Роль метилирования ДНК в канцерогенезе

4.1 Мутации метилированной ДНК

Метилированные CpG динуклеотиды представляют собой горячие точки для мутации. Особенно важно это свойство в случае инактивирующих мутаций генов-супрессоров. Анализ ассоциации мутаций гена-супрессора р53 с сайтами метилирования показал, что в 25% всех проанализированных опухолей мутации р53 происходят именно в сайтах метилирования. В случае колоректального рака, частота подобных мутаций достигает 50%. Так как до сих пор не обнаружен внешний фактор, способный привести к этому эффекту, считается, что мутации метилированных цитозинов происходят вследствие эндогенных внутриклеточных процессов.

Как правило, наличие подобных горячих точек объясняется предрасположенностью 5-метил-цитозинов к спонтанному гидролитическому деаминированию, приводящему к превращению цитозина в тимин. Однако ошибки процесса метилирования также могут вносить свой вклад в повышение частоты мутаций. Было показано, что ДНК метилтрансферазы способны приводить к превращению цитозина в урацил в случае недостатка S-аденозилметионина. Более того, Ебра и Бхават показали, что активный центр метилтрансферазы способен конвертировать 5-метил-цитозин в тимидин.

Участие ДНК метилтрансфераз в мутагенезе подразумевает наличие повышенной экспрессии фермента, пониженной концентрации S-аденозилметионина и снижения активности соответствующей системы репарации. Действительно, было показано, что активность метилтрансфераз повышена в опухолевых клеточных линиях в 4-3000 раз по сравнению с нормальными тканями, однако наличие биохимических условий необходимых для превращения цитозина в тимин или урацил пока не было показано.

Снижение среднего уровня метилирования ДНК в опухолевых клетках

Снижение общего уровня метилирования в опухолевых клетках было обнаружено более десятилетия назад. В различных экспериментальных моделях было показано, что снижение общего количества метильных групп происходит на ранних стадиях канцерогенеза, предшествуя развитию опухоли. Исходя из экспериментов, продемонстрировавших, что снижение количества доноров метильных групп в пище приводит к развитию опухолей печени у крыс, было предположено, что снижение метилирования ДНК напрямую связано с процессом канцерогенеза.

Несмотря на чёткую ассоциацию снижения общего уровня метилирования ДНК со спонтанными и индуцированными опухолями, роль этого изменения не ясна. В 1983 Файнберг и Фогельштайн представили данные о снижении метилирования в промоторах онкогенов c-Ha-ras и c-Ki-ras в опухолях легкого и толстого кишечника. На основании этих данных было предположено, что активация онкогена является канцерогенным результатом снижения метилирования ДНК. Однако эта гипотеза не была подтверждена достаточным количеством экспериментальных данных.

Альтернативная гипотеза была предложена Шмидтом, который наблюдал нарушение динамики хромосом при репликации после снижения общего уровня метилирования ДНК с помощью обработки клеток 5-аза-2'-деоксицитидином. Шмидт предположил, что деметилирование ведёт к нарушению структуры хромосом, что в слою очередь, приводит к злокачественной трансформации.

4.2 Региональное гиперметилирование в опухолях

Наряду со снижением общего уровня метилирования ДНК, в опухолях обычно наблюдаются участки ДНК с ненормально повышенным уровнем метилирования. Так как большая часть неметилированных цитозинов располагается внутри CpG островков в регуляторных участках генов, предполагается, что именно эти цитозины подвергаются аберрантному метилированию в опухолевых клетках. Это предположение подтверждается данными Байлина с коллегами, показавшего, что неметилированный в нормальных тканях CpG островок в промоторе гена кальцитонина, расположенного на коротком плече хромосомы 11 (11р), метилирован с высокой плотностью в человеческих солидных опухолях, лейкемиях и клетках, трансформированных различными вирусами. Кроме того, на этом же участки хромосомы, содержащем несколько потенциальных генов-супрессоров, были обнаружены и другие аберрантно метилированные CpG островки. На основании этих данных была выдвинута гипотеза, что данный участок хромосомы 11p является горячей точкой метилирования CpG островков в неоплазии и это аберрантное метилирование является важным механизмом выключения генов-супрессоров.

