1.1. Цикл трикарбонових кислот

1. Огляд літератури

1.1. Цикл трикарбонових кислот

Цикл трикарбонових кислот – циклічна послідовність ферментативних реакцій, у результаті яких ацетил-КоА ( - СО S – КоА) – продукт катаболізму основних видів метаболічного палива (вуглеводів, жирів, амінокислот), окислюється до двоокису карбону з утворенням атомів водню, які використовуються для відновлення первинних акцепторів дихального ланцюга мітохондрій – нікотинамідних або флавінових коферментів. ЦТК – це загальний кінцевий шлях окислювального катаболізму клітини в аеробних умовах. Реакції і ферменти ЦТК локалізовані в матриксі та внутрішній мембрані мітохондрій. (Губський Ю., 2000)

1.1.1. Ферментативні реакції ЦТК:

1.Утворення лимонної кислоти (цитрату) за рахунок конденсації ацетил-КоА з щавлевооцтовою кислотою (оксалоацетатом). Реакція каталізується ферментом цитратсинтазою (КФ.2.3.3.1.)(Рис.1)

Рис.1. Реакція конденсації ацетил-КоА з оксалоацетатом з утворенням цитрату.

2.Претворення (ізомеризація) цитрату на ізоцитрат. Реакція каталізується ферментом аконітазою (КФ.4.2.1.3) і складається двох етапів (Рис.2., Рис.3):

2.1.Дегідратація лимонної кислоти з утворенням цисаконітової кислоти (цис-аконітату);

Рис.2.Реакція перетворення цитрату в цис-аконітат.

2.2.Приєднання до цис-аконітату молекули води. При приєднанні до подвійного зв’язку у складі цис-аконітату у транс-положенні результатом реакції є утворення ізолимонної кислоти (ізоцитрату);

Рис.3. Реакція перетворення цис-аконітату в ізоцитрат.

3.Дегідрування та декарбоксилювання ізоцитрату. Реакція каталізується НАД – залежною ізоцитратдегідрогеназою (КФ.1.1.1.41.) і призводить до утворення α-кетоглутарової кислоти (α-кетоглутарату)(Рис 4);

Рис.4.Реакція окислення ізоцитрату під дією ізоцитратдегідрогенази.

4.Окислення α-кетоглутарату до сукцинату. Цей процес відбувається у дві стадії:

4.1.Окислювальне декарбоксилювання α-кетоглутарату з утворенням сукциніл-КоА – стадія каталізується мультиензимним α-кетоглутаратдегідрогеназним комплексом (КФ.1.2.4.2. НАДН, що відновився в цій реакції, окислюється в дихальному ланцюзі мітохондрій із генерацією 3 молекул АТФ(Рис.5);

Рис.5.Реакція окиснювального декарбоксилювання α-кетоглутарату до сукциніл-КоА

4.2.Деацилювання сукциніл-КоА (перетворення на бурштинову кислоту (сукцинат)). Реакція каталізується ферментом сукцинілтіокіназою (КФ.6.2.1.1.)(Рис.6);

Рис.6.Реакція перетворення сукцніл-КоА у вільний сукцинат.

Потім фосфатна група від ГТФ переходить на АДФ у нуклеозидфосфокіназній реакції з утворенням АТФ:

5.Окислення янтарної кислоти до фумарової кислоти (фумарату). Реакція каталізується ФАД-залежним ферментом сукцинатдегідрогеназою(КФ.1.3.99.1.) (Рис.7);

Рис.7.Реакція окиснення сукцинату до фумарату.

Накопичення фумарату інгібує сукцинатдегідрогеназу і глутамат дегідрогеназу. (Gnaiger Е.,2011)

6.Перетворення фумарової кислоти на яблучну кислоту (малат) внаслідок приєднання до фумарату молекули води. Реакція каталізується ферментом фумаразою (КФ.4.2.1.2.)(Рис. 8);

Рис.8.Реакція перетворення фумарової кислоти в L-малат.

7.Окислення малату до до оксалоацетату (щавлевооцтової кислоти). Реакція каталізується НАД-залежним ферментом – малатдегідрогеназою (КФ.1.1.1.37.) мітохондрій.(Рис. 9) (Губський., 2000)

Рис.9.Реакція окиснення малату НАД-залежною малатдегідрогеназою до оксалоацетату

1.1.2. Анаплеротичні й амфіболічні реакції

Анаплеротичні реакції – реакції клітинного метаболізму, що підвищують концентрацію субстратів три карбонового циклу, утворюючи їх з інтермедіатів інших метаболічних шляхів(зокрема, амінокислот, пірувату).Активуючи ЦТК, анаплертичні реакції сприяють посиленню інтенсивності катаболічних процесів в організмі.

Утворення субстратів ЦТК в анаплеротичних реакціях:

1. Перетворення амінокислот на дикарбонові кислоти — субстрати ЦТК:

– утворення α-кетоглутарату в реакціях трансамінування;

L-аланін + α-кетоглутарат піруват + L-глутамат

– утворення оксалоацетату в реакціях трансамінування;

L-аспартат + α-кетоглутарат оксалоацетат + L-глутамат

– утворення α-кетоглутарату в глутаматдегідрогеназній реакції.

