Восходящая тонкослойная хроматография

ТОНКОСЛОЙНАЯ

ХРОМАТОГРАФИЯ

(ТСХ)

(Н.А. Измайлов, М.С. Шрайбер

1938 г.)

Техника выполнения ТСХ

Восходящая тонкослойная хроматография

Нисходящая и горизонтальная ТСХ

Двумерная ТСХ

2 место нанесения 1

пробы

ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

НЕПОДВИЖНАЯ ФАЗА ПОДВИЖНАЯ ФАЗА

Силикагель (полярная фаза).

Оксид алюминия(полярная фаза).

Флорисил. Основной силикат магния - по полярности занимает промежуточное положение между оксидом алюминия и силикагелем. Применяют в анализе флавоноидов, стероидов, ацетилированных углеводородов.

Кизельгур (диатомитовая земля). Применяется главным образом для разделения сильно полярных соединений по адсорбционному механизму.

Целлюлоза

Обращенно-фазовые сорбенты

Различные органические растворители и их смеси:

Пентан

н-Гексан

Циклогексан

Четыреххлористый углерод

Толуол

Хлороформ

Дихлорметан

Диэтиловый эфир

Уксусная кислота

Ацетон

Этанол

Метанол

Пиридин

ДЕТЕКТИРОВАНИЕ В ТСХ

1. УФ детектирование

2. Химические методы -пары йода

-опрыскивание раствором реагента -погружение в раствор реагента

Основные параметры разделения в ТСХ

l

^L R = у R} = 1 - (1 - Я} у

Ь с*

R_s =

2D l

(W + W₂)

N = 16(—)²

W

НЕКОТОРЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ТСХ- И ВЭТСХ-

ПЛАСТИНОК

Характеристики	ТСХ	ВЭТСХ
Средний размер частиц, мкм	11-20	5-7
Толщина слоя, мкм		5-7
Длина пробега фронта растворителя,	10-15	3-5
см		5-10
Количество растворителя, мл		0,1
Предел детектирования, мкг:	2-4
Диаметр пятна, мм

КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА В ТСХ

1.Определение с удалением зоны вещества с пластинки

2.Определение по площади пятна

3. Метод разбавления

4. Метод денситометрии

5. Метод видеоденситометрии

6. Денситометрия с планшетным

ДЕНСИТОМЕТР ДЕНСКАН-04 (САНКТ-ПЕТЕРБУРГ, НТЦ «ЛЕНХРОМ»)

;(Л,# ™,>с^ сф чК¹*eg, «*,.СЛ «^.{♦>., ’ *^.>ф.»/Oft ^

ДЕНСИТОМЕТРИЯ

А) ВИДЕОДЕНСИТОМЕТРИЯ; Б) СКАНИРОВАНИЕ

а

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ

ЖИДКОСТНАЯ

ХРОМАТОГРАФИЯ

(ВЭЖХ)

* ВЭЖХ - это скоростной метод анализа, в котором подвижная фаза (жидкость) подается при высоком давлении, неподвижная фаза имеет размер частиц 3­10 мкм, что обеспечивает высокую эффективность разделения в этом методе

Применение ВЭЖХ

■ Г осударственные лаборатории

■ Независимые лаборатории

■ Органическая химия

■ Биотехнология

■ Учебные организации

■ Фармация

■ Прочее

Преимущества ВЭЖХ

• Высочайшая селективность

• Надежность результатов

• Многокомпонентность анализа

• Низкие пределы обнаружения (0.1 мкг/л)

• Широкий диапазон линейности (1­1000 мкг/л)

• Малый расход пробы (1 мл)

• Экспрессность анализа

• Простота эксплуатации и возможность полной автоматизации

^Варианты ВЭЖХ

*Нормально-фазовая хроматография- подвижная фаза менее полярная, чем неподвижная фаза

*Обращенно-фазовая хроматография- подвижная фаза более полярная, чем неподвижная фаза

Обращенно-фазовая

хроматография

п / \

Полярный растворитель

►

Нормально-фазовая

хроматография

п / \

Неполярный растворитель

►

Схема жидкостного хроматографа

Г
с	■
■	(

Резервуар с элюентом Насос (блок подачи ПФ)

Инжектор (блок ввода пробы) Хроматографическая колонка Детектор

Блок регистрации (управления, обработки)

Дополнительные блоки:

Дегазирующее устройство

Автосамплер

Термостат колонок

Коллектор фракций

Пред- и/или постколоночный реактор

хроматографических систем

Емкость с элюентом

Ввод пробы

Жидкостный хроматограф LC-10

(SHIMADZU)

>V-

Жидкостный хроматограф LC-20

(SHIMADZU)

Модульный жидкостный хроматограф ЛЮМАХРОМ

Госреестр СИ РФ №30350-08

Жидкостный хроматограф ЛЮМАХРОМ Базовый блок на основе насоса ПИТОН-3, детекторы:

•фотометрический (254 нм)

•спектрофотометрический (190-360 нм)

•флуориметрический (фильтровый)

•спектрофлуориметрический

* Модульный жидкостный хроматограф ЛЮМАХРОМ

ГосреестрСИ РФ №30350-05

Фотометрический тор флуориметрический Базовый Спекторофлуориметрический

детектор детектор блок детектор Люмахром СФЛД 2310

Люмахром ФД 3110 Люмахром ФЛД 2410 Флюорат-02-Панорама

Флюорат-02-2М

спектрометр

Способы подачи подвижной фазы

• 1. Изократический режим-состав подвижной фазы не изменяется во время всего процесса хроматографирования;

• 2. Градиентный режим-состав подвижной фазы изменяется по специальной программе для достижения более эффективного разделения компонентов смеси

ПОДВИЖНАЯ ФАЗА (ПФ)

> Функции:

^Перемещение зоны компонента по колонке (транспортная)

Участие в процессе разделения

Требования к растворителям - компонентам ПФ:

Чистота, отсутствие механических примесей

^Химическая инертность (по отношению к сорбенту и аналитам)

^Совместимость с детектором

Очень важно:

ПФ должна быть обязательно отфильтрована и

дегазирована!

* ПФ для анализа в ВЭЖХ

Обращено-фазовая хроматография

* Подвижная фаза более полярная, чем неподвижная фаза

* Ацетонитрил-вода

* Метанол-вода

* Тнсжф [1] "

* Фосфатные буферы, уксусная кислота

Нормально­фазовая хроматография

* Подвижная фаза менее полярная, чем неподвижная

* Подвижная фаза: гексан + этила цетат, хлороформ

* (недостаток-содержат влагу)

Насос

(блок подачи ПФ (здюентз))

Требования к насосу:

■ химическая инертность по отношению к ПФ

■ высокое рабочее давление

■ высокая стабильность скорости потока

■ отсутствие пульсаций

Тип жидкостной хроматографии	Расход элюента, мл/мин
Стандартная аналитическая	0,2 - 5
Аналитическая микроколоночная	0,001 - 0,25

УСТРОЙСТВО ПЕТЛЕВОГО ДОЗАТОРА ДЛЯ ВЭЖХ

Входноесныерстие

для иглы

I Oi насоса

Петля

Колонки и предколонки

Нормально-фазовая хроматография

Неподвижная фаза: силикагель, оксид алюминия

OH---OH OH

^{водород-связанные} силоксановые силанольные ^группы группы группы

Обращенно-фазовая

хроматография

Неподвижные фазы

химически модифицированные силикагели: С2, С4, С8, С16, С18, С22, С30

Обращенно-фазовая хроматография

Подвижная фаза более полярная, чем неподвижная фаза, первым из колонки выходит более полярное соединение

О о CI о о

Silica Surface Alkyl Si I a ne Reagent Silica Surface w/ Alkyl Chain

Неподвижные фазы

химически модифицированные силикагели: радикалы: цианопропил, аминопропил, оксипропил (слабополярные)

С2,С4, С8, С16, С18, С22,фенил (неполярные)

рН от 2-9, лучше 3-7 ³⁵

Схематическое изображение сорбентов с химически

связанными фазами

Потеря привитой связи за счет гидролиза силоксановых связей при

рН<3.

Полное растворение силикагелевой матрицы при рН>8.

ДЕТЕКТОРЫ

Спектрофотометрический

Флюориметрический

Масс-спектрометрические детекторы Agilent

ДДМ

Диодноматричный детектор. Диапазон длин волн 190 - 800 нм. Количество диодов 512; измерительная ячейка: проточная, термостатируемая. Возможность создания библиотек спектров, возможность комплектации библиотекой спектров. Библиотека УФ-спектров экотоксикантов для детектора диодная матрица включает 2682 UV спектра веществ, важных для токсикологии: наркотики, лекарственные препараты, вызывающие зависимость, антиэпилептики, важнейшие классы лекарств (анальгетики, стероиды, антибиотики, антигистаминные и др.), растительные яды, пестициды, фунгициды, гербициды, ПАУ, ПХБ и др. экологические загрязнители.

Оптическая часть УФ-детевстора с перестраиваемой Л/1ИНОЙ волны.

1 - рабочий фотодиод;

2- проточная ячейка;

3- фотодиод сравнения,

*4- дифрг»*г циои ная решетка;

5- зеркало;

6- оптический фильтр,

7- дейтериевая лампа

Оптическая масть» детектора с фотодиодной л пне и кои

дейтеривая лампа;

2- линзы;

3- заслонка;

4- проточная ячейка;

5- диодная матрица;

6- дифракционная рещеггка.

Формула расчета содержания витамина г- исслзд'уемом соединении.

1'де

Pst-C

Psb- площадь пика испытуем. го раствора витамина; F*st- площадь пика стандартного р^^гзора;

F- фактор разведения; с- навеска препарата, мг;

/V- навеска стандартного вещества, мг;

В- масса 1 таблетки, мг.

Трехмерная диаграмма с фотодиодной матрицей при определении фенантрена.

Хроматограмма смеси витаминов в поливитаминном препарате

Bisphenol A (BPA)

bisphenol A

Bisphenol A

Building block in polycarbonate plastics (bottle CD/DVD...)

Constituent in epoxy resins (protective coatings of cans) Dental sealants and composites

Health risk? Xeno-estrogens, mimic endogenous estrogens.

Bottled water

Chocolate

• Chocolate and Nutella

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Fig. 15: Chromatogram of Nutella (Nestle), extracted and diluted 50X; 1= EGC, 2= EC

I I I I I I I I I I I

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Fig. 13: Chromatogram of Milk chocolate (Tresor, the Convenience company), extracted and diluted 50X; 1= EGC, 2= EC

Fig. 14: Chromatogram of Dark chocolate (Albert Heijn), extracted and diluted 50X; 1= EGC, 2= EC

[1] Ион-парные реагенты

Дата добавления: 2015-09-30