Тогда же Антиквера и Бёрд показали, что несколько CpG островков ассоциированных с регуляторными участками генов, гиперметилированы в иммортализованных человеческих и мышиных клеточных линиях. Авторы постулировали, что вплоть до половины CpG островков генома может быть метилировано в таких клетках. На основании этих данных была предложена концепция ассоциированной с метилированием инактивации генов – MAGI.

Позднее, ассоциированная с метилированием CpG островка в промоторе потеря экспрессии была показана для гена ретинобластомы (Rb) в 10% случаев спорадической ретинобластомы. В нескольких публикациях было продемонстрировано de novo метилирование CpG островка в промоторе ингибитора циклин зависимых киназ p16. Это аберрантное метилирование, наблюдаемое в опухолевых клеточных линиях и образцах опухолевой ткани, коррелировало с потерей экспрессии p16.

Промоторы нескольких генов были проанализированы в случае колоректального рака. Особенно интересные результаты были получены при анализе короткого плеча хромосомы 11. Промоторы двух генов расположенных на этом участке - WT1 и кальцитонин были гиперметилированы в большинстве исследованных образцов (68-74%). Кроме того гиперметилирование промотора ведущее к потере экспрессии было показано для гена APC (хромосомный локус 5q21-q22) в половине исследованных образцов спорадических опухолей ободочной и прямой кишки. Гиперметилирование промотора АРС наблюдалось преимущественно на поздних стадиях развития опухоли, что позволяет предположить важность этого гена для прогрессии, а не для инициации опухоли. Кроме того, подавление экспрессии за счёт метилирования промотора было показано для гена hMLH1. В этом случае потеря экспрессии гена обычно сравнивается с мутацией ведущей к потере функции фермента. Дополнительное доказательство роли метилирования ДНК на поздних стадиях развития опухоли толстого кишечника основано на работе Иссы с коллегами, который показал повышенную активность метилтрансферазы DNMT1 на стадии карциномы но не аденомы.

Одно из наиболее убедительных доказательств прямого участия метилирования ДНК в канцерогенезе было получено Лайрдом с коллегами при использовании модели APCMIN мыши, несущей наследственную мутацию гена АРС. Наличие этой мутации приводит к развитию сотен кишечных полипов на ранних этапах развития. Ингибирование метилирования с помощью 5-аза-2’-деоксицитидина приводит к тому, что количество полипов в кишечнике APCMIN мыши снижается в десятки раз. Хотя механизм этого эффекта до конца не ясен, полученные результаты подтверждают значение метилирования ДНК для канцерогенеза.

Обобщая приведенные выше данные можно утверждать, что повышение метилирования в промоторе генов-супрессоров может приводить к потере их экспрессии и, тем самым, способствовать инициации и прогрессии опухоли.