Глутамат + Піруват ↔ α-кетоглатарат + Аланін

2. Утворення оксалоацетату з пірувату в піруваткарбоксилазній реакції:

Піруват + СО₂ + АТФ Оксалоацетат + АДФ + Ф_Н

Коферментом піруваткарбоксилази є біотин (вітамін H), що в ході реакції зворотно акцептує СО₂, утворюючи N-карбоксибіотин.

Утворення оксалоацетату з пірувату під дією піруваткарбоксилази є найважливішою анаплеротичною реакцією в клітинах печінки та нирок.

3. Утворення оксалоацетату з фосфоенолпірувату:

Реакція каталізується фосфоенолпіруваткарбоксикіназою. При цьому відбувається утворення макроергічного нуклеозидтрифосфату ГТФ за рахунок розщеплення високоенергетичного зв’язку в молекулі фосфоенолпірувату — метаболіту гліколізу. Фосфоенолпіруваткарбоксикіназна реакція є анаплеротичною реакцією ЦТК, що має місце в міокарді та інших м’язових тканинах. Ця ж реакція, за умов її перебігу у зворотному напрямку, використовується в процесі синтезу глюкози.

Амфіболічні реакції— реакції, що застосовують субстрати ЦТК для утворення інтермедіатів, необхідних для біосинтетичних процесів:

Фосфоенолпіруват + СО₂ + ГДФ Оксалоацетат + ГТФ

1) у ролі амфіболічних можуть виступати реакції, обернені для розглянутих вищеперетворень амінокислот — в цьому разі дикарбонові кислоти, що утворюються в ЦТК, стимулюють процеси білкового синтезу;

2) важливою реакцією синтезу глюкози (глюконеогенезу) є утворення фосфоенолпірувату з оксалоацетату та ГТФ, тобто фосфоенолпіруват -карбоксикіназна реакція за умов її перебігу в напрямку, зворотному для розглянутого вище анаплеротичного процесу. (Губський Ю., 2000)

1.1.2. Енергетичний баланс циклу трикарбонових кислот

Для зясування кількості АТФ, яка синтезується при повному окисненні глюкози до О, необхідно сумувати вихід АТФ у кожній стадії процесу:

1) гліколізу в анаеробних умовах;

2) окиснювального декарбоксилювання пірувату;

3) ЦТК;

4) Дихального ланцюга.

При гліколітичному розпаді однієї молекули глюкози в аеробних умовах утворюються 2 молекули пірувату, 2 АТФ і 2 НАДН. Окиснювальне декарбоксилювання двох молекул пірувату дає 2 ацетил-КоА і 2 НАДН. При окисненні 1 молекули ацетил-КоА утворюється 12 молекул АТФ(Гонський, 2001)

Окиснення в дихальному ланцюгу молекул НАДН, які утворюються при гліколізі й окиснювальному декарбоксилюванні пірувату, дає по 2,5 АТФ на 1 НАДН; а – по 1,5 на 1 .

Сумарний вихід АТФ у результаті повного окиснення 1 молекули глюкози складає 30 – 32 молекули (або 30 – 32 молекули на 1 моль глюкози).

Фізіологічний сенс ЦТК полягає у відновленні коферментів і ФАД. Ці відновні еквіваленти передаються в дихальний ланцюг. (Марри Р. и др., 1988)

1.1.3. Регуляція ЦТК

ЦТК регулюється рядом факторів. Насамперед, концентрацією субстратів – ацетил-КоА і оксалоацетату. У нормальних умовах баланс між кількістю ацетил-КоА й оксалоацетату досягається завдяки активації ацетил-коенозим А піруваткарбоксилазної реакції. Баланс порушується під час голодування, коли внаслідок окиснення тканинного жиру в печінці накопичується надлишок ацетил-КоА, і при цукровому діабеті, коли порушується катаболізм глюкози і внаслідок недостачі пірувату не утворюється достатня кількість оксалоацетату. У цих випадках відносна нестача оксалоацетату, порівняно з рівнем ацетил-КоА, гальмує ЦТК, зумовлює підвищений синтез з ацетил-КоА кетонових тіл і розвиток кетову.

Крім цитрат-синтази, регуляторними ферментами циклу лимонної кислоти є ізоцитратдегідрогеназа й α-кетоглутаратдегідрогеназа. Усі вони чутливі до співвідношення концентрацій у клітині АТФ/АДФ, НАДН/ . При високих значеннях цих відношень активність регуляторних ферментів циклу пригнічується. Таким чином коли в клітині є велика кількість АТФ, робота циклу припиняється, а при використанні АТФ і зростанні рівня АДФ – стимулюється. Інгібітором цитрат-синтази і α-кетоглутаратдегідрогенази служить також сукциніл-КоА – проміжний продукт циклу. (Гонський Я., 2001)

1.3. Окисне фосфорилювання і дихальний ланцюг

Мітохондрії – мікроскопічні мембранні органели, загального призначення, основна функція яких – утворення необхідної для життєдіяльності клітини енергії та нагромадження її у складі молекул аденозинтрифосфорної кислоти (АТФ). (Луцик О. та ін., 2003)

Мітохондріальну систему спряжених окислювальних процесів з генерацією високоенергетичного інтермедіата АТФ називають окисним фосфорилюванням. (Марри Р. и др., 1988)

Дихання мітохондрій залежить від безперервного потоку субстратів через мемрану мітохондрій в матрикс. Різні переносники у внутрішній мітохондріальній мембрані беруть участь у транспорті мітохондріальних метаболітів з мітохондрії в цитозоль. Видалення інтермедіатів циклу трикарбонових кислот відіграє важливу роль в метаболізмі інтактних клітин. (Gnaiger E., 2011)

Система біологічного окислення, що локалізована в мембранах мітохондрій, здійснює дегідрування органічних субстратів та послідовний перенос відновлювальних еквівалентів на кисень через ряд проміжних переносників – транспортерів електронів та протонів. Ця система організована у вигляді ланцюга електронного транспорту, або дихального ланцюга мітохондрій. (Марри Р. и др., 1988)

Її можна розділити на декілька зберігаючих активність комплексів, кожен з яких втілює одну з головних стадій ланцюга перенесення електронів. Зазвичай ці комплекси позначають як комплекси І, ІІ, ІІІ і IV або кваліфікують як ферменти, що каталізують певний процес. (Таганович И. др., 2005)

Дихальний ланцюг мітохондрій – сукупність молекулярних компонентів, які вбудовані в ліпідний матрикс внутрішніх мітохондріальних мембран і здійснюють окислення біологічних субстратів та послідовне, ступеневе транспортування відновлюваних еквівалентів на кисень з утворенням молекули води. (Губський Ю., 2000)

1.3.1. Комплекси дихального ланцюга мітохондрій

1.3.1.1.НАДН-убіхінон оксидоредуктаза

Комплекс І каталізує двоелектронне окислення НАДН спеціальним проміжним переносником електронів – убіхіноном. Він може існувати в окисленій хінонній(КоQ) і відновленій гідрохінонній (КоQ ) формах. (Марри Р. и др., 1988)

НАДH – дегідрогеназа складається з декількох поліпептидних ланцюгів. Роль простетичної групи відіграє ФМН. Єдиним субстратом фермента є НАДH, з якого 2 електрони і протон переносяться на FMN з утворенням .Другий протон поглинається з матриксу. З електрони переносяться на ряд FeS білків, що відіграють роль простетичної групи в молекулі НАДH-дегідрогенази. Від FeS-центрів електрони переносяться на кофермент Q(убіхінон). Убіхінон виконує колекторну функцію, приєднуючи електрони від НАДH-дегідрогенази та інших флафінзалежних дегідрогеназ, зокрема, від сукцинат дегідрогенази. (Алейникова Т. и др., 2004)

1.3.1.2. Сукцинат-убіхінон оксидоредуктаза

Комплекс ІІ дихального ланцюга, що окислює бурштинову кислоту; входить до складу молекулярного комплексу сукцинат-коенозим Q-редуктази. (Губський., 2000)

Таким чином і в цьому випадку електрони переносяться на окислену форму кофермента Q. Окисником виступає зв’язаний з ферментом флавінаденіндинуклеотид (ФАД), який передає електрони (атоми Н) на допоміжний білок, а останній передає їх на кофурмент Q в ланцюг перенесення електронів. (Таганович А. и др., 2005)

1.3.1.3.Убіхінон-цитохром с оксидоредуктаза.

Комплекс ІІІ каталізує окислення відновленого кофермента Q рухомим переносником електронів – цитохромом с. Рівняння реакції що описує цей процес (Таганович А. и др., 2005):

+ (III) → (II) + + CoQ

Всередині комплексу ІІІ електрони передаються від цитохромів b на FeS-центри, на цитохром , а потім на цитохром с. В якості проміжного продукту в цих реакціях перенесення електронів можливе утворення вільного радикалу семіхінона.

Цитохром с – периферичний, водорозчинний мембранний білок з молекулярною масою 12 500Д, має один поліпептидний ланцюг, що складається із 100 амінокислотних залишків, і молекулу гема, ковалентно зв’язану з поліпептидом. (Алейникова Т. и др., 2004)

1.3.1.4.Цитохром с оксидаза.

Комплекс IV каталізує перенесення електронів від цитохрома с безпосередньо на кисень за реакцією:

(II) + + → (IIІ) + О

Комплекс складається з двох цитохромів типу , кожен з яких має центр зв’язування з киснем. Цитохроми а і мають характерну залізопорфіринову простетичну групу. Іншою особливістю цього комплексу є наявність в ньому іонів купруму, зв’язаних з білковою частиною в так званих CuA-центрах. (Алейникова Т. и др., 2004)

Кожен із комплексів містить набір білків, які несуть ті чи інші кофактори. Основні компоненти представлені трьома групами білків – флавопротеїдами, що містять залишок ФАД або флавінмононуклеотидами (ФМН), гемопротеїдами, що містять залізопорфіринові комплекси і FeS білки. (Таганович А. и др., 2005)

1.3.2. Цитохроми та FeS-білки

Цитохроми або гемопротеїни наївні у всіх типах організмів. В клітинах еукаріотів вони локалізовані в мітохондріальних мембранах і в ЕР. Відомо близько 30 різних цитохромів. Всі цитохроми в якості простетичної групи містять гем. В залежності від здатності поглинати світло в певній ділянці спектру всі цитохроми ділять на групи a, b, c. Всередині кожної групи окремі види з унікальними спектральними властивостями позначають цифровими індексами. Структурні особливості різних видів цитохромів визначають різницю в їхніх окисно-відновних потенціалах. В ланцюгу перенесення електронів беруть участь 5 типів цитохромів (а, , b, c, ).За виключенням цитохрома с, всі цитохроми знаходяться на внутрішній мембрані мітохондрій у вигляді складних білкових комплексів. (Алейникова Т. и др., 2004)

Залізо-сіркові білки, що містять негемоване залізо (FeS), - це білки, асоційовані з флавопротеїнами мітохондрій (металофлавопротеїнами) та цитохромом b. (Губський Ю., 2000)

В еукаріотичних клітинах майже всі специфічні дегідрогенази, беруть участь в окисленні пірувату і іншого клітинного палива через цикл лимонної кислоти, знаходяться у внутрішньому компартменті мітохондрій – в їх матриксі. (Ленинджер А., 1985)

1.3.3 Окисне фосфорилювання

Окисне фосфорилювання було відкрито в 1930 році В. А. Енгельгардтом. Продовживши ці дослідження, А. Ленінджер показав, що окислення субстрату і утворення АТФ з АДФ і неорганічного фосфату при аеробному диханні спряжене з перенесенням електронів по ланцюгу дихальних ферментів, вбудованих у внутрішню мембрану мітохондрій. Кінцевим акцептором електронів є кисень який відновлюється до води. Таким чином процес окиснення субстрату киснем зумовлений серією спряжених окисно-відновних реакцій компонентів електронтранспортного ланцюга.

В тих місцях де різниця окисно-відновних потенціалів значна, вивільняється найбільша кількість енергії яка використовується для синтезу АТФ. Утилізація вивільненої енергії відбувається в пунктах енергетичного спряження, де вона запасається у вигляді електрохімічного градієнта іонів водню.

Електрохімічний градієнт протонів в даному механізмі виступає як посередник між двома формами енергії, іншими словами, він спряжує ці енергетичні процеси. (Третьякова И. и др., 2014)

Перший процес – перенесення електронів від відновлених коферментів НАДH і через ланцюг перенесення електронів на кисень – екзергонічний. Наприклад:

NADH + + 1/2 → + = +52ккал/моль

Другий процес – фосфорилювання АДФ, або синтез АТФ – ендергонічний:

АДФ + →АТФ + = -7,3ккал/моль

Фосфорилювання АДФ → АТФ відбувається в трьох вузлових точках - в ділянці ланцюга НАДH → , в ділянці цитохром b → цитохром і в ділянці цитохром с → цитохроми а + . (Алейникова Т. и др., 2004)

Енергетичний сенс дихання полягає в синтезі АТФ. Енергія акумульована в АТФ, використовується клітиною для виконання всіх видів роботи.

Особливістю системи окисного фосфорилювання, що відрізняє її від інших ферментативних реакцій, що відбуваються в розчині, є строга просторова локалізація компонентів багатостадійного процесу. Окисне фосфорилювання локалізоване в мітохондріях і безпосередньо зв’язане з транспортною і механохімічною функціональністю їхніх мембран. (Волькенштейн М., 1957)

1.3.3.1. Механізм спряження окислення і фосфорилювання

Перенесення електронів по дихальному ланцюгу від НАДH на кисень супроводжується викачуванням протонів з матриксу мітохондрій в міжмембранний простір. На цю роботу затрачається енергія електронів, що переносяться по дихальному ланцюгу.

Протони перенесені з матриксу в міжмембранний простір, не можуть повернутися назад в матрикс, так як внутрішня мембрана непроникна для протонів. Таким чином, утворюється протонний градієнт, при якому концентрація протонів в міжмембранному просторі більша, а рН менше ніж в матриксі. Крім того кожен протон несе позитивний заряд, і в результаті цього виникає різниця потенціалів по обидва боки мембрани: від’ємний заряд на внутрішній стороні і додатній на зовнішній. В сумі електричний і концентраційний градієнти утворюють електрохімічний потенціал – джерело енергії для синтезу АТФ. (Алейникова Т. и др., 2004)

Мембрана відіграє роль спряжуючої системи. Кожна така мембрана містить білкові комплекси двох типів. Один з них називають АТФ-синтаза. Цей комплекс присутній у всіх спряжуючих мембранах. Природа другого білкового комплексу залежить від первинного джерела енергії, що використовується в даній мембрані. У випадку мітохондрій це дихальний ланцюг.

Пошук «енергетичного інтеремедіата», який би зв’язував ці дві системи, виявився важким питанням. Проблему розв’язав Пітер Мітчел висунувши хеміосмотичну теорію, в якій стверджувалося, що єдиним інтермедіатом є градієнт протонів на мембрані. (Николс Д., 1985)

1.3.3.2. Хеміосмотична теорія спряження

Важливе значення для дослідження механізму фосфорилювання в окисно-відновному ланцюгу має теорія хімічного спряження, розвинута Мітчелом.

Не користуючись безпосередньо уявленнями нерівноважної термодинаміки, Мітчел оперує поняттям спряження, необхідним при розгляді відкритих термодинамічних систем.

Центральний постулат хеміосмотичної теорії Мітчела:

Електронтранспортні ланцюги мітохондрій спряжені з системою синтезу АТФ через різницю електрохімічних потенціалів протонів на спряжуючих мембранах. Достовірність цього постулату підтверджена дослідами з кислотно-основними переходами і розспряжувачами. (Третьякова И., 2014)

Хеміосмотична теорія (за П. Мітелом, 1961) передбачає, що:

1)Функціонування дихального (електронотранспортного) ланцюга у внутрішніх (спрягаючих) мембранах мітохондрій супроводжується генерацією на цих мембранах електрохімічного градієнта протонів.

2)Окремі компоненти електронотранспортного ланцюга діють як протонні помпи, що спричиняють векторний(перпендикулярний площині мембрани) транспорт протонів, спрямований у напрямку «матрикс зовнішня поверхня мембрани».

3)Електрохімічний потенціал протонів на спрягаючи мембранах, який створюється завдяки дії протонних помп дихального ланцюга, є рушійною силою синтезу АТФ.

4)Існує ферментна система, що використовує енергію електрохімічного протонного потенціалу для синтезу АТФ за рахунок транс локації протонів через мітохондріальну мембрану в напрямку «зовнішня поверхня матрикс». Ця ферментна система яка замикає протонний цикл на спрягаючи мембранах мітохондрій – протонна АТФ-аза, або АТФ-синтетаза.

5)Будь-які фізичні, хімічні та біологічні фактори, що пошкоджують цілісність спрягаючи мембран мітохондрій та розсіюють енергію електрохімічного градієнта, порушують синтез АТФ, тобто виступають як роз’єднувачі транспорту електронів та окисного фосфорилювання. (Губський Ю., 2000)

В якості сряжуючих компонентів в роботі електронтранспортного ланцюга мітохондрій є такі коферменти, як НАДФ, НАД, ФАД і ФМН, які відіграють роль проміжних преносників електронів, а також атомів водню. НАД і НАДФ є коферментами в ферментативних окисно-відновних реакціях. Піридинове кільце нікотинаміду цих коферментів може переносити зворотнє окислення. В свою чергу ізоалоксазинове кільце ФМН і ФАД також переносить зворотнє окисно-відновне перетворення. ФМН і ФАД є простетичними групами для флавінодегідрогеназ. (Третьякова И., 2014)

1.3.4. АТФ – синтаза

АТФ-синтаза – інтегральний білок внутрішньої мембрани мітохондрій. Він розміщений безпосередньо близько до дихального ланцюга.

Білок складається з двох білкових комплексів, які позначаються .

Гідрофобний комплекс занурений в мембрану. Він є основою, яка фіксує АТФ-синтазу в мембрані. Комплекс складається з декількох субодиниць, що утворюють канал, по якому протони переносяться в матрикс.

Комплекс виступає в мітохондріальний матрикс. Він складається з 9 субодиниць (3α, 3β, γ, ε, δ).

Підвищення концентрації протонів в міжмембранному просторі активує АТФ-синтазу. Електрохімічний потенціал змушує протони рухатися по каналу АТФ-синтази в матрикс. Паралельно під дією електрохімічного градієнта відбуваються конформаційні зміни в парах α, β – субодиниць білка , в результаті чого з АДФ і неорганічного фосфату утворюється АТФ. Електрохімічний потенціал, що генерується в кожному з трьох пунктів спряження в ланцюгу перенесення електронів, використовується для синтезу однієї молекули АТФ. (Алейникова Т. и др., 2004)

Якщо створити умови в яких активна лише АТФ-синтаза, і додати до органел АТФ, то гідроліз АТФ і перенесення протонів будуть відбуватися до того часу, поки не буде досягнуто рівноваги між енергією, виділеною при гідролізі АТФ, і енергією необхідною, для перенесення протонів проти утвореного градієнта їх концентрації. Якщо порушити рівновагу, видаливши з середовища АТФ, то відбудеться АТФ-гідролазна реакція і почнеться синтез АТФ за рахунок енергії протонного градієнта. Синтез АТФ приведе в свою чергу до розсіювання градієнта концентрації; для його підтримки необхідна робота другої помпи.

В результаті роботи протонних помп усворюється круговий потік протонів через спряжуючу мембрану.

Цей струм дуже схожий зі струмом в електричному ланцюгу. Для того щоб не відбулося короткого замикання, мембрана повинна бути замкненою і повинна мати високий опір для протонів. Одне з найбільш вдалих передбачень хеміосмотичної теорії полягає в тому, що безліч агентів, які розспряжують окислення і синтез АТФ, діють саме шляхом підвищення протонної провідності мембран і спричиняють коротке замикання. (Николс Д., 1985)

1.3.5. Інгібітори електронного транспорту та окисного фосфорилювання в мітохондріях

Певні хімічні сполуки здатні специфічним чином порушувати електронний транспорт (інгібітори електронного транспорту) та окисне фосфорилювання (інгібітори та роз’єднувачі окисного фосфорилювання) в мітохондріях. Дані сполуки взаємодіють з певними компонентами дихального ланцюга або системами окисного фосфорилювання, порушуючи їх біохімічні функції.

1.3.5.1. Інгібітори мітохондріальних функцій

Сполуки цього класу порушують функціонування дихального ланцюга мітохондрій за рахунок зв’язування з окремими ферментними білками або коферментами, що беруть безпосередню участь у переносі електронів від субстратів біологічногоокислення на . При надходженні в організм людини або тварин ці речовини діють як клітинні отрути, спричиняючи феномен тканинної гіпоксії.

Ротенон – інгібітор транспорту електронів через НАДН-коенозим Q- редуктазний комплекс. Ротенон застосовується як інсектицид.

Амобарбітал (амітал) та близький до нього за структурою секобарбітал (секонал). Ці похідні барбітурової кислоти (барбітурати) застосовуються у фармакології як снодійні засоби. Разом з тим, барбітурати, подібно до ротенону, є активними інгібіторами клітинного дихання, блокуючи електронний транспорт на рівні НАДН-коенозим Q- редуктази.

Пієрицидин А – антибіотик, що також блокує НАДН-коенозим Q- редуктазний комплекс за рахунок конкурентної взаємодії з убіхіноном.

Антиміцин А – антибіотик, що блокує дихальний ланцюг мітохондрій на рівні переносу електронів через комплекс ІІІ (цитохром b - цитохром ).

Ціаніди(іони ) – потужні клітинні отрути, що є інгібіторамитранспорту електронів на термінальній ділянці дихального ланцюга мітохондрій (у цитохромоксидазному комплексі). Іони утворюють комплекси з ферри () – формою молекул гему цитохромоксидази, блокуючи їх відновлення до ферро () – форм.

Монооксид вуглецю (СО) – інгібує цитохромоксидазу шляхом зв’язування з ділянкою гему, що взаємодіє з молекулою кисню. (Губський Ю., 2000)

Інгібітори окисного фосфорилювання блокують як окислення субстратів, так і фосфорилювання АДФ у мітохондріях.

Олігоміцин – антибіотик, що протидіє як фосфорилюванню АДФ до АТФ, так і стимуляції поглинання , що спостерігається після додавання до мітохондрій АДФ (феномен «дихального контролю»). Механізм дії олігоміцину полягає в інгібуванні функції АТФ – синтази. (Губський Ю., 2000)

1.3.5.2. Роз’єднувачі окисного фосфорилювання

Сполуки цього класу спричиняють «неконтрольоване» дихання мітохондрій,яке не залежить від функціонування системи фосфорилювання АДФ. В присутності роз’єднувачів спостерігається активне поглинання мітохондріями , незважаючи на зниження швидкості (або відсутності) генерації АТФ з АДФ та . Згідно з хеміосмотичною теорією, роз’єднувачі спричиняють втрату мембранною протонного потенціалу.

До роз’єднувачів окисного фосфорилювання належать:

1)2,4-динітрофенол та сполуки, близькі до нього за хімічною структурою (динітрокрезол, пентахлорфенол)

2)СССР(карбонілціанід-м-хлорфенілгідразон) – сполука, що в 100 разів перевищує за специфічною активністю 2,4-динітрофенол.

Здатність роз’єднувати дихання та окисне фосфорилювання в мітохондріях мають також гормони щитоподібної залози (тироксин, трийодтиронін).

Порушення синтезу АТФ спостерігається в умовах дії на організм людини і тварин багатьох патогенних факторів хімічного (природні та синтетичні токсини), біологічного та фізичного (іонізуюча радіація) походження, які спричиняють роз’єднання дихання та окисного фосфорилювання за рахунок порушення спроможності створювати і підтримувати протонний потенціал на спрягаючих мембранах мітохондрій. (Губський Ю., 2000)

1.4 Ендо-лізосомальна система клітини – апарат внутрішньоклітинного перетравлювання

Представлена системою особливих органел – мембранних пухирців з кислим вмістом – ендосом і лізосом, які забезпечують катаболічні процеси в цитоплазмі клітини. Ендо-лізосамьна система забезпечує регульоване внутрішньоклітинне розщеплення макромолекул внутрішньоклітинного і зовнішньо клітинного походження. Вміст ендосом і лізосом різний у клітинах різних типів; максимальний в тих, які активно здійснюють піноцитоз і фагоцитоз з подальшим перетравлюванням захопленого матеріалу (в фагоцитах, остеобластах).

Об’єднання ендосом і лізосом в єдину систему ґрунтується на наявності в їх мембрані АТФ-залежної протонної помпи, що замислює середовище всередині цих органел. Низькі значення рН активують ферменти – кислі гідролази, які транспортуються особливими гідролізними пухирцями, що утворюються в комплексі Гольджі. Мембрана ендосом і лізосом (має товщину близько 6 нм) окрім наявності протонної помпи володіє іншими важливими властивостями, зокрема: містить рецептори, що дозволяють їй зв’язуватися з мембранами гідролізних і транспортних пухирців, а також фагосом; забезпечує вільну дифузію низькомолекулярних продуктів травлення макромолекул в гіалоплазму; в непошкодженому стані являє собою бар’єр, резистентний до дії ліричних ферментів і запобігає їхньому надходженню в гіалоплазму (Биков, 2002)

1.4.1 Ендосоми і лізосоми

Мембранні пухирці з кислим вмістом, які забезпечують перенесення перенесення макромолекул з поверхні клітини в лізосом і їх частковий або повний гідроліз.

Шлях транспорту і руйнування речовин в клітині можна зобразити за допомогою такої послідовності: рання (периферична) ендосом → пізня (перинуклеарна) ендосом → лізосома.

Ранні (периферичні) ендосом – мембранні пухирці нарізних етапах після їх відділення від плазмо леми (але вже після втрати спочатку наявної клатринової оболонки). Вони розміщуються недалеко від плазмо леми в периферичних відділах цитоплазми. В них відбувається відщеплення лігандів від рецепторів з їх сортуванням і можливим поверненням останніх в спеціальних пухирцях в плазмо лему для повторного циклу використання (ре циклювання).

Пізні (перинуклеарні) ендосоми утворюються пізніше ранніх і розташовані в глибоких відділах цитоплазми поблизу ядра. Відрізняються від ранніх більш кислим вмістом і вищим рівнем перетравлювання ферментів. В них із ранніх ендосом надходять продукти, які повинні перетравитись. Велика частина цих продуктів, а також ферменти в подальшому будуть направлятися в лізосому.

Лізосими – органели, які беруть участь в заключних етапах процесу внутрішньоклітинного перетравлення, захоплених клітиною макромолекул, при низьких значеннях рН. Після перетравлювання вмісту низькомолекулярні речовини дифундують через мембрану лізосом у гіалоплазму. (Биков, 2002).

Лізосоми містять набір гідролітичних ферментів. Маркерним ферментом лізосом є кисла фосфатаза. Залежно від ультраструктурних і функціональних особливостей лізосом їх поділяють на первинні (ферменти яких знаходяться у неактивному стані), вторинні, або фагосоми (активовані ферменти в них безпосередньо контактують з розщеплюваними біополімерами), а також залишкові тільця, що являють собою оточені біомембраною нерозщеплені залишки. Лізосоми можуть брати участь як у розщепленні власних макромолекулярних комплексів клітини (явище аутофагоцитозу), так і в перетравлюванні поглинутих клітиною частинок (гетерофагоцитоз) (Луцик, 2003).

1.4.2. НААДФ – внутрішньоклітинний посередник вивільнення

У 1987 р. встановлено, що невідома домішка у придбаному реактиві НАДФ вивільняє Ca2+ з мікросом яєць морського їжака (Clapper, Walseth, 1987).

Цією домішкою виявився нікотинацидаденіндинуклеотидфосфат (НААДФ) (Lee, Aarhus, 1995)

Відомо, що нікотинацидаденіндинуклеотидфосфат (НААДФ) здатний вивільнювати Са2+ з депо, а тому відіграє ключову роль у формуванні внутрішньоклітинного Са2+-сигналу і бере безпосередню участь у регуляції цілої низки клітинних процесів (Galione, Parrington, 2011).

Природа НААДФ-чутливого рецептора, його розташування усередині клітини та механізми активації вивільнення Са2+ інтенсивно вивчаються. На сьогодні накопичилися докази того, що НААДФ опосередковує вивільнення Са2+ з ендо-лізосомальної системи через активування нової родини проникних для Са2+ каналів, що мають назву – двопорові канали (TPCs) (Galione, Morgan, 2010).

Ще однією системою активного транспорту йонів у клітинах, діяльність якої
пов’язують як з плазматичною мембраною, так і з мембраною кислих депо, є базальна Mg2+-АТФ-аза(Костерін,Векліч, 2005). Показано, що робота базальної Mg2+-АТФ-ази асоційована з протонною помпою (Бичкова,Чорна, 2012).

Показано, що за дії НААДФ спостерігається залуження люмену ендо-лізо-
сомальних органоїдів (Morgan, Platt, 2011). Це буде безпосередньо впливати на протонну помпу і опосередковано пригнічуватиме активність базальної Mg2+-АТФ-ази ацидофільних депо. Припускається, що НААДФ-чутливі рецептори локалізовані на ендо-лізосомальному депо, окремі структури якого пов’язані з ендоплазматичним ретикулумом. (Вергун, Бичкова, 2014)

1.4.3. Бафіломіцин – інгібітор АТФ-ази V-типу.

Бафіломіцин А1 був виділений з Streptomyces sp. (Werner, Hagenmaier, 1984)

Бафіломіцин А1відомий як сильний інгібітор вакуолярного типу -АТФ-ази in vitro, в той час як інші типи АТФ-ази, наприклад -АТФ-аза не страждають від цього антибіотика. (Bowman, Siebers, 1988) Ефекти цього інгібітора були випробувані на лізосомах живих культивованих клітин.

Бафіломіцин А1 (Баф-А1), при використанні у відносно високих концентраціях (≥10 нМ), інгібує вакуолярні АТФ-ази (V-АТФ-ази) і зменшує ендосомальне окиснення і число лізосом, перешкоджаючи таким чином реплікації вірусу грипу А але сприяє цитотоксичності клітини-господаря. При концентраціях ≥10 нМ Баф-А1 інгібує формування кислих лізосом, в результаті чого знижується реплікація і вивільнення вірусу грипу А. На відміну від впливу високих концентрацій Баф-A1, дуже низькі концентрації не володіють цитотоксичною дією і не індукують апоптоз клітин. Низький рівень концентрації Баф-A1 є ефективним інгібітором реплікації вірусу грипу А, не впливаючи на життєздатність клітин-господарів (Yeganeh, Ghavami et al, 2015)

Бафіломіцин А1 є потужним і специфічним інгібітором V – АТФ-ази. Цей антибіотик викликає дуже мало побічних ефектів. Тому цей препарат в даний час широко використовується як потужний інструмент для вивчення ролі V-АТФ-аз кислих компартментів. Бафіломіцин А1 запобігає дозрівання автофагосом і лізосом, ефективно пригнічує ендогенну деградацію білків.

Якщо бафіломіцин А1 може проникати в органели живих клітин через плазматичну мембрану не вбиваючи клітини, можна безпосередньо дослідини in vivo відношення між V-АТФ-азою, закисленням органел і різних функцій центральної вакуолярної системи (Yoshimori et al., 1991).

1.5. Лімфома NK/Ly

Клітинна лінія NK/Ly була отримана Неметом і Келнером у 1960 р. Вона вважається перспективною моделлю для тестування протипухлинної активності нових антинеопластичних препаратів. У 1960-1990 позитивні властивості цієї пухлини була доведена і підтверджена численними дослідженнями. Тим не менш, у даний час він рідко використовується в експериментальній онкології. Часто використовується в дослідженнях в якості джерела великої кількості умовного біоматеріалу. Перевагою моделі NK/Ly є краща вираженість приросту маси тіла через ріст пухли в порівнянні з іншими моделями. Цією властивістю NK/Ly лімфома нагадує карциному Ерліха. (C. Sellei,1975р.)

Однак ця експериментальна пухлина не набула широкої популярності і згодом була витіснена іншими модельними лініями лейкемії – P388 і L1210. Унікальною особливістю лімфоми NK/Ly є характерні симптоми ендогенної інтоксикації, які спостерігаються у тварин-пухлиноносіїв на термінальній стадії розвитку цієї пухлини і нагадують кахексію, викликану солідними пухлинами у людини та експериментальних тварин. Лімфома NK/Ly виявилася зручною моделлю для досліджень.Для досліджень використовують асцит NK/Ly мишей в якості експериментальної моделі пухлини. Ця пухлина добре приживається після зараження і росте швидко, в результаті чого клінічні симптоми, схожі на лімфому ссавців (Anatskaya O.V, 2007).

Ракові клітини еволюціонували для того щоб отримати найкраще із двох сторін по енергії метаболізму. Пухлинні клітини одночасно збільшили метаболізм, що призводить до генерації АТФ, НАДФ, лактат і нуклеїнових кислот, а також використовують окисне фосфорилювання, що призводить до генерації АТФ, НАДФ, амінокислот, нуклеїнових кислот та ліпідів. Експерементальні дані показують що в ракових клітинах узгоджено посилюється гліколіз, цикл Кребса, та пентозофосфатний шлях (Brocks D.G, 1980).

Посилення функції онкогенів, втрата пухлинних супреворів, а також активація PI3K шляху призводить до збільшення метаболізму гліколізу та мітохондріального метаболізму в ракових клітинах (Carafoli E., 2001].

Дата добавления: 2015-08-29