает коллаген, хотя этот белок содержит преимущественно неполярные аминокислоты. Вода, связываясь с пептидными группами, раздвигает вытянутые полипептидные цепи. Однако межцепочечные связи (мостики) не дают молекулам белка отрываться друг от друга и переходить в раствор. При нагревании сырья, содержащего коллаген, межцепочечные мостики в коллагеновых волокнах разрываются и освобожденные полипептидные цепи переходят в раствор. Эта фракция частично гидролизованного растворимого коллагена называется желатиной. Желатина по химическому составу близка к коллагену, легко набухает и растворяется в воде, образуя вязкие жидкости. Характерным свойством желатины является способность к гелеобразованию. Водные растворы желатины широко используются в лечебной практике как плазмозамещающее и кровоостанавливающее средство, а способность к гелеобразованию — при изготовлении капсул в фармацевтической практике.

Факторы, влияющие на растворимость белков. Растворимость разных белков колеблется в широких пределах. Она определяется их аминокислотным составом (полярные аминокислоты придают большую растворимость, чем неполярные), особенностями организации (глобулярные белки, как правило, лучше растворимы, чем фибриллярные) и свойствами растворителя. Например, растительные белки — проламины — растворяются в 60-80%-ном спирте, альбумины — в воде и в слабых растворах солей, а коллаген и кератины нерастворимы в большинстве растворителей.

Стабильность растворам белков придают заряд белковой молекулы и гидратная оболочка. Каждая макромолекула индивидуального белка имеет суммарный заряд одного знака, что препятствует их склеиванию в растворе и выпадению в осадок. Все, что способствует сохранению заряда и гидратной оболочки, облегчает растворимость белка и его устойчивость в растворе. Между зарядом белка (или числом полярных аминокислот в нем) и гидратацией существует тесная связь: чем больше полярных аминокислот в белке, тем больше связывается воды (в расчете на 1 г белка). Гидратная оболочка белка иногда достигает больших размеров, и гидратная вода может составлять до 1/5 его массы.

Правда, некоторые белки гидратируются сильнее, а растворяются хуже. Например, коллаген связывает воды больше, чем многие хорошо растворимые глобулярные белки, но не растворяется. Его растворимости мешают структурные особенности — поперечные связи между полипептидными цепями. Иногда разноименно заряженные группы белка образуют много ионных (солевых) связей внутри молекулы белка или между молекулами белков, что мешает образованию связей между молекулами воды и заряженными группами белков. Наблюдается парадоксальное явление: в белке много анионных или катионных групп, а растворимость его в воде низкая. Межмолекулярные солевые мостики вызывают склеивание молекул белка и их выпадение в осадок.

Какие же факторы среды влияют на растворимость белков и их стабильность в растворах?

Влияние нейтральных солей [показать].

Нейтральные соли в небольших концентрациях повышают растворимость даже тех белков, которые нерастворимы в чистой воде (например, эвглобулины). Это объясняется тем, что ионы солей, взаимодействуя с противоположно заряженными группами молекул белков, разрушают солевые мостики между молекулами белков. Повышение концентрации солей (увеличение ионной силы раствора) оказывает обратное действие.

Влияние рН среды [показать].

рН среды влияет на заряд белка, а следовательно, на его растворимость. Наименее устойчив белок в изоэлектрическом состоянии, т. е. когда его суммарный заряд равен нулю. Снятие заряда позволяет молекулам белка легко сближаться, склеиваться и выпадать в осадок. Значит, растворимость и устойчивость белка будут минимальны при рН, соответствующем изоэлектрической точке белка.

Влияние температуры [показать].

Строгой зависимости между температурой и характером растворимости белков не имеется. Одни белки (глобулины, пепсин, фосфорилаза мышц) в водных или солевых растворах с повышением температуры растворяются лучше; другие (альдолаза мышц, гемоглобин и т.д.) хуже.

Влияние разнозаряженного белка [показать].

Если в раствор белка, являющегося полианионом (кислый белок), добавить белок, являющийся поликатионом (основной белок), то они образуют агрегаты. При этом устойчивость вследствие нейтрализации зарядов теряется и белки выпадают в осадок. Иногда эту особенность используют для выделения нужного белка из смеси белков.

3. Осаждение белков из растворов. Механизм обратимого осаждения белков: факторы, вызывающие обратимое осаждение белков.

Способы осаждения белков

Белки в растворе и соответственно в организме сохраняются в нативном состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул белков и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от реактивов и условий реакции. В клинической лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций белков плазмы крови, количественной характеристики их устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения без белкового раствора.

Обратимое осаждение

Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание.

Высаливание - путем добавления солей щелочноземельных металлов. В основе действия лежит конкуренция их с белками за воду. Высаливающий эффект наступает при достаточно высоких концентрациях солей (насыщенные или полунасыщенные растворы). В практике часто используют Nа2SО4 и (NН4)2SО4. эти соли удаляют водную оболочку и снимают заряд. Глобулины, имеющие крупные и тяжелые молекулы и небольшую водную оболочку, выпадают в осадок при неполном насыщении раствора солями, а альбумины как более мелкие молекулы, окруженные большой водной оболочкой – при полном насыщении. Высаливание не вызывает нарушения структуры белков.
Высаливание. Насыщенным раствором сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным раствором - глобулиновая фракция.
Сущность реакции заключается в дегидратации молекул белка.

Реактивы:

1) неразведенный яичный белок;

2) насыщенный раствор сульфата аммония;

3) NaOH, 10% раствор,

4) CuSO4, 1% раствор;

5) дистиллированная вода;

6) сульфат аммония в порошке.

Ход определения. В пробирку наливают 30 капель неразведенного яичного белка и добавляют равное количество насыщенного раствора сульфата аммония. Содержимое пробирки перемешивают. Получают полунасыщенный раствор сульфата аммония, при этом глобулиновая фракция осаждается, а альбуминовая остается в растворе. Последнюю отфильтровывают, затем смешивают с порошком сульфата аммония до тех пор пока не прекратится растворение соли, при этом выпадает осадок - глобулины.