4.3 Роль метилирования при канцерогенезе

Для понимания роли метилирования при канцерогенезе необходимо знание закономерностей протекания этого процесса в нормальном организме. Клетки млекопитающих обладают способностью эпигенетически модифицировать свой геном путем энзиматического по пятому положению метилирования остатков цитозина в составе 5/-CpG динуклеотидов. Цитозиновый остаток в составе 5/-GpC или любых других динуклеотидов не метилируется. Приблизительно 70-80% CpG динуклеотидов в геномах млекопитающих метилированы. Одновременно, их распределение в ДНК является не случайным, и, в целом, геномы обеднены по отношению к CpG динуклеотидам. Предполагается, что именно метилирование сыграло в этом критическую роль. 5-МеС в составе CpG динуклеотидов гипермутабилен, поскольку аминогруппа в шестом положении цитозинового кольца крайне нестабильна. 5-МеС может легко подвергаться спонтанному дезаминированию с образованием тимина. Это обстоятельство вело в процессе эволюции к многочисленным заменам пар G-C на А-Т, в результате чего динуклеотидов CpG в составе ДНК приблизительно в 5 раз меньше (~1 CpG на 80 динуклеотидов), чем следовало бы (1 на 16) [2] Существуют два вида распределения CpG динуклеотидов в составе ДНК млекопитающих. Первое - это рассеянные CpG (их ~80% от общего количества). Они рассредоточены по всему геному в виде одиночных динуклеотидов, причем особой закономерности в их распределении выявить невозможно. Чаще всего они встречаются в интронах и намного реже в транскрибируемых областях. Значительная часть тканеспецифичных генов имеют в своих промоторах одиночные CpG. Степень их метилирования может быть различной в разных клетках и тканях [3]. Второй вид распределения заключается в следующем. В геномах млекопитающих существуют короткие (от 500 до 5000 пар нуклеотидов) последовательности, где CpG динуклеотиды распределены кластерами. Плотность их близка к расчетной (1 на 16), а содержание G + C превышает 60%. Такие последовательности получили название CpG-островков. Характерным свойством этих структур является их частая локализация в 5/-регуляторных районах генов, но они также встречаются и в интронах, а также на 3/- концах генов. Свыше половины генов, составляющих функционирующий геном человека, содержат CpG-островки. К их числу относятся, по-видимому, все гены домашнего хозяйства, около 40% тканеспецифичных генов, многие протоонкогены и гены супрессоры опухолевого роста. CpG-островки, ассоциированные с регуляторными областями генов, неметилированы во всех тканях эмбриона и взрослого организма (включая и гаметы), независимо от того, экспрессируются в них гены или нет. Исключение составляют только гены, расположенные на инактивированной Х-хромосоме у самок, а также импринтированные гены, которые экспрессируются только с одного из двух аллелей, материнского или отцовского. У этих генов в нормальных клетках CpG-островки метилированы [4].

В настоящее время у млекопитающих, включая человека, известны четыре фермента, осуществляющие метилирование геномной ДНК. Это ДНК-метилтрансферазы: Dnmt1, Dnmt2, Dnmt 3a и 3b. Dnmt1 - наиболее изученный на сегодня фермент системы метилирования ДНК у позвоночных. Гомозиготная делеция dnmt1 у мышей приводит к летальному исходу на стадии эмбриона. Именно это наблюдение явилось доказательством необходимости метилирования ДНК у высших эукариот. В структуре Dnmt1 были выявлены два домена: каталитический и регуляторный. Каталитический домен локализован в С-концевой области белка и структурно близок к бактериальным цитозиновым метилтрансферазам. В свою очередь, регуляторный домен расположен в N-концевой части Dnmt1 и содержит специальную сигнальную последовательность, направляющую фермент в активные репликативные комплексы делящихся клеток. Активность фермента резко возрастает с началом синтеза ДНК и в первые минуты после репликации профиль метилирования дочерней нити воссоздается по образцу материнской. Dnmt 3a и 3b, как оказалось, необходимы для метилирования de novo. Инактивация соответствующих генов несовместима с развитием зародыша у мыши. Ферменты экспрессируются на высоком уровне в эмбрионах и на очень низком в соматических клетках взрослого организма. Эти ферменты различаются по своим функциям, так как только Dnmt3b небходима для метилирования центромерных минисателлитных повторов. Функции Dnmt2 остаются пока неясными.

В настоящее время ничего не известно и о том, как происходит тотальное деметилирование генома в эмбриогенезе. Только совсем недавно была открыта ДНК-деметилаза, которая по своим свойствам является весьма вероятным кандидатом на роль фермента, осуществляющего тотальное деметилирование. ДНК-деметилаза способна узнавать метилированные CpG динуклеотиды и трансформировать 5-МеС в цитозин, не нарушая целостности ДНК. Что касается механизма локального деметилирования, то для нескольких тканеспецифичных генов установлено, что этот процесс контролируется определенными цис-действующими генетическими элементами, которые узнаются специфическими транс-действующими белковыми факторами [4].

