1.Сфрормулируйте важные свойства систем экспрессии рекомбинантного гена в клетке-хозяине.

Тема ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ

1.Сфрормулируйте важные свойства систем экспрессии рекомбинантного гена в клетке-хозяине.

1. Тип промотора и терминатора транскрипции.

2. Прочность связывания мРНК с рибосомой.

3. Число копий клонированного гена и его локализация (в плазмиде или в хромосоме хозяйской клетки).

4. Конечная локализация синтезируемого продукта.

5. Эффективность трансляции в организме хозяина.

6. Стабильность продукта в хозяйской клетке.

2. Почему для производства важных в коммерческом отношении продуктов с помощью технологии рекомбинантных ДНК наиболее часто используют систему экспрессии клеток E.coli.

Это связано с тем, что генетические, молекулярно-биологические, биохимические и физиологические свойства этого микроорганизма детально изучены. Кроме того, это наиболее дешевый и быстрый способ получения многих белков.

3. Почему семейство векторов pUC часто используют для экспрессии в клетках кишечной палочки чужеродных генов?

В состав векторов pUC входят регуляторные элементы транскрипции Lac- оперона оперона E.coli, которые дают возможность использовать эти векторы для экспрессии в клетках кишечной палочки чужеродных генов. Наличие сильного регулируемого промотора, имеющего большое сродство к РНК-полимеразе, обеспечивает эффективную транскрипцию после наращивания больших количеств клеточной массы.

4. Какие регулируемые промоторы наиболее широко используют в системе E.coli для экспрессии клонируемых генов?

Наиболее широко используются следующие регулируемые промоторы: lac- и trp-оперонов E.coli; специально сконструированный tac-промотор, включающий -10- область lac-промотора и -35-область trp-промотора; левый или, pL, промотор бактериофага λ, а также промотор гена10 бактериофага Т7. С каждым из них связываются соответствующие репрессоры, которые опосредуют включение и выключение транскрипции специфических генов.

5. Какая проблема возникает при использовании в качестве вектора для клонирования гена многокопийных плазмид и каков путь ее преодоления?

При наличии в клетке плазмиды часть энергетических ресурсов расходуется на ее репликацию, транскрипцию и синтез белков, которые она кодирует. Как правило, многокопийные плазмиды требуют больше энергии, чем малоколийные, и в результате часть клеток в процессе роста популяции клеток утрачивает плазмиды. Лишившиеся своих плазмид клетки обычно растут быстрее тех, в которых они сохранились. В конечном счете такие клетки оказываются в культуре преобладающими, что через какое-то число генераций отражается на количестве синтезируемого продукта клонированного гена. Чтобы избежать этой проблемы в лабораторных условиях для сохранения плазмид клетки выращивают в присутствии антибиотиков или метаболитов, обеспечивающих рост только тех клеток, в которых есть плазмида. Это приводит к значительному удорожанию конечного продукта.

6. Какое обязательное требование к строению экспрессионной конструкции гена-мишени при его встраивании в хромосомную ДНК хозяина?

При встраивании гена-мишени в хромосомную ДНК хозяина необходимо, чтобы сайт интеграции не находился внутри гена, кодирующего важную клеточную функцию хозяина. Для этого чужеродный ген включают в заведомо несущественный сайт хозяйской ДНК. Кроме того, для обеспечения эффективной экспрессии его помещают под контроль регулируемого промотора. Для интеграции в нужный сайт вводимый ген должен содержать нуклеотидную последовательность длиной не менее 50 нуклеотидов, сходную с таковой в хромосомной ДНК хозяина, в пределах которых и должен произойти физический обмен (рекомбинация) между двумя молекулами ДНК

1. 7. Опишите сущность процесса интеграции гена-мишени в хромосомную ДНК хозяина.

1. Идентификация подходящего сайта интеграции, т.е. участка хозяйской ДНК, последовательность которого может быть прервана без ущерба для функционирования клетки.

2. Выделение и клонирование всего хромосомного сайта интеграции или его части в составе плазмидной ДНК

3. Встраивание нужного гена вместе с регулируемым промотором в клонированный сайт интеграции или вблизи него.

4. Перенос полученной генетической конструкции “хромосомный сайт интеграции/клонированный ген” в хозяйскую клетку в составе плазмиды, не способной к автономной репликации в клетках этого хозяина.

5. Отбор и сохранение тех хозяйских клеток, в которые одним из способов детекции (см. раздел библиотека генов) выявляется экспрессия гена-интереса. Наследование клонированного гена возможно только в случае его интеграции в хромосому клеток хозяина.

8.Назовите причины формирования телец включения при экспрессии эукариотических генов в бактериальных клетках.

При экспрессии эукариотических генов в бактериальных клетках часть рекомбинантных эукариотических белков и некоторые прокариотические белки при высоком уровне биосинтеза переходят в нерастворимое состояние, образуя так называемые тельца включения. Это связано с отсутствием в клетках прокариот систем, обеспечивающих посттрансляциюнные модификации эукариотических белков, происходящие в определенных компартментах эукариотических клеток:

· образование дисульфидных связей (неправильно уложенный белок может оказаться нестабильным и неактивным);

· протеолитическое расщепление предшественника, удаление определенного участка полипептидной цепи с образованием функционального белка;

· гликозилирование: основная модификация, благодаря которой белки приобретают стабильность, или особые свойства;

· модификация аминокислот в составе белка: фосфорилирование, ацетилирование и др.

· правильное сворачивание белковой молекулы (фолдинг), которое в клетках эукариотов осуществляют шапероны.

9. Что определяет ограничения на использование бактерий в биотехнологии?

Поскольку в бактериальных клетках соответствующие системы посттрансляционных модификаций белков отсутствуют, в них не могут быть получены биологически полноценные рекомбинантные эукариотические полипептиды.

10. Какие системы экспрессии эукариотических клеток используют в биотехнологии белкового синтеза?

Используют системы эукариотических клеток дрожжей, насекомых, животных и растений, в геном которых рекомбинантные гены вводятся с помощью трансфекции. Выбранную эукариотическую систему экспрессии проверяет на наличие всех необходимых условий для требующейся в каждом конкретном случае посттрансляционной модификации и фолдинга продукта вводимого рекомбинантного гена.

11. Какие требования предъявляют к эукариотическим экспрессирующим векторам?

Эукариотические экспрессирующие векторы, как и их прокариотические аналоги должны содержать в структуре следующие функциональные модули:

• эукариотический селективный маркер;

• эукариотический промотор;

• соответствующие эукариотические сайты терминации транскрипции и трансляции;

• сигнал полиаденилирования мРНК.

Если вектор функционирует как плазмида, реплицикация которой не зависит от хромосомы, то он должен содержать сайт инициации репликации, функционирующий в хозяйской клетке. Если же вектор предназначен для встраивания в хозяйскую хромосомную ДНК, то для обеспечения рекомбинации он должен нести последовательность, гомологичную определенному участку хромосомной ДНК хозяина (хромосомный сайт интеграции).

12. Почему большинство эукариотических векторов сконструированы как челночные?

Поскольку технически многие операции с рекомбинантными ДНК сложнее проводить в клетках эукариот, чем прокариот, большинство эукариотических векторов сконструированы как челночные. Это значит, что эти векторы несут два типа сайтов инициации транскрипции и два типа селективных маркерных генов, одни из которых функционируют в Escherichia coli, a другие — в эукариотических хозяйских клетках. Такие векторные системы экспрессии разработаны для дрожжей, насекомых и клеток млекопитающих.

13.Для каких целей используют внехромосомные экспрессирующие векторы млекопитающих?

Внехромосомные экспрессирующие векторы млекопитающих используются для изучения функций и регуляции генов млекопитающих. Кроме того, с их помощью могут быть получены аутентичные рекомбинантные белки, которые потенциально могут быть применимы в медицинских целях для лечения некоторых заболеваний человека.

14. Опишите составные части обобщенной структуры эукариотического экспрессирующего вектора.

Полилинкер, представляющий собой множественный сайт клонирования (МСК), и селективный маркер (СМ) находятся под контролем эукариотического промотора и сигнала полиаденилирования или терминации. Обычно используют регуляторные последовательности ДНК вирусов животных (например, цитомегаловируса человека, SV40 или HSV) или генов млекопитающих (гена β-актина, металлотионеина, тимидинкиназы или гена гормона роста). Репликация в клетках E.coli и в клетках млекопитающих обеспечивается соответствующими сайтами инициации репликации: ori плазмиды colEI и, например, обезьяньего вируса 40 (SV40). Для отбора трансформированных клеток E.coli используется ген устойчивости к ампициллину Amp. В качестве селективных маркеров для трансфицированных клеток млекопитающих используют разные гены:

1. Бактериальный ген Neo, кодирующий неомицинфосфотрансферазу, которая обеспечивает устойчивость трансфецированных клеток к токсичному соединению генетицин (G-418).

2. Ген, кодирующий дигидрофолатредуктазу (ДГФР). В этой системе используют клетки с дефектом гена ДГФР, которые не способны расти на среде с метотрексатом. Отобранные клетки пересевают на среды с большей концентрацией метотрексата, отбирая, таким образом, более устойчивые клетки, т.е. содержащие больше копий вектора.

3. Ген фермента глутаминсинтетазы (GS), обеспечивающий устойчивость к цитотоксическому действию метионинсульфоксимина. Вектор, содержащий GS- ген, вводят в культуру клеток млекопитающих и для отбора клеток, несущих большое количество копий вектора, повышают концентрацию метионинсульфоксимина в среде. При этом в хозяйских клетках тоже должна присутствовать GS, поскольку только множественные копии GS-гена могут обеспечивать устойчивость к метионинсульфоксимину.

15. Как программируют стабильность продукта экспрессии гена-интереса в хозяйской клетке?

Стабильность продукта экспрессии гена-интереса в хозяйской клетке также программируют на стадии конструирования рекомбинантной ДНК. Один из способов защиты продуктов экспрессии чужеродных генов (белков) от деградации в хозяйских клетках – ковалентное присоединение продукта клонированного гена к какому-либо стабильному белку хозяина. Подобная конструкция получила название “ химерный белок ” или “ слитый белок ”. Слияние белков программируется на уровне ДНК лигированием кодирующих участков соответствующих генов. При этом следует помнить о рамке считывания, поскольку теоретически нуклеотидная последовательность мРНК в процессе трансляции может быть декодирована с помощью любой из трех различных рамок считывания, причем образующиеся полипептидные цепи будут в этих трех случаях совершенно разными.

16. Как производят удаление балластной (хозяйской) белковой последовательности из химерного белка?

Для удаления балластной (хозяйской) белковой последовательности из химерного белка на уровне ДНК программируют введение сайтов узнавания для протеаз. Олигонуклеотидные линкеры, несущие такие сайты, можно пришить к клонированному гену до того, как такая конструкция будет введена в экспрессирующую векторную систему слияния. Линкером может служить, например, последовательность нуклеотидов, кодирующая олигопептид Ile-Glu-Gly-Arg, узнаваемый фактором крови Ха, который является специфической протеиназой.

17. Что такое репортерные гены?

Создание подобных химерных конструкций широко используется для контроля за уровнем экспрессии вводимого гена и для определения места локализации его продукта в клетке-хозяине. В этом случае последовательности гена-мишени сливают с генами, которые кодируют нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях может быть легко тестировано. Они получили название – репортерные гены.

18. Какие гены используют чаще всего в качестве репортерных? Приведите пример использования гена зеленого флюоресцентного белка.

Чаще всего в качестве репортерных используют гены β-глюкуронидазы (GUS), зеленого флюоресцентного белка (GFP), люциферазы (LUC), хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) и др.

GFP (green fluorescent protein - зеленый флюоресцентный белок, или белок зеленой флюоресценции) был обнаружен Shimomura с соавт. в 1962 г. у люминесцирующей медузы Aequorea victoria. В 2008 г. Нобелевская премия по химии была присуждена группе ученых из США: Osamu Shimomura, Martin Chalfie и Roger Tsien за "открытие и исследование зеленого флюоресцирующего белка", который стал одним из важнейших исследовательских инструментов в биологии, так как позволяет вести наблюдения за процессами в живых клетках Особые свойства белка GFP, а именно его способность флюоресцировать в видимой (зеленой) области спектра при облучении длинноволновым УФ, обусловлены самой структурой его молекулы и не требуют субстратов или кофакторов.

Многочисленные производные GFP получили общее название AFP (autofluorescent proteins - автофлюоресцентные белки). Эукариотические клетки, трансфецированные плазмидной ДНК, содержащей в своей структуре гены зеленого (А) и красного (Б) флюоресцирующих белков светятся при облучении.

19. Как химерные белки используются для очистки рекомбинантного белка?

Методический прием создания конструкции ДНК с программируемым синтезом продукта в составе химерного белка используют также и для упрощения процедуры очистки рекомбинантного белка.

Например, плазмидная конструкция для клеток S.cerevisiae, содержащая ген человеческого интерлейкина-2 с присоединенным к нему сегментом ДНК, кодирующим маркерный пептид Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp–Lys (он продается под названием Flag), выполняет двоякую функцию: обеспечивает стабилизацию продукта гена интерлейкина-2 и облегчает его очистку. Химерный белок, образующийся после экспрессии этой конструкции в дрожжевых клетках, может быть очищен за один прием с помощью иммуноаффинной хроматографии.

20.В чем заключается очистка химерного белка с помощью иммуноаффинной хроматографии?

Антитела к маркерному пептиду химерного белка фиксируют на твердом носителе и пропускают через колонку химерный белок. Маркерный пептид, входящий в состав химерного белка, связывается с антителами, а все остальные белки свободно проходят через колонку. Очищенный химерный белок элюируют из колонки.

Дата добавления: 2015-08-29