4. Практическое использование необратимого осаждения белка в медицине

Важное место в биохимических исследованиях занимает выделение индивидуальных белков из органов и тканей. Очищенные индивидуальные белки нужны для изучения их первичной структуры, получения кристаллов белков с целью исследования их пространственной структуры методом рентгеноструктурного анализа, установления взаимосвязи между первичной, пространственной структурой белка и его функцией.

Некоторые очищенные индивидуальные белки используют в медицине как лекарственные препараты, например гормон инсулин применяют для лечения сахарного диабета, а пищеварительные ферменты поджелудочной железы назначают при нарушении её функций в качестве заместительной терапии. Кроме того, очищенные ферменты часто используют в биохимических исследованиях в качестве химических реактивов для определения веществ в биологических жидкостях.

Большинство методов, используемых для очистки индивидуальных белков, основано на различиях их физико-химических свойств, а также возможности специфично связываться с лигандом.

5. Денатурация белков: факторы, вызывающие денатурацию, механизм тепловой денатурации белков. Свойства денатурированного белка.

При действии различных веществ, нарушающих высшие уровни организации белковой молекулы (вторичную, третичную, четвертичную) с сохранением первичной структуры, белок теряет свои нативные физико-химические и, главное, биологические свойства. Это явление называется денатурацией (денативацией). Оно характерно только для молекул, имеющих сложную пространственную организацию. Синтетические и природные пептиды не способны к денатурации.

При денатурации разрываются связи, стабилизирующие четвертичную, третичную и даже вторичную структуры. Полипептидная цепь разворачивается и находится в растворе или в развернутом виде, или в виде беспорядочного клубка. При этом теряется гидратная оболочка и белок выпадает в осадок. Однако осажденный денатурированный белок отличается от того же белка, осажденного путем высаливания, так как в первом случае он утрачивает нативные свойства, а во втором сохраняет. Это указывает на то, что механизм действия веществ, вызывающих денатурацию и высаливание, разный. При высаливании сохраняется нативная структура белка, а при денатурации разрушается.

Денатурирующие факторы делятся на

физические [показать].

К физическим факторам относятся: температура, давление, механическое воздействие, ультразвуковое и ионизирующее излучение.

Тепловая денатурация белков является наиболее изученным процессом. Она считалась одним из характерных признаков белков. Давно известно, что при нагревании белок свертывается (коагулирует) и выпадает в осадок. Большинство белков термолабильны, однако известны белки, очень устойчивые к нагреванию. Например, трипсин, химотрипсин, лизоцим, некоторые белки биологических мембран. Особой устойчивостью к температуре отличаются белки бактерий, обитающих в горячих источниках. Очевидно, у термостабильных белков тепловое движение полипептидных цепей, вызванное нагреванием, недостаточно для разрыва внутренних связей молекул белка. В изоэлектрической точке белки легче подвергаются тепловой денатурации. Этот прием используется в практической работе. Некоторые белки, наоборот, денатурируют при низкой температуре.

химические [показать].

К химическим факторам, вызывающим денатурацию, относятся: кислоты и щелочи, органические растворители (спирт, ацетон), детергенты (моющие средства), некоторые амиды (мочевина, соли гуанидина и т. д.), алкалоиды, тяжелые металлы (соли ртути, меди, бария, цинка, кадмия и т. д.). Механизм денатурирующего действия химических веществ зависит от их физико-химических свойств.

Кислоты и щелочи широко используются в качестве осадителей белков. Многие белки денатурируются при крайних значениях рН — ниже 2 или выше 10-11. Но некоторые белки устойчивы к действию кислот и щелочей. Например, гистоны и протамины не денатурируются даже при рН 2 или рН 10. Крепкие растворы этанола, ацетон тоже оказывают денатурирующее влияние на белки, хотя для некоторых белков эти органические растворители используются как высаливающие агенты.

Тяжелые металлы, алкалоиды издавна применяются как осадители; они образуют прочные связи с полярными группами белков и тем самым разрывают систему водородных и ионных связей.

Особо следует остановиться на мочевине и солях гуанидина, которые в больших коцентрациях (для мочевины 8 моль/л, для гуанидина гидрохлорида 2 моль/л) конкурируют пептидными группами за образование водородных связей. В результате происходит диссоциация на субъединицы у белков с четвертичной структурой, а затем и разворачивание полипептидных цепей. Это свойство мочевины настолько ярко, что его широко используют для доказательства наличия четвертичной структуры белка и значения его структурной организации в осуществлении физиологической функции.

Свойства денатурированных белков. Наиболее типичными для денатурированных белков являются следующие признаки.

Увеличение числа реактивных или функциональных групп по сравнению с нативной молекулой белка (функциональными группами называются группы боковых радикалов аминокислот: СООН, NН2, SН, ОН). Часть этих групп обычно находится внутри молекулы белка и не выявляется специальными реагентами. Развертывание полипептидной цепи при денатурации позволяет обнаружить эти дополнительные, или скрытые, группы.

Уменьшение растворимости и осаждение белка (связано с потерей гидратной оболочки, развертыванием молекулы белка с "обнажением" гидрофобных радикалов и нейтрализацией зарядов полярных групп).

Изменение конфигурации молекулы белка.

Потеря биологической активности, вызванная нарушением нативной структурной организации молекулы.

Более легкое расщепление протеолитическими ферментами по сравнению с нативным белком переход компактной нативной структуры в развернутую рыхлую форму облегчает доступ ферментов к пептидным связям белка, которые они разрушают.

Последнее качество денатурированного белка широко известно. Термическая или иная обработка продуктов, содержащих белки (главным образом мясные), способствует лучшему перевариванию их с помощью протеолитических ферментов желудочно-кишечного тракта. В желудке человека и животных вырабатывается природный денатурирующий агент — соляная кислота, которая, денатурируя белки, помогает их расщеплению ферментами. Однако наличие соляной кислоты и протеолитических ферментов не позволяет применять белковые лекарственные препараты через рот, ибо они денатурируются и тут же расщепляются, теряя биологическую активность.

Заметим также, что денатурирующие вещества, осаждающие белки, используются в биохимической практике с иными целями, чем высаливающие. Высаливание как прием применяется для выделения какого-то белка или группы белков, а денатурация для освобождения от белка смеси каких-либо веществ. Удаляя белок, можно получить безбелковый раствор или устранить действие этого белка.

6. Ренатурация(ренативация)

Ренатурация — восстановление пространственной структуры, нативных свойств и функций белка при очень коротком воздействии агентов.

Долго считалось, что денатурация необратима. Однако в некоторых случаях удаление денатурирующего агента (такие опыты были сделаны при использовании мочевины) восстанавливает биологическую активность белка. Процесс восстановления физико-химических и биологических свойств денатурированного белка называется ренатурацией или ренативацией. Если денатурированный белок (после удаления денатурирующих веществ) вновь самоорганизуется в исходную структуру, то восстанавливается и его биологическая активность.

7. Выделение и очистка белков.

Получение индивидуальных белков из биологического материала (тканей, органов, клеточных культур) требует проведения последовательных операций, включающих:

дробление биологического материала и разрушение клеточных мембран;

фракционирование органелл, содержащих те или иные белки;

экстракцию белков (перевод их в растворённое состояние);

разделение смеси белков на индивидуальные белки.

1. Методы разрушения тканей
и экстракции белков

Для разрушения биологического материала используют методы: гомогенизации ткани, метод попеременного замораживания и оттаивания, а также обработку клеток ультразвуком.

Гомогенизация биологического материала

Ткань, находящуюся в буферном растворе с определённым значением рН и концентрацией солей, помещают в стеклянный сосуд (гомогенизатор) с пестиком. Вращающийся пестик измельчает и растирает ткань о притёртые стенки сосуда.

Метод замораживания и оттаивания ткани

В результате попеременного замораживания и оттаивания образующиеся кристаллы льда разрушают оболочки клеток.

После разрушения ткани нерастворимые части осаждают центрифугированием. Последующее центрифугирование гомогената с разной скоростью позволяет получить отдельные фракции, содержащие клеточные ядра, митохондрии и другие органеллы, а также надосадочную жидкость, в которой находятся растворимые белки цитозоля клетки. Искомый белок будет содержаться в одной из этих фракций.

Экстракция белков, связанных с мембранами, и разрушение олигомерных белков на протомеры

Если искомый белок прочно связан с какими-либо структурами клетки, его необходимо перевести в раствор. Так, для разрушения гидрофобных взаимодействий между белками и липидами мембран в раствор добавляют детергенты; чаще всего используют тритон Х-100 или додецилсульфат натрия.

Механизм действия детергентов описан в разделе "Денатурация белков" (см. рис. 1-15). При действии детергентов обычно разрушаются и гидрофобные взаимодействия между протомерами в олигомерных белках.

Удаление из раствора небелковых веществ

Нуклеиновые кислоты, липиды и другие небелковые вещества можно удалить из раствора, используя их Особенные физико-химические свойства. Так, липиды легко удаляются из раствора добавлением органических растворителей, например ацетона. Однако воздействие должно быть кратковременным, так как ацетон вызывает денатурацию некоторых белков. Нуклеиновые кислоты осаждают добавлением в раствор стрептомицина.

2. Методы очистки белков

Наиболее трудоёмкий этап получения индивидуальных белков - их очистка от других белков, находящихся в растворе, полученном из данной ткани. Часто изучаемый белок присутствует в небольших количествах, составляющих доли процента от всех белков раствора.

Так как белки обладают конформационной лабильностью, при работе с белками следует избегать денатурирующих воздействий, поэтому выделение и очистка белков происходят при низких температурах.

На первых стадиях очистки белков целесообразно использовать методы, учитывающие какую-либо характерную особенность данного белка, например термостабильность или устойчивость в кислых растворах. Первыми методами очистки необходимо удалить из раствора основную массу балластных белков, которые значительно отличаются от выделяемого белка физико-химическими свойствами. Впоследствии применяют всё более тонкие методы очистки белка.

Очистка белков избирательной денатурацией

Большинство белков денатурирует и выпадает в осадок уже при кратковременном нагревании раствора до 50-70 °С или подкислении раствора до рН 5. Если выделяемый белок выдерживает эти условия, то с помощью избирательной денатурации можно удалить большую часть посторонних белков, отфильтровав выпавшие в осадок-белки, или осадить их центрифугированием.

Высаливание

Метод очистки белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочно-земельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония - (NH4)2SO4. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит

Для разделения белков часто используют хроматографические методы, основанные на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства.

Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор".

Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы.

Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул (рис. 1-55).

Так как гелевая структура сефадекса легко деформируется под давлением, гели стали заменять более жёсткими матрицами (сефактил, той-оперл), представляющими сферические гранулы с разными размерами пор. Выбора размеров пор в гранулах зависит от целей хроматографии.

Рис. 1-55. Разделение смеси белков методом гель-фильтрации.

Ультрацентрифугирование

Метод разделения также основан на различии в молекулярных массах белков. Скорость седиментации веществ в процессе вращения в ультрацентрифуге, где центробежное ускорение достигает 100 000-500 000 g, пропорционально их молекулярной массе. На поверхность буферного раствора, помещённого в кювету, наносят тонкий слой смеси белков. Кювету помещают в ротор ультрацентрифуги. При вращении ротора в течение 10-12 ч более крупные молекулы (с большей молекулярной массой) оседают в буферном растворе с большей скоростью. В результате в кювете происходит расслоение смеси белков на отдельные фракции с разной молекулярной массой (рис. 1-56). После расслоения белковых фракций дно кюветы прокаливают иглой и по каплям собирают содержимое небольшими порциями в пробирки.

Рис. 1-56. Кювета, заполненная буферным раствором с разделёнными белковыми фракциями.

Электрофорез белков

Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-).

Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так, при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, α1 глобулины, α2-глобулины, β-глобулины и γ-глобулины (рис. 1-57). Электрофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёрным). Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе.

Ионообменная хроматография

Так же как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий.

В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы.

Различают положительно заряженные анионообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например карбоксиметилцеллюлозу (КМ-цел-люлозу), содержащую анионные группы.

Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно

Рис. 1-57. Электрофорез белков сыворотки крови здорового человека на бумаге.

заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли, чаще всего NaCI, и разными значениями рН. Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли элюируются белки, слабо связанные с анионообменником. Постепенное увеличение концентрации соли или изменение рН, что меняет заряд белковой молекулы, приводит к выделению белковых фракций, в одной из которых находится искомый белок.

Аффинная хроматография, или хроматография по сродству

Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К ли-ганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом (рис. 1-58). Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом.

Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.

3. Очистка белков от низкомолекулярных
примесей

Для удаления низкомолекулярных соединений, в частности сульфата аммония после высаливания, применяют диализ. Метод основан на том, что через полупроницаемую мембрану,

Рис. 1-58. Аффинная хроматография.

пропускающую низкомолекулярные вещества, не проходят белки, имеющие более высокую молекулярную массу. В стакан большой ёмкости (около 1 л) с буферным раствором помещают полупроницаемый мешочек, заполненный раствором белка с солью.

Скорость выхода соли из мешочка в буферный раствор пропорциональна градиенту его концентраций по обе стороны от мембраны. По мере выхода соли из мешочка буферный раствор в стакане меняют.

Для очистки белков от низкомолекулярных примесей используют также метод гель-фильтрации (см. выше).

Для определения частоты (гомогенности) выделенного белка применяют методы с высокой разрешающей способностью, например электрофорез в полиакриламидном геле, высокоэффективная хроматография высокого давления. От чистоты лекарственного белкового препарата зависят его биологическая эффективность и аллергенность (т.е. способность вызывать аллергические реакции). Чем качественнее очищен препарат, тем меньше вероятность осложнений при его применении.

8. Классификация белков.

В организме человека содержится свыше 50 000 индивидуальных белков, отличающихся первичной структурой, конформацией, строением активного центра и функциями. Белки построены из 20 химически различных аминокислот, каждая из которых может занимать любое положение в полипептидной цепи. Кроме того, белки различаются количеством аминокислот, из которых они построены.

Однако большинство таких белков в среде должны принимать множество конформаций с приблизительно одинаковой энергией, но разными химическими свойствами и функциями. Поэтому в эволюции, по-видимому, была отобрана лишь небольшая часть возможных вариантов белков, которые способны принимать единственную стабильную конформацию.

Таким образом, первичная структура известных белков, отобранных эволюцией, обеспечивает исключительную стабильность одной из возможных конформаций, которая и определяет особенности функционирования данного белка.

Возникновение новых белков часто связано с незначительными изменениями в структуре уже имеющихся белков. Кроме того, благодаря генетическим механизмам, о которых будет сказано в разделе 4, белок с полезными свойствами или основная структурная часть этого белка могут входить в состав других белков. Такие белки, имеющие схожую последовательность аминокислот и родственные функции, объединяют в семейства родственных белков.

А. Классификация белков

До настоящего времен нет единой и стройной классификации, учитывающей различные параметры белков. В основе имеющихся классификаций обычно лежит один признак. Так, белки можно классифицировать:

по форме молекул (глобулярные или фибриллярные);

по молекулярной массе (низкомолекулярные, высокомолекулярные и др.);

по химическому строению (наличие или отсутствие небелковой части);

по выполняемым функциям (транспортные, защитные, структурные белки и др.);

по локализации в клетке (ядерные, цито-плазматические, лизосомальные и др.);

по локализации в организме (белки крови, печени, сердца и др.);

по возможности адаптивно регулировать количество данных белков: белки, синтезирующиеся с постоянной скоростью (конститутивные), и белки, синтез которых может усиливаться при воздействии факторов среды (индуцибельные);

по продолжительности жизни в клетке (от очень быстро обновляющихся белков, с Т1/2 менее 1 ч, до очень медленно обновляющихся белков, Т1/2 которых исчисляют неделями и месяцами);

по схожим участкам первичной структуры и родственным функциям (семейства белков).

Б. Классификация белков по форме молекул

Это одна из самых старых классификаций, которая делит белки на 2 группы: глобулярные ифибриллярные. К глобулярным относят белки, соотношение продольной и поперечной осей которых не превышает 1:10, а чаще составляет 1:3 или 1:4, т.е. белковая молекула имеет форму эллипса. Большинство индивидуальных белков человека относят к глобулярным белкам. Они имеют компактную структуру и многие из них, за счёт удаления гидрофобных радикалов внутрь молекулы, хорошо растворимы в воде. Наглядные примеры строения и функционирования глобулярных белков - рассмотренные выше миоглобин и гемоглобины.

Фибриллярные белки имеют вытянутую, нитевидную структуру, в которой соотношение продольной и поперечной осей составляет более 1:10. К фибриллярным белкам относят коллагены, эластин, кератин, выполняющие в организме человека структурную функцию, а также миозин, участвующий в мышечном сокращении, и фибрин - белок свёртывающей системы крови. На примере коллагенов и эластина рассмотрим особенности строения этих белков и связь их строения с функцией.

1. Строение и функции коллагенов

Коллагены - семейство родственных фибриллярных белков, секретируемых клетками соединительной ткани. Коллагены - самые распространённые белки не только межклеточного матрикса, но и организма в целом, они составляют около 1/4 всех белков организма человека. В межклеточном матриксе молекулы коллагена образуют полимеры, называемые фибриллами коллагена (более подробно это описано в разделе 15). Фибриллы коллагена обладают огромной прочностью и практически нерастяжимы. Они могут выдерживать нагрузку, в 10 000 раз превышающую их собственный вес. По прочности коллагеновые фибриллы превосходят прочность стальной проволоки того же сечения. Именно поэтому большое количество коллагеновых волокон, состоящих из коллагеновых фибрилл, входит в состав кожи, сухожилий, хрящей и костей.

Необычные механические свойства коллагенов связаны с их первичной и пространственной структурами. Молекулы коллагена состоят из трёх полипептидных цепей, называемых α-цепями. Идентифицировано более 20 α-цепей, большинство которых имеет в своём составе 1000 аминокислотных остатков, но цепи несколько отличаются аминокислотной последовательностью. В состав коллагенов могут входить три одинаковые или разные цепи.

Первичная структура α-цепей коллагена необычна, так как каждая третья аминокислота в полипептидной цепи представлена глицином, около 1/4 аминокислотных остатков составляют пролин или 4-гидроксипролин, около 11% - аланин. В коллагене отсутствуют такие аминокислоты, как цистеин и триптофан, α гистидин, метионин и тирозин находятся лишь в очень небольшом количестве. В составе первичной структуры α-цепи коллагена содержится также необычная аминокислота - гидроксилизин. Полипептидную цепь коллагена можно представить как последовательность триплетов Гли-X-Y, где X и Y могут быть любыми аминокислотами, но чаще в положении X стоит пролин, а в положении Y - гидроксипролин или гидроксилизин. Каждая из этих аминокислот имеет большое значение для формирования коллагеновых фибрилл.

Пролин благодаря своей структуре вызывает изгибы в полипептидной цепи, стабилизируя ле-возакрученную спиральную конформацию. На один виток спирали приходится 3 аминокислотных остатка, а не 3,6, как это характерно для вторичной структуры глобулярных белков. Спираль пептидной цепи коллагена стабилизирована не за счёт водородных связей (так как пролин их не образует), а силами стерического отталкивания пирролидиновых колец в остатках пролина. В результате расстояние между аминокислотными остатками по оси спирали увеличивается, и она оказывается более развёрнутой по сравнению с туго закрученной α-спиралью глобулярных белков.

Спирализованные полипептидные цепи, перевиваясь друг около друга, образуют трёхце-почечную правозакрученную суперспиральную молекулу, часто называемую тропоколлагеном (рис. 1-41). Цепи удерживаются друг около друга за счёт водородных связей, возникающих между амино- и карбоксильными группами пептидного остова разных полипептидных цепей, входящих в состав трёхспиральной молекулы. "Жёсткие" аминокислоты - пролин и гидроксипролин - ограничивают вращение полипептидного стержня и увеличивают тем самым стабильность тройной спирали. Глицин, имеющий вместо радикала атом водорода, всегда находится в месте пересечения цепей; отсутствие радикала позволяет цепям плотно прилегать друг к другу.

В результате такого скручивания пептидных остовов полипептидных цепей и наличия удлинённой структуры два других радикала из триады аминокислот Гли-X-Y оказываются на наружной поверхности молекулы тропоколлагена. Некоторые комплементарные участки молекул тропоколлагена могут объединяться друг с другом, формируя коллагеновые фибриллы, причём эти участки расположены таким образом, что одна нить тропоколлагена сдвинута по отношению к другой примерно на 1/4 (рис. 1-42). Между радикалами аминокислот возникают ионные, водородные и гидрофобные связи.

Рис. 1-41. Строение молекулы тропоколлагена (фрагмент).

Рис. 1-42. Строение коллагеновой фибриллы (фрагмент).

Важную роль в формировании коллагеновых фибрилл играют модифицированные аминокислоты: гидроксипролин и гидроксилизин. Гидроксильные группы гидроксипролина соседних цепей тропоколлагена образуют водородные связи, укрепляющие структуру коллагеновых фибрилл. Радикалы лизина и гидроксилизина необходимы для образования прочных поперечных сшивок между молекулами тропоколлагена, ещё сильнее укрепляющие структуру коллагеновых фибрилл. Кроме того, к гидроксильной группе гидроксилизина могут присоединяться углеводные остатки (гликозилирование коллагена), функция которых пока неясна.

Таким образом, аминокислотная последовательность полипептидных цепей коллагена позволяет сформировать уникальную по своим механическим свойствам структуру, обладающую огромной прочностью. Изменение в первичной структуре коллагена может приводить к развитию наследственных болезней (см. раздел 15).

2. Строение и функция эластина

В отличие от коллагена, образующего прочные фибриллы, способные выдержать большие нагрузки, эластин (также белок межклеточного матрикса) обладает резиноподобными свойствами. Нити эластина, содержащиеся в тканях лёгких, в стенках сосудов, в эластичных связках, могут быть растянуты в несколько раз по сравнению с их обычной длиной, но после снятия нагрузки они возвращаются к свёрнутой конформации.

Эластин содержит в составе около 800 аминокислотных остатков, среди которых преобладают аминокислоты с неполярными радикалами, такие как глицин, валин, аланин. Эластин содержит довольно много пролина и лизина, но лишь немного гидроксипролина; полностью отсутствует гидроксилизин.

Наличие большого количества гидрофобных радикалов препятствует созданию стабильной глобулы, в результате полипептидные цепи эластина не формируют регулярные вторичную и третичную структуры, а принимают в межклеточном матриксе разные конформации с примерно равной свободной энергией (рис., 1-43). Это как раз тот случай строения первичной структуры, когда отсутствие одной стабильной упорядоченной конформации приводит к возникновению необходимых белку свойств.

Более подробно особенности строения и функционирования эластина рассмотрены в разделе 15.

В. Классификация белков по химическому строению

1. Простые белки

Некоторые белки содержат в своём составе только полипептидные цепи, состоящие из аминокислотных остатков. Их называют "простые белки". Примером простых белков могут служить основные белки хроматина - гистоны; в их составе содержится много аминокислотных остатков лизина и аргинина, радикалы которых имеют положительный заряд (более подробно гистоны описаны в разделе 4). Рассмотренный выше белок межклеточного матрикса эластин также относят к простым белкам.

Рис. 1-43. Случайные конформации молекулы эластина.

2. Сложные белки

Однако очень многие белки, кроме полипептидных цепей, содержат в своём составе небелковую часть, присоединённую к белку слабыми или ковалентными связями. Небелковая часть может быть представлена ионами металлов, какими-либо органическими молекулами с низкой или высокой молекулярной массой. Такие белки называют "сложные белки". Прочно связанная с белком небелковая часть носит название простетической группы.

Простетическая группа может быть представлена веществами разной природы. Например, белки, соединённые с гемом, носят название гемопротеины. В состав гемопротеинов, кроме уже рассмотренных выше белков гемоглобинов и миоглобина, входят ферменты - цитохромы, каталаза и пероксидаза. Гем, присоединённый к разным белковым структурам, выполняет в них характерные для каждого из белков функции (например, в составе гемоглобина переносит О2, а в составе цитохромов - электроны).

Белки, соединённые с остатком фосфорной кислоты, называют фосфопротеинами. Фосфорные остатки присоединяются сложноэфирной связью к гидроксильным группам серина, треонина или тирозина при участии ферментов, называемых протеинкиназами.

В состав белков часто входят углеводные остатки, придающие белкам дополнительную специфичность и часто уменьшающие скорость их ферментативного протеолиза. Такие белки носят название гликопротеинов. Многие белки крови, а также рецепторные белки клеточной поверхности относят к гликопротеинам.

Белки, функционирующие в комплексе с липидами, называют липопротеинами, а в комплексе с металлами - металлопротеинами.

Сложный белок, состоящий из белковой части (апопротеин) и небелковой части (простетическая группа), называют "холопротеин".

Г. Классификация белков по функциям

Белки выполняют в клетках множество биологических функций. По признаку сходства выполняемых белками функций их можно разделить на следующие большие группы.

1. Ферменты

Ферменты - специализированные белки, ускоряющие течение химических реакций. Благодаря ферментам в клетке скорости химических реакций возрастают в миллионы раз. Так как ферменты, как и любые белки, имеют активный центр, они специфически связывают определённый лиганд (или группу похожих лигандов) и катализируют определённый тип химического превращения данной молекулы. В настоящее время известно около 2000 различных ферментов, ускоряющих различные химические реакции. Например, протеолитический фермент трипсин разрушает в белках пептидные связи, образованные карбоксильной группой основных аминокислот - аргинина или лизина. Фермент рибонуклеаза расщепляет фосфоэфирную связь между нуклеотидами в полинуклеотидной цепи.

Благодаря набору ферментов в клетках превращения поступающих в них веществ протекают не хаотично, а в строго определённых направлениях.

2. Регуляторные белки

Крегуляторным белкам относят большую группу белковых гормонов, участвующих в поддержании постоянства внутренней среды организма, которые воздействуют на специфические клетки-мишени. Например, гормон инсулин выделяется в кровь при повышении концентрации глюкозы в крови после еды и, стимулируя использование глюкозы клетками, снижает концентрацию глюкозы до нормы, т.е. восстанавливает гомеостаз.

Кроме того, к регуляторным относят белки, присоединение которых к другим белкам или иным структурам клетки регулирует их функцию. Например, белок кальмодулин в комплексе с четырьмя ионами Са2+ может присоединяться к некоторым ферментам, меняя их активность.

Регуляторные ДНК-связывающие белки, присоединяясь в определённые моменты к специфичным участкам ДНК, могут регулировать скорость считывания генетической информации (они описаны в разделе 4).

3. Рецепторные белки

Сигнальные молекулы (гормоны, нейромедиаторы) действуют на внутриклеточные процессы через взаимодействие со специфическими белками-рецепторами. Так, гормоны, циркулирующие в крови, находят клетки-мишени и воздействуют на них, специфично связываясь с белками-рецепторами, обычно встроенными в клеточную мембрану. Для гидрофобных регуляторных молекул, проходящих через клеточную мембрану, рецепторы локализуются в цитоплазме клеток.

4. Транспортные белки

Многие белки крови участвуют в переносе специфических лигандов из одного органа к другому. Часто в комплексе с белками переносятся молекулы, плохо растворимые в воде. Так, белок плазмы крови альбумин переносит жирные кислоты и билирубин (продукт распада тема), а гемоглобин эритроцитов участвует в переносе О2 от лёгких к тканям. Стероидные гормоны переносятся в крови специфическими транспортными белками.

Транспортные белки участвуют также в переносе гидрофильных веществ через гидрофобные мембраны. Так как транспортные белки обладают свойством специфичности взаимодействия с лигандами, их набор в клеточной мембране определяет, какие гидрофильные молекулы могут пройти в данную клетку. С помощью белков-переносчиков в клетку проникают глюкоза, аминокислоты, ионы и другие молекулы.

5. Структурные белки

Некоторые белки, расположенные определённым образом в тканях, придают им форму, создают опору, определяют механические свойства данной ткани. Например, как уже говорилось выше, главным компонентом хрящей и сухожилий является фибриллярный белок коллаген, имеющий высокую прочность. Другой структурный белок (эластин) благодаря своему уникальному строению обеспечивает определённым тканям свойство растягиваться во всех направлениях (сосуды, лёгкие).

6. Защитные белки

Некоторые белки, в частности иммуноглобулины, обладают способностью узнавать и связывать чужеродные молекулы, вирусные частицы и бактерии, в результате чего происходит их нейтрализация. Кроме того, комплекс чужеродной частицы с иммуноглобулином легко узнаётся и уничтожается клетками иммунной системы.

Защитными свойствами обладают белки свёртывающей системы крови, например фибриноген, тромбин. Они участвуют в формировании тромба, который закупоривает повреждённый сосуд и препятствует потере крови.

7. Сократительные белки

Некоторые белки при выполнении своих функций наделяют клетку способностью либо сокращаться, либо передвигаться. К таким белкам относят актин и миозин - фибриллярные белки, участвующие в сокращении скелетных мышц. Другой пример таких белков - тубулин, из которого построены клеточные органеллы - микротрубочки. Микротрубочки в период деления клетки регулируют расхождение хроматид. Микротрубочки - важные элементы ресничек и жгутиков, с помощью которых клетки передвигаются.

Однако существует большое количество белков, имеющих уникальные функции, которые не вошли в эту довольно простую классификацию.

Д. Cемейства родственных белков

В ходе эволюции в пределах одного биологического вида замены аминокислотных остатков могут приводить к возникновению разных белков, выполняющих родственные функции и имеющих гомологичные последовательности аминокислот. Гомологичными называют последовательности, имеющие много сходных черт. Они содержат во многих положениях одни и те же аминокислоты, называемые инвариантными, а в некоторых положениях могут находиться разные, но близкие по физико-химическим свойствам аминокислотные остатки.

Эти белки имеют поразительно схожие конформации: количество и взаиморасположение α-спиралей и/или β-структур, большинство поворотов и изгибов полипептидных цепей сходно или идентично. Такие белки, имеющие гомологичные участки полипептидной цепи, сходную конформацию и родственные функции, выделяют в семейства белков.

Пример семейства родственных белков - семейство миоглобина, куда включены, кроме самого миоглобина, и все виды гемоглобина.

1. Семейство сериновых протеаз

К семейству родственных белков относят сериновые протеазы. Это семейство ферментов, которые используют уникально активированный остаток серина, расположенный в активном центре, для связывания и каталитического гидролиза пептидных связей в белковых субстратах. Мишени для сериновых протеаз - специфические пептидные связи в белках (часто в других сериновых протеазах).

Для всех белков этого семейства характерно наличие в активном центре остатков Сер195, Гис57, Асп102 (эту нумерацию используют независимо от их точного расположения в первичной структуре определённых сериновых протеаз). Выявлена также высокая схожесть их пространственных структур, несмотря на то, что только в 40% положений они содержат идентичные аминокислоты (рис. 1-44). Каталитический участок сериновых протеаз расположен в расщелине между двумя доменами.

Некоторые аминокислотные замены привели к изменению субстратной специфичности этих белков и к возникновению функционального многообразия внутри этого семейства. Так, пищеварительные сериновые протеазы участвуют в переваривании (гидролитическом расщеплении пептидных связей) денатурированных пищевых белков. К ним относят трипсин, химотрипсин, эластазу, но каждый из этих ферментов предпочитает разрывать пептидные связи, образованные определёнными аминокислотами.

Рис. 1-44. Пространственные структуры эластазы (А) и химотрипсина (Б).

Ещё большей субстратной специфичностью обладают сериновые протеазы, участвующие в тщательно контролируемых физиологических процессах, таких как активация каскада белков свёртывания крови, фибринолиза, активация белков системы комплемента, образования белковых гормонов. В процессе активации нативных белков сериновые протеазы гидролизуют одну или две особенные пептидные связи из сотен связей, имеющихся в белковом субстрате. Это связано с тем, что в нативном белке фермент узнаёт не только аминокислоты, непосредственно формирующие пептидную связь, но и некоторые аминокислотные остатки, окружающие связь, подвергающуюся ферментативному гидролизу.

2. Суперсемейство иммуноглобулинов

В работе иммунной системы огромную роль играют белки, относящиеся к суперсемейству иммуноглобулинов. Это суперсемейство включает по крайней мере три больших семейства белков, участвующих в иммунной защите организма: семейство иммуноглобулинов, семейство Т-клеточных антигенраспознающих рецепторов и белки главного комплекса гистосовместимости I и II классов, которые в литературе обозначают МНС (от англ, major histocompatibility complex). В это суперсемейство включено также семейство адгезивных белков, участвующих в узнавании определённых типов клеток и их межклеточных взаимодействиях.

Основной критерий включения белков в суперсемейство иммуноглобулинов - их доменная организация, достоверная гомология аминокислотных последовательностей и пространственных структур отдельных доменов. Кроме того, белки этого суперсемейства имеют схожие функции: иммуноглобулины взаимодействуют с чужеродными структурами, находящимися в крови, лимфе, межклеточной жидкости или секретах желёз, а рецепторы Т-лимфоцитов и белки главного комплекса гистосовместимости - с антигенами, находящимися на поверхности клеток данного организма.

3. Семейство иммуноглобулинов

Иммуноглобулины, или антитела, - специфические белки, вырабатываемые В-лимфоцитами в ответ на попадание в организм чужеродных структур, называемых антигенами. В организме человека вырабатывается около 107 клонов В-лимфоцитов, каждый из которых специализирован на выработке одного из 107 видов иммуноглобулинов.

Все иммуноглобулины характеризуются общим планом строения, который мы рассмотрим на примере строения IgG.

Молекула IgG состоит из четырёх полипептидных цепей: двух идентичных лёгких (L - от англ,light), содержащих около 220 аминокислотных остатков, и двух тяжёлых (Н - от англ. heavy), состоящих из 440 аминокислот каждая. Все 4 цепи соединены друг с другом множеством нековалентных и четырьмя дисульфидными связями. Поэтому молекулу IgG относят к мономерам.

Лёгкие цепи IgG состоят из 2 доменов: вариабельного (VL), находящегося в N-концевой области полипептидной цепи, и константного (CL), расположенного на С-конце. Каждый из доменов состоит из 2 слоев с β-складчатой структурой, где участки полипептидной цепи лежат антипараллельно. β-Слои связаны ковалентно дисульфидной связью примерно в середине домена (рис. 1-45).

Тяжёлые цепи IgG имеют 4 домена: один вариабельный (VH), находящийся на N-конце, и три константных (СН1, СН2, СH3). Домены тяжёлых цепей IgG имеют гомологичное строение с доменами лёгких цепей. Между двумя константными доменами тяжёлых цепей СH1, и СН2 есть участок, содержащий большое количество остатков пролина, которые препятствуют формированию вторичной структуры и взаимодействию соседних Н-цепей на этом отрезке. Этот участок называют "шарнирной областью"; он придаёт молекуле гибкость.

Между вариабельными доменами тяжёлых и лёгких цепей находятся два идентичных участка, связывающих два одинаковых специфических антигена; поэтому такие антитела часто называют"биваленты". В связывании антигена с антителом участвует не вся аминокислотная последовательность вариабельных доменов обеих цепей, а всего лишь 20-30 аминокислот, расположенных в гипервариабельных областях каждой цепи. Именно эти области определяют уникальные способности каждого клона антител

Рис. 1-45. Строение иммуноглобулина G.

взаимодействовать с соответствующим (комплементарным) антигеном.

Основные функции антител - обнаружение и связывание чужеродных антигенов, находящихся в организме вне его клеток (в крови, лимфе, межклеточной жидкости, в слизистых секретах). Это происходит с помощью специфических антигенсвязывающих участков разных клонов иммуноглобулинов. Кроме, того, благодаря связыванию антигена с антителом облегчается процесс дальнейшего разрушения чужеродных веществ. Специфичность пути разрушения комплекса антиген-антитело зависит от класса антител.

Классы иммуноглобулинов. Существует 5 классов тяжёлых цепей иммуноглобулинов, отличающихся по строению константных доменов: α, δ, ξ, γ и μ. В соответствии с ними различают 5 классов иммуноглобулинов: A, D, Е, G и М. Особенности строения тяжёлых цепей придают их "шарнирным участкам" и С-концевым областям характерную для каждого класса конформацию. Связывание антигена с антителом изменяет конформацию константных доменов тяжёлых цепей, что определяет путь разрушения комплекса в организме (связывание с белками системы комплемента или поглощение комплекса фагоцитирующими клетками).

Иммуноглобулины М - первый класс антител, синтезирующийся в развивающихся В-лимфоцитах. Различают 2 формы иммуноглобулинов М: мономерная, мембранно-связанная форма и пентамерная, секретируемая В-лимфоцитами в кровь.

Мембранно-с вязанная форма иммуноглобулинов М. Созревающие В-лимфоциты синтезируют мономерные бивалентные молекулы IgM, по структуре похожие на рассматриваемые выше IgG, которые встраиваются в плазматическую мембрану клеток и играют роль первых антиген-распознающих рецепторов. Прикрепление IgM к мембране осуществляется с помощью гидрофобного участка, находящегося в С-концевой ("хвостовой") области тяжёлых цепей, содержащей 25 гидрофобных аминокислотных остатков.

Взаимодействие антигена с рецептором на поверхности В-лимфоцита вызывает его размножение и образование целого клона лимфоцитов, происходящих из одной, стимулированной антигеном клетки. Этот клон В-лимфоцитов будет вырабатывать иммуноглобулины с одинаковыми антигенсвязывающими участками. Однако В-лимфоциты способны переключаться на выработку других классов антител.

Секреторная форма иммуноглобулинов М. Когда В-лимфоциты впервые встречаются в жидкостях организма с неизвестным ранее антигеном, они синтезируют и секретируют в кровь IgM, которые содержат пять мономерных субъединиц, связанных друг с другом дисульфидными связями и дополнительной полипептидной J-цепью (рис. 1-46).

В тяжёлых цепях их мономеров отсутствует гидрофобная "хвостовая" часть. Пентамерная молекула содержит 10 участков связывания с антигеном, что облегчает вероятность прикрепления Неизвестного ранее антигена к иммуноглобулину (рис. 1-47).

Взаимодействие антигена с IgM изменяет его конформацию и индуцирует связывание его "хвостовой" области с первым компонентом системы комплемента. Если антиген расположен на поверхности микроорганизма, активирование системы комплемента вызывает нарушение целостности клеточной мембраны и гибель бактериальной клетки.

Иммуноглобулины G. В количественном отношении IgG доминируют в крови и составляют около 75% от общего количества этих белков. Строение IgG подробно описано выше. В крови IgG обнаруживают только в мономерной форме; он секретируется активированными В-лимфоцитами в больших количествах при вторичном иммунном ответе, когда антиген повторно попадает в организм.

У человека обнаружено 4 подкласса IgG: IgGg1, IgGg2, IgGg3, IgGg4. Порядковый номер указывает на количественное содержание каждого подкласса в сыворотке (в наибольшем количестве содержится IgGg1 а в наименьшем - IgGg4). Степень гомологии между этими подклассами очень высока (около 90-95%).

Рис. 1-46. Строение пентамерной секреторной молекулы иммуноглобулина М.

Рис. 1-47. Связывание IgM с антигенами бактериальных клеток и их разрушение активированными белками системы комплемента.

Рис. 1-48. Фагоцитоз комплекса антиген-антитело нейтрофилом. А - взаимодействие бактерии, покрытой IgG, с рецепторами нейтрофилов; Б - поглощение бактерии нейтрофилом; В - переваривание бактерии внутри фагосомы нейтрофила.

IgG не только эффективно связывают и инактивируют чужеродные молекулы и клетки, попавшие в организм, но также облегчают их дальнейшее уничтожение. Конформационные изменения в "хвостовой" области IgG после его взаимодействия с антигеном приводят к связыванию и активации белков системы комплемента. Кроме того, С-концевая область IgG способна взаимодействовать со специфическими рецепторами макрофагов и нейтрофилов, что приводит к фагоцитозу комплексов антиген-антитело и разрушению их в фагосомах (рис. 1-48).

IgG - единственный класс антител, способный проникать через плацентарный барьер и обеспечивать внутриутробную защиту плода от инфекций.

Иммуноглобулины А. Основной класс антител, присутствующий в секретах желёз организма (слюны, молока, пищеварительного сока, секретов дыхательных путей). В сыворотке крови его содержание не превышает 10-15% от общего количества иммуноглобулинов. Мономерная форма по строению напоминает IgG. Однако в секретах IgA находится в основном в форме димера, где мономеры соединены дополнительной пептидной цепью J (рис. 1-49).

На базальной поверхности эпителиальных клеток димер IgA специфически взаимодействует с белками клеточной поверхности, называемыми секреторным компонентом. Образующийся комплекс посредством эндоцитоза поглощается внутрь клетки и перемещается к апикальной части. Здесь комплекс подвергается действию протеолитических ферментов, и свободный димер высвобождается во внеклеточное пространство (рис. 1-50).

Образующийся при взаимодействии IgA с антигеном комплекс не взаимодействует с белками системы комплемента и фагоцитирующими клетками, но препятствует прикреплению антигенов к поверхности эпителиальных клеток и проникновению их в организм.

Иммуноглобулины Е. Содержание этого класса иммуноглобулинов в крови крайне мало. IgE - мономеры, но, в отличие от IgG, их тяжёлые цепи е содержат не 3, а 4 константных домена. После синтеза и секреции в кровь В-лимфоцитами IgE связываются своими С-концевыми участками с соответствующими рецепторами на поверхности тучных клеток и базофилов. В результате они становятся рецепторами антигенов на поверхности данных клеток (рис. 1-51).

Дата добавления: 2015-10-21