Метилирование подавляет экспрессию на уровне транскрипции. Существует, по крайней мере, два механизма, с помощью которых метилирование может препятствовать транскрипции. Один из них заключается в прямом ингибировании связывания специфических транскрипционных факторов (c-Myc/Myn, AP-2, E2F и ATF/CREB-подобные белки), чьи сайты узнавания содержат одиночные метилированные CpG динуклеотиды. Второй механизм репрессии опосредуется через метил-CpG связывающие белки, такие как MeCP1 и MeCP2, известные также как MBD-семейство. Они не проявляют специфичности к последовательности немодифицированных нуклеотидов, но обладают высокой степенью родства к метилированной ДНК. Наиболее изученный из них, MeCP2 локализуется в ядре в гетерохроматине (неактивен, конденсирован, реплицируется в поздней S-фазе). Структура белка включает 2 домена: один связывает метилированные CpG, второй обеспечивает функции репрессора транскрипции. Взаимодействуя с метилированными основаниями, MeCP2 рекрутирует корепрессорный комплекс mSin3a/HDAC (гистондеацетилаза), который осуществляет деацетилирование N-концевых аминогрупп гистонов. В результате гистоны приобретают дополнительный положительный заряд и способность прочно взаимодействовать с витками нуклеосомной ДНК. Нуклеосомы компактизуются и теряют способность взаимодействовать с факторами транскрипции. Напротив, рекрутирование в комплекс с транскрипционными факторами белков с гистонацетилазной активностью (НАТ) способно снимать репрессирующее действие метилирования, приводя к образованию эухроматина (деконденсирован, потенциально активен, реплицируется в ранней S-фазе).

Таким образом, наряду с формированием репрессивных комплексов на основе обычных белков - репрессоров, узнающих специфические последовательности, высшие эукариоты с усложненным геномом обладают дополнительным уникальным эпигенетическим механизмом регуляции транскрипции, который наследуется дочерними клетками при делении.

4.4 Нарушения метилирования ДНК при канцерогенезе

За последние 15-20 лет было установлено, что паттерн метилирования в неопластических клетках значительно изменяется по сравнению с нормальными клетками, причем тотальное деметилирование генома сопровождается увеличением активности метилтрансферазы и локальным гиперметилированием CpG-островков. Во всех, без исключения, исследованных неоплазиях наблюдается подобный дисбаланс метилирования. В свете описанных выше функций метилирования в нормальных клетках, очевидно, что эти нарушения могут изменять структуру хроматина и функции ДНК, внося тем самым значительный вклад в создание генетической и фенотипической нестабильности опухолевой клетки [11].

4.5 Опухолевые клетки: свойства и метилирование ДНК

Исследования рака выявили относительно небольшой набор молекулярных, биохимических и клеточных признаков (приобретенных свойств), которые присущи большинству (если не всем) типов опухолевых клеток. Обретение клетками совокупности этих свойств есть необходимое и, по-видимому, достаточное условие развития злокачественной (дающей метастазы) опухоли.

Выделяют шесть основополагающих признаков злокачественного новообразования (см. Табл.1), порядок появления которых случаен. Только обладая всеми перечисленными свойствами, трансформированные клетки могут эволюционировать в метастазирующую опухоль. Единственная ситуация, при которой на протяжении относительного короткого срока (жизни индивидуума) становится возможным накопление в клетке нескольких (4-7) независимых генетических событий, это - дестабилизация ее генома. С этой точки зрения вклад эпигенетических событий в канцерогенез представляется наиболее очевидным в возникновении таких признаков, как нечувствительность к антиростовым сигналам ("эпимутация" Rb), инвазия и метастазирование (инактивация E-cad).

Принимая, однако, во внимание то обстоятельство, что механизмы апоптоза и ангиогенеза находятся под множественным контролем, включающим как позитивные (активирующие), так и негативные (ингибирующие) воздействия, нельзя исключить, что вклад эпигенетических факторов в нарушения онтогенеза и апоптоза также весьма значителен.

Более того, известные сегодня данные о влиянии аберрантного метилирования на сигнальные пути семейства р53 и о дестабилизирующем действии деметилирования ДНК свидетельствуют о том, что и кардинальное свойство опухолевой клетки - нестабильность ее генома - может иметь значительную эпигенетическую составляющую.

Таблица 1.

Приобретенные свойства раковой клетки [3]

Признак (пример)	Молекулярный механизм
Самообеспеченность ростовыми сигналами H-ras	Активация онкогена
Нечувствительность к антиростовым сигналам	Инактивация супрессора Rb
Блок апоптоза	Активация Bcl-2
Неограниченный потенциал деления	Активация теломеразы
Стимуляция ангиогенеза	Продукция индуктора VEGF
Инвазия и метастазирование	Инактивация E-cadherin

4.6 Метилирование CpG-островков в геноме опухлевых клеток

Аберрантное метилирование CpG-островков в опухоли - крупномасштабный феномен. Подавляющее число исследований метилирования CpG-островков в опухоли имело своей целью конкретные гены. В последнее время, однако, появилась возможность методом рестрикционно-ориентированного геномного сканирования анализировать одновременно статус метилирования тысяч CpG-островков. Таким способом были сопоставлены примерно 1200 CpG-островков в 98 опухолях человека разного происхождения и в соответствующей нормальной ткани. Такой "взгляд с птичьего полета" на глобальное метилирование генома нормальных и опухолевых клеток позволил прийти к важным выводам. Установлено, в частности, что метилирование CpG-островков проявляет, с одной стороны, определенную опухолевую специфичность (т.е. существуют сайты, метилированные во многих опухолях разной локализации и неметилированные в норме) и, с другой стороны, некоторую специфичность по отношению к разным видам опухолей (т.е. некоторые сайты метилированы в одних опухолях и неметилированы в других). Приблизительные расчеты показывают, что среднее число CpG-островков, гиперметилированньгх в геноме опухолевой клетки, составляет примерно 600 (от 0 до 4500) из общего их числа в геноме человека (примерно 45 000) и, следовательно, примерно таким же должно быть число аберрантно ингибированных в опухолевой клетке генов. Тот факт, что особой разницы в степени метилирования CpG-островков в зависимости от стадии опухолевого процесса не выявлено, свидетельствует о том, что соответствующие сдвиги появились на раннем этапе развития опухоли. Масштаб выявленных изменений позволяет предположить существование большого числа генов помимо уже установленных, критически важных для роста опухоли и ее прогрессии. Выявление CpG-островков, гиперметилированных в опухолях, есть первый шаг к идентификации близко расположенных генов, большинство из которых пока не установлено.

4.7 Полное гипометилирование генома и локальное гиперметилирование. Их роль. 5-МеС как эндогенный мутаген

Было обнаружено, что одним из первичных нарушений метилирования ДНК в неопластических клетках, является тотальное гипометилирование генома. Уменьшение количества метильных групп является одним из ранних, зачастую еще до появления сформированной опухоли, событием в клеточной трансформации. Напрямую роль гипометилирования ДНК в процессе клеточной трансформации была доказана на основании данных о том, что содержание грызунов на безметиониновой диете, ведущей к дефициту доноров метильных групп, вызывает гипометилирование ДНК и образование опухолей печени. Несмотря на явную ассоциацию гипометилирования ДНК с процессом образования опухолей, причины и конкретные механизмы, обуславливающие его канцерогенный эффект, до сих пор остаются неясными. Есть данные, что гипометилирование может затрагивать определенные онкогены, такие как К-ras при раке легкого и кишечника у человека. Эти локальные ген-специфические изменения возникают на ранних стадиях канцерогенеза и обнаружены, в частности, в доброкачественных полипах, которые являются предшественниками карциномы кишечника. Тем не менее, спектр генов, активируемых в опухолях в результате гипометилирования генома, ограничен. Вероятно, это объясняется тем, что гипометилирование затрагивает рассеянные CpG динуклеотиды. CpG-островки не могут быть объектами деметилирования. Исключение составляют импринтированные гены и гены на инактивированной Х-хромосоме у самок. Таким образом, деметилирование может затрагивать группы тканеспецифичных генов, содержащих в регуляторных областях одиночные CpG динуклеотиды. Нарушение импринтинга в результате деметилирования и его роль в канцерогенезе были доказаны при изучении опухоли Вильмса. Опухоль этого типа развивается у детей в раннем возрасте из метанефрических бластных клеток. Существуют спорадическая и наследственная формы заболевания. Было обнаружено, что в 70% случаев в опухолях Вильмса имеет место аберрантное деметилирование материнского аллеля и биаллельная экспрессия гена инсулинподобного фактора роста IGF2. Как известно, при сверхэкспрессии IGF2 проявляет свойства онкогена. Биаллельная экспрессия IGF2 часто наблюдается в фенотипически нормальных тканях окружающих опухоль, т.е. является ранним событием при возникновении опухоли Вильмса. Нарушение импринтинга IGF2 наблюдается более чем в 20 различных типах опухолей. Как уже упоминалось выше, тотальное гипометилирование генома может, изменяя структуру хроматина и переводя его в активное состояние, косвенно влиять на экспрессию генов. Так, было показано, что деметилирование генома нормальных клеток под воздействием 5-азацитидина ведет к трансформации некоторых клеточных культур и нарушению процесса расхождения хромосом во время митоза. Еще одним следствием тотального гипометилирования и, возможно, наиболее вероятным, является возникающая в результате нарушения паттерна метилирования общая нестабильность генома. Так гипометилирование ДНК в эмбриональных клетках мыши, нокаутированных по гену Dnmt1, увеличивало частоту реарранжировок эндогенных ретровирусов и паразитических последовательностей, частоту образования делеций и транслокаций некоторых уникальных генов, т.е. являлось причиной хромосомных аномалий и последующего летального исхода. Однако, для опухолевых клеток пока отсутствуют данные, которые подтвердили бы, что перечисленные нарушения, всегда присутствующие в них, являются прямым следствием тотального гипометилирования.

Локальное гиперметилирование распространяется на небольшую часть CpG динуклеотидов (~20%), которые входят в состав CpG-островков. CpG-островки, за известными исключениями, всегда неметилированы в нормальных клетках. Аберрантное гиперметилирование CpG-островков является особенностью иммортализованных и трансформированных клеток и связано с инактивацией определенных генов супрессоров опухолевого роста y человека [5]. Механизм локального гиперметилирования не вполне ясен. По-видимому, важную роль в этом процессе играет повышение метилтрансферазной активности, тем более что оно является характерным свойством опухолевых клеток. При исследовании некоторых клеточных культур было показано, что повышение ДНК-метилтрансферазной активности зачастую предшествует злокачественной трансформации. Так, трансфекция клонированного гена человеческой Dnmt1 в иммортализованные фибробласты человека приводит к аберрантному метилированию CpG-островков в промоторных зонах ряда генов, в том числе генов E-cad и HIC1. В тоже время, CpG-островки, ассоциированные с другими генами (например, с геном-супрессором p16INK4A), не меняют статус метилирования, несмотря на постоянную экспрессию Dnmt1. Таким образом, очевидно, что повышение активности Dnmt1 играет определенную роль в аберрантном метилировании CpG-островков. Однако простым повышением уровня экспрессии нельзя объяснить появление у фермента способности к метилированию de novo. По-видимому, в трансформированных и опухолевых клетках нарушен механизм защиты CpG-островков от метилирования. Кроме того, недавно было показано, что Dnmt1 является мишенью действия онкобелков Ras и Fos, то есть активность фермента регулируется внутриклеточными путями, передающими митогенные сигналы [3]. Гиперметилирование CpG-островков приводит к стабильной инактивации прилежащего гена, то есть феномену MAGI. Это происходит в результате возникновения стерических препятствий к связыванию транскрипционных факторов или гетерохроматинизации, опосредованной метилцитозин-связывающими белками MBD. Если прилежащим геном окажется ген домашнего хозяйства, то его инактивация будет летальна для клетки, но не будет иметь особых последствий для организма. Подавление экспрессии какого-либо из тканеспецифических генов нанесет определенный ущерб дифференциальному фенотипу клетки, не оказывая влияния на общую жизнеспособность. В то же время, инактивация гена супрессора опухолевого роста или гена репарации может создать условия для неконтролируемой пролиферации. Аберрантное метилирование CpG-островков является ранним событием в процессе возникновения опухоли. Например, гиперметилирование промоторного региона гена супрессора опухолевого роста p16INK4A при плоскоклеточном раке легкого было обнаружено уже в гиперплазии. Ген ретинобластомы - первый классический ген супрессор опухолевого роста, в отношении которого был установлен феномен MAGI. Важность этого гена определяется тем, что, как полагают, все (или почти все) антипролиферативные сигналы реализуются в клетке опосредованно, через белок Rb или родственные белки. Белок Rb синтезируется на протяжении всего клеточного цикла и почти все время присутствует в неполностью фосфорилированном виде. Такая форма белка способна связывать факторы, отвечающие за переход клетки из фазы G1 в фазу S, т.е. принимает участие в негативной регуляции клеточного цикла. Когда белок Rb фосфорилируется с помощью специфичных для клеточного цикла киназ (например, циклином D1/CDK4), связанные с ним эффекторы высвобождаются и запускают переход в S-фазу. Сама по себе, ретинобластома представляет собой опухоль, развивающуюся из эмбриональной сетчатки и наследуемую в большинстве случаев по аутосомно-доминантному типу с 90%-ной пенетрантностью. Кроме семейных случаев возникновения ретинобластомы описаны и спорадические случаи [6]. Гиперметилирование CpG-островка промотора гена Rb1 имеет место только при спорадической (унилатеральной) ретинобластоме в 10-15% случаев. К настоящему времени известно значительное число генов супрессоров опухолевого роста, инактивированных в различных опухолях путем гипеметилирования CpG-островков, локализованных в их регуляторных областях. Среди них: гены Rb1, р53, VHL, BRCA1, MLH1 и другие.

5-МеС может подвергаться спонтанному дезаминированию даже при обычных условиях тепловых флуктуаций, что делает CpG сайты "горячими точками" для возникновения мутаций. CpG динуклеотиды, расположенные в кодирующих регионах генов супрессоров опухолевого роста могут спровоцировать мутации, приводящие к возникновению опухоли. О серьезности этого феномена свидетельствует то обстоятельство, что из 300 мутаций гена р53, главного хранителя целостности генома, зарегистрированных в опухолях человека различной локализации, 25-30% относятся к мутациям этого типа или эпимутациям [6]. Увеличение мутабельности 5-МеС может быть обусловлено тремя факторами: различной эффективностью репарации, скоростью спонтанного дезаминирования и скоростью деления клеток. Дезаминирование 5-МеС приводит к образованию тимина, такого же естественного основания ДНК, как и другие, и поэтому возможны ошибки системы репарации. Серьезность проблемы состоит в том, что замены нуклеотидов возникают довольно часто. Согласно расчетам, за сутки в каждой клетке происходит ~100 реакций дезаминирования, из которых многие приводят к мутациям. Что касается третьего фактора, то оказалось, что связанные с CpG мутации быстрее происходят в поврежденных тканях в процессе восстановления.

4.8 Гены инактивированные метилированием в опухолях

Метилирование ДНК является важным элементом контроля экспрессии генов в клетках млекопитающих. Это регулируемый процесс и предполагается, что он играет важную роль в регуляции экспрессии генов в процессе развития и дифференцировки.

В сложных организмах метилирование ДНК обеспечивает механизм выключения больших групп генов в клетках определенного типа. Это выключение носит стабильный характер и наследуется данным типом клеток при делении. Метилированными в ДНК оказываются множество сайтов. Но только малая доля их вовлекается в регуляцию транскрипции. Чаще всего метилирование промоторной части гена приводит к подавлению его экспрессии, хотя это правило соблюдается не в 100% случаев.

Метилирование остатков цитозина может оказывать влияние на транскрипцию как непосредственно через изменение эффективности связывания позитивных и негативных факторов транскрипции со своими регуляторными участками на ДНК, так и опосредованно через формирование неактивных в транскрипционном отношении участков хроматина. Поскольку 5-mC структурно подобен тимину, метилирование остатков C может сопровождаться возникновением новых консенсусных последовательностей для некоторых факторов транскрипции. В частности, метилирование превращает низкоаффинный сайт связывания фактора транскрипции AP-1 (CGAGTCA) в высокоаффинный сайт (mCGAGTCA), который соответствует консенсусному сайту для этого фактора (TGAGTCA). Известные промоторы, за небольшим исключением (например, промотора гена главного комплекса гистосовместимости H-2K), неактивны в метилированном состоянии. Единственная метильная группа, введенная в промотор гена тимидинкиназы вируса простого герпеса или в С-промоторы вируса Эпштейна-Барр, может оказывать большое негативное влияние на транскрипцию. Уровень подавления активности других промоторов, в частности, промоторов альфа- и гамма-глобиновых генов человека или промотора мышиного гена MyoD1, находится в прямой зависимости от числа введенных в них метильных групп, но не от их положения в промоторах. Ингибирование транскрипции, вызванное частичным метилированием промоторов, может преодолеваться с помощью энхансеров, однако полностью метилированные промоторы не реактивируются энхансерами и сохраняют свое репрессированное состояние, несмотря на присутствие последних. На основании такого рода данных высказывается предположение, что метилирование ДНК регулирует транскрипцию по принципу "все или ничего" и не обеспечивает тонкой регуляции экспрессии генов[10].

В возникновение опухолей человека и их прогрессию вносят вклад как генетические, так и эпигенетические события, причем удельный вес тех и других в каждом конкретном случае варьирует в широких пределах. Иллюстрация этого положения на примере генов-супрессоров p16 и гена р15 приведена на рис.3.

Рис.3. Вклад генетических и эпигенетических событий в опухолеобразование [3].

Ген p16 кодирует конститутивно экспрессируемый ингибитор циклинзависимой киназы. Белок р16 играет ключевую роль в контроле клеточного цикла, блокируя сигнальный путь циклин-D-Rb. Утрата этого белка или его инактивация ведут к тому, что клетка теряет контроль над клеточным циклом: циклинзависимая киназа фосфорилирует Rb, в результате чего из неактивного комплекса высвобождаются факторы транскрипции E2F. В итоге активируются гены, обусловливающие вхождение клетки в фазу S клеточного цикла. Повреждения или делеции этого гена так часто регистрируются в опухолях самого разного происхождения, что возникло представление о нем как о наиболее часто поражаемом при канцерогенезе гене-супрессоре. Гиперметилирование CpG-островка в 5'-области этого гена составляет по разным данным от 20 до 67% солидных опухолей человека разной локализации.

К группе “генов общего контроля” относят и те гены-супрессоры, продукты которых не входят в системы репарации ДНК непосредственно, а принимают участие в организации “контрольного пункта” проверки ДНК перед переходом клетки к следующей стадии клеточного цикла, обеспечивающего две основных контролирующих функции: 1) проверку того, что предыдущая стадия завершена полностью, и 2) в случае необходимости создания возможности для прохождения репарации ДНК перед началом репликации. В частности, это означает, что разрывы в цепи ДНК приводят к задержке клеточного цикла в фазе G1, препятствуя переходу клетки в фазу S. Ключевую роль в этом процессе играет один известный ген-супрессор – p53, мутации или делеции которого наблюдали примерно в 50% всех злокачественных заболеваний [9]. Ген р53 картирован и клонирован на коротком плече хромосомы 17р13 и занимает 200 т.п.н. геномной ДНК, состоит из 11 экзонов, первый из которых является некодирующим. Ген кодирует мРНК длиной 2,8 тысяч нуклеотидов. Белок массой 53Кда является фосфопротеином и состоит из 393 аминокислот.

Белок р53, функционирующий в виде тетрамера, связывается с убиквитином при участии фактора MDM2 и подвергается деградации (см.Рис.3). Белок р19/ARF, экспрессия которого увеличивается под действием онкостимулами типа E1a, V-abl, myc, нарушает это связывание и предотвращает деградацию р53. Также ингибитором этого связывания является продукт гена АТМ, повреждения которого вызывают атаксию-телангиоэктазию. Белок p53 способен функционировать также как активатор транскрипции. Показано, что множественные повреждения ДНК вызывают экспрессию гена p53 [7], который, в свою очередь, активирует транскрипцию гена р21/WAF1, кодирующего ингибитор циклин-зависимых киназ CIP1. CIP1 избирательно подавляет активность циклин D1/CDk4 и циклин E/CDk2-комплексов, что и приводит к задержке перехода клетки из фазы G1 в фазу S (см.Рис.4).

Рис.4. Схема действия белка р53 [5].

Запускающая этот каскад индукция p53 происходит в ответ на любые неспецифические, повреждающие ДНК, воздействия, такие как ионизирующая радиация, свободные радикалы, действие эндонуклеаз рестрикции [5]. Одновременно с подавлением репликации ДНК, белок p53 стимулирует ее репарацию, активирует транскрипцию гена GADD45, а также связывается с белком ERCC3, непосредственно участвующем в распознавании и вырезании поврежденных участков ДНК.

Герминальные миссенс-мутