Тема: Микроскопический метод исследования. Простые и сложные способы окраски.

«Занятие №3»

Тема: Микроскопический метод исследования. Простые и сложные способы окраски.

- сущность микроскопического метода исследования;

- виды микроскопии, характеристика их;

- устройство микроскопа«Биолам»

- правила работы и ухода за микроскопом

простые способы окраски, значение их.

- сложные способы окраски, значение их.

- окраска по Граму.

Должны уметь:

- приготовить препарат микробной культуры, окрасить простым и сложным способом;

- провести иммерсионную микроскопию; зарисовать.

Микроскопический метод исследования применяют для изучения окрашенных и неокрашенных препаратов. Он позволяет изучить тинкториальные свойства, отношение окраске морфологию клеток; внешний вид клетки, наличие спор, капсул, жгутиков; подвижность и взаиморасположение клеток; попарно, цепочкой, хаотично и.т.д.

Виды микроскопии:

А. СветоваяБ. Электронная

Изучает микроорганизмы Изучаетмикроорганизмы

размером не<0,2 мкм размером менее 0,2 мкм

Виды световой микроскопии:

2. Фазово-контрасная - применяется для изучения неокрашенных препаратов. Глаз человека способен различать длину световой волны (цвет, интенсивность, яркость), но не может обнаружить различия в фазе преломления. При изучении неокрашенных микробов, которые отличаются от окружающей среды только по показателю преломления, на рассматриваемом фоне при обычной микроскопии их не увидеть. Поэтому для изучения микроорганизмов в неокрашенном виде, используют фазово-контрасную микроскопию. Для этого есть ф азово-контрасные устройства, которые можно установить на любой микроскоп. Устройство состоит из специального объектива и конденсора с поворачивающимся диском.

Настройка заключается в следующем:

-заменить обычный объектив на фазово-контрасный - заменить конденсор.

Видим: на темном фоне м.о. светлые - негативный препарат, или на светлом фоне - м.о. темные позитивный препарат.

Но не все и.о. можно изучить при данной микроскопии; например, лептоспиры, вирус изучают при темнопольной микроскопии.

3. Темнопольная микроскопия.

Она основана на способности и.о. сильно рассеивать свет. Для данной микроскопии используют обычные объективы, но специальные темнопольные конденсоры,.у которых центральная затемнена и прямые лучи от осветителя в

объектив микроскопа не поступают. Объект освещается косыми боковыми лучами, и в объектив попадают лучи, рассеянные частицами, находящимися в препарате.

Видим: ярко-светящихся м. о. на темном поле.

Настройка: —

- установить свет

- заменить светлопольный конденсор на темнопольный

- на верхнюю линзу конденсатора нанести иммерсионное масло и поднять конденсор до соприкосновения нижней поверхностью предметного стекла.

- объектив Х8.0 фокусируют на препарат.

- с помощью центровочных винтов переводят в центр поля зрения светлое пятно.

- поднимая и опуская конденсор, добиваются исчезновения яркого пятна - должно быть равномерное освещение.

- затем устанавливают объектив X 40.0 и исследуют объект.

4. Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ светится при освещении их УФЛ или синем светом. При освещении синем светом свечение от зеленого до красного цвета. Под влиянием УФЛ свечение любого цвета.

Алгоритм люминесцентной микроскопии:

1. приготовить мазок, высушить, зафиксировать.

2. окрасить растворами люминесцирующих красителей - хлюорохромами, которые избирательно взаимодействуют с определенными структурами клетки. Флюорохромы отличаются от обычных красителей тем, что используются в очень малых концентрациях и ими могут быть окрашены фиксированные и живые клетки. Вариант данной микроскопии - РИФ - реакция иммуно-флюоресценции - используется для экспресс-диагностики.

Способы окраски

1. Простой способ окраски

Использование одного вида красителя:

а. растворы метиленового синего, время окраски 3-5 мин

б. растворы фуксина, время окраски 1-2 мин.

в. растворы бриллиантового зеленого, время окраски 3 -5 мин.

Данный способ прост в работе, позволяет изучить форму клетки и.о.,

взаиморасположение.

2.Сложные способы окраски.

Они позволяют:

- выявить определенные структуры и.о. (капсулы, споры, жгутики, нуклеонид)

- провести дифференциацию видов м.о. (Г_р+ и Г_р- кислотоустойчивые и некислотоустойчивые)

При окраске сложным способом используют: 2-3 красителя, протраву, дифференцирующее вещество.

Окраска по Грому.

Дифференциация м.о. на Г_р+ и Г_р- основано на различии строения клеточной стенки. У Г_р+ м.о. в клеточную стенку входит многослойный пептидогликан, с которым связаны тейхоевые к-ты. Этот комплекс образует прочное соединение с генцианвиолетом, не разрушающееся при воздействии спирта 96°

У Г_р- м.о. пептидогликан однослойный, тейхоевых к-т мало, больше фосфолипидов и липопротеидов, что создает непрочное соединение с генцианвиолетом, окрашиваясь дополнительным красителем - фунсином.

Используемые красители:

а) карболово-спиртовый генцианвиолет

б) фуксин Пфейффера протравка: Р-Р Люгеля

Диф. в-во.: 96° этиловый спирт

Г_р+ м.о. окрашивается в фиолетовый цвет - стафилококки, стрептококки, пневмококки.

Г_р- м.о. окрашивается в малиновый цвет - менингококки, гонококки.

Этапы окраски.

- на препарат кладут бумажку по Синеву и сверху наносят н/к физ. р-ра. Окрашивают 1-2 мин.

- снять пинцетом бумажку с препарата, слить в лоток избыток краски

- не промывая препарат Н2О, нанести несколько капель р-ра Люголя и держать

до полчернения препарата» 1 мин.

не промывая препарат Н₂0, нанести сверху р-р 96 этилового спирта; держать

сс/с

до отхождения красителя - 30-40 сек.

- промыть физ. р-ром или стер. дист. Н₂0

- докрасить фуксином Пфейффера- 3 мин.

- промыть физ. р-ром или стер. дист. Н₂0

Самостоятельная работа студента.

1. Приготовить 2 препарата из микробной культуры.

2. Окрасить простым способом (м/с) и сложным по Граму

3. Провести иммерсионную микроскопию, зарисовать.

Методическое указание к практическому занятию № 4. тема:«Изучение шаровидных форм бактерий. Окраска по Бури - Гинсу и Ожешко».

План занятия.

- Морфологические особенности шаровидных форм бактерий.

- Тинкториальные свойства шаровидных форм бактерий.

- Окраска по Бурри - Гинсу, и Ожешко.

Студенты должны ЗНАТЬ по данной теме:

4. Морфологические структуры, размеры шаровидных форм бактерий.

5. Микроскопию шаровидных форм.

6. Методики окраски по Бурри - Г инсу и Ожешко.

УМЕТЬ выполнить самостоятельно:

2. Провести микроскопию демонстрационных препаратов шаровидных форм бактерий, зарисовать.

3. Приготовить препарат из капсульных бактерий, окрасить по Бурри - Г инсу,.3, провести микроскопию, зарисовать.

7. Приготовить препарат из споровой культуры, окрасить по Ожешко, провести микроскопию, зарисовать.

СОДЕРЖАНИЕ.

Шаровидные бактерии - КОККИ имеют средний диаметр около 1 мкм. В зависимости от их расположения в мазке, что определяется характером деления клеток, патогенные кокки подразделяются на ЛОКОККИ (двойной), СТРЕПТОКОККИ (цепочечный) и СТАФИЛОКОККИ (виноградная гроздь). Диплококки и стрептококки делятся в одной плоскости, но остаются соединенными цитоплазматическими мостиками. К диплококкам относятся:

- ПНЕВМОКОККИ- диплококки ланцетовидной формы.

- МЕНИНГОКОККИ- диплококки бобовидной формы.

- ГОНОКОККИ- диплококки бобовидной формы.

Стафилококки делятся в двух плоскостях и образуют скопления клеток, напоминающие грозди.

НЕПАТОГЕННЫЕ кокки располагаются беспорядочно (микрококки) тетрадами и пакетами по 8-16 особей (сардины). Тетракокки и сарцины делятся в двух-трех плоскостях.

СПОР и ЖГУТИКОВ патогенные кокки не образуют. Капсулы имеют только некоторые кокки, например - ПНЕВМОКОККИ.

ТИНКТОРИАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА.

Гр+, Гр -

1. стафилококки 1. менингококки

2. стрептококки 2.гонококки

3. пневмококки

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ЗНАЧЕНИЯ КЛЕТКИ.

Наименование Наличие Значение Способ выявления

Нуклеотид + носитель ген.

Клеточная стенка + информации

Капсула +,- защитная в макро- по Гинсу

организме

Жгутики - органы движения

Споры - защитное во внешней

среде по Ожешко

АЛГОРИТМ ОКРАСКИ ПО БУРРИ-ГИНСУ.

1. На предметное стекло (ближе к узкому краю) нанести каплю черной туши, разведенной 10 раз.

2. В нее внести каплю культуры, перемешать две капли.

1. Ребром шлифовального стекла сделать мазок, так же как и мазок крови.
2. Высушить на воздухе.
3. Зафиксировать химическим способом.

6. Осторожно промыть водой.

7 Окрасить фуксином Пфейффера - 3-5мин.

8 Осторожно промыть водой, высушить на воздухе.

Внимание! Фильтровальной бумагой для высушивания препарата не пользоваться, не повредить препарат.

Микроскопия иммерсионная. Видим: фон препарата черный, клетки красные, капсулы не окрашены, в виде бесцветного ореола вокруг клетки.

АЛГОРИТМ ОКРАСКИ ПО ОЖЕШКО

1 На высушенный на воздухе мазок налить несколько капель 0,5% р-ра хлороводородной к-ты.

2 Подогреть до образования паров.

3 Высушить и зафиксировать над пламенем спиртовки.

4. Фиксированный препарат покрыть фильтровальной бумагой и нанести фуксин Циля.

5. Удерживая стекло пинцетом, препарат подогреть над пламенем спиртовки до отхождения паров. Добавляя красителя подогреть 2-3 раза.

6. После охлаждения препарата снять бумажку и промыть водой.

7. Препарат обесцветить 5 р-ом серной кислоты, погружая 2-3 раза в р-р.

8. Промыть водой.

9. Окрасить вводно-спиртовым р-ом метиленового синего в теч.3-4мин.

10. Промыть водой, высушить.

Микроскопия иммерсионная. Споры-красные; клетки-синие.

---

Дата добавления: 2015-08-28