Тимус акуратно видаляли та дезінтегрували без використання ферментів у середовище, яке містить збалансований сольовий розчин Хенкса (середовище 199; RPMI-1640; середовище Ігла): 3 мМ Na2HPO4, 5 мМ

Хід роботи.

Тимус акуратно видаляли та дезінтегрували без використання ферментів у середовище, яке містить збалансований сольовий розчин Хенкса (середовище 199; RPMI-1640; середовище Ігла): 3 мМ Na₂HPO_4, 5 мМ KСl, 120 мМ NaCl, 1 мМ CaCl₂, 10 мМ глюкоза, 0,5 мМ MgSO₄ та 10 мМ трис; pH 7,2-7,4.

Можна використовувати натрій-фосфатний буфер (PBS): 140 мМ NaCl, 2,7 мМ KСl, 8,1 мМ Na₂HPO_4, 1,5 мМ КH₂PO₄; pH 7,2-7,4.

Орган старанно перетирали через нейлонову сітку (певний розмір пор) в об’ємі середовища виділення (10мл). Після чого суспензію клітин відстоювали 3-5 хв. і центрифугували при 300g (1,5-2 тис.oб/хв) 7-10хв. Отриманий осад акуратно ресуспендували у 1мл середовища виділення; важливо не спінювати суспензію клітин для запобігання гідродинамічній деструкції. Клітини відмивали у 10 мл середовища 1-2 рази з подальшим центрифугуванням при 300g. У результаті отримували фракцію клітин, загальна назва яких – тимоцити.

Реактиви.

1). 5 мл 0,1% розчину NaOH.

2). Робочий розчин тріомбрасту: до 43 мл дистильованої води додати 10 мл 76% тріомбрасту (кінцева концентрація 14,3%) та 0,5 мл 0,1% розчину NaOH (зберігати при 4⁰С у темному посуді впродовж 14 діб).

Хід роботи.

600 мг (700 мг) селезінки подрібнювали у чашці Петрі в 10 мл середовища Хенкса з 10 мМ трис (pH 7,3-7,4): акуратно розщипували селезінку двома пінцетами, при цьому клітини вивільнялись зі строми; процес продовжували до тих пір, допоки це можливо. Залишки тканини та вміст чашки Петрі ще додатково перетирали через нейлонову сітку (певний розмір пор). Після чого суспензію переносили у мірні пробірки та відстоювали впродовж 10 хв. Осад відділяли, до надосадової рідини додавали середовище виділення до 10 мл.

У центрифужні пробірки вносили по 5 мл суспензії, обережно підшаровували 3 мл робочого розчину тріомбрасту та центрифугували при 1000g впродовж 40 хв.

Клітинну суспензію, зібрану на межі розподілу фаз, двічі відмивали у 5 та 2 мл середовища виділення, центрифугуючи при 300 g, 10 хв.

У результаті отримували фракцію клітин, загальна назва яких – спленоцити.

При виділенні перитонеальних макрофагів щурам вводили внутрішньочеревинно 3-5 мл середовища виділення клітин, наведеного вище. Введення проводили обережно, трохи піднімаючи черевну стінку пінцетом. Після ін’єкції нетривало (1-2 хв) пальпували черево для відмивки макрофагів з полостей і поверхонь органів. Після цього перитонеальну рідину повільно відсмоктували шприцем, вводячи голку в латеральну частину живота паралельно черевній стінці. Переносили в полістерольну чашку Петрі (37 ºС), додавали 10-15 мл середовища виділення та CaCl₂ (кінцева конц. 1 мМ), що сприяло кращому "прилипанню" клітин до пластика. Макрофаги мають значні адгезивні властивості. Для вивільнення макрофагів, що прилипли, зазвичай зменшують рівень двовалентних катіонів в середовищі виділення, або використовують ЕДТА. Клітини, що не прикріпились, видаляли. Додавали 8 мл середовища виділення та знімали клітини з підложки спеціальною лопаточкою або пінцетом з закріпленим на кінці шматочком "Parafilm". Клітини осаджували центрифугуванням 10 хв при 300g. Отримували збагачену макрофагами фракцію перитонеальних клітин.

Цей тест враховує стан цитоплазматичної мембрани клітини: її інактність або ушкодження. Трипановий синій не проникає крізь мембрану живої клітини, а проникає лише у мертві клітини.

Реактиви і обладнання:

1). Середовище Хенкса, яке містить10 мМ трис, рН 7,4.

2).0,2 % розчин трипанового синього.

3). Мікроскоп, гемоцитометрична камера (камера Горяєва), планшет для мікротитрування, центрифуга.

Хід роботи.

1). У лунки планшету вносимо 160 мкл (розведення у 10 разів) або 360 мкл середовища Хенкса (розведення у 20 разів).

2). Додаємо 20 мкл суспензії клітин.

3). Додаємо 20 мкл 0,2 % розчину трипанового синього.

4). Клітини ретельно ресуспендуємо у лунці шляхом піпетування.

5). 20 мкл профарбованої клітинної суспензії вносимо у гемоцитометричну камеру (камера Горяєва) і залишаємо приблизно на 1 хв, щоб клітини осіли на дно. Після цього швидко проводимо підрахунок, оскільки через 5-10 хв більшість лімфоцитів починають активно піноцитувати барвник.

1). Камеру промивають середовищем виділення. Місця зчеплення покривного скельця з камерою відміченні кільцями Ньютона (внаслідок інтерференції світла). Скельце має триматися при перевертанні камери.

2). Діапазон концентрацій для зручного підрахунку 10⁵-10⁷ клітин у мл. Краплину суспензії вносять в одну половину камери і лишають на 1 хв.

3). Під мікроскопом з об’єктивом ×40 підраховують не менше 200 клітин. Темні забарвлені клітини – мертві, а світлі опалесціюючі клітини – живі. Підрахунок проводять у 5 великих квадратах камери Горяєва.

Формула перерахунку ядровмісних клітин в 1 мл суспензії:

Х = Ā×250×1000×b

Х – кількість клітин в 1 мл;

Ā – загальна кількість клітин у 1 великому квадраті, який містить у полі зору 16 малих квадратів;

b – ступінь розведення суспензії (у нашому досліді у 20 разів);

1000 – коефіцієнт перерахунку на 1 мл.

Дата добавления: 2015-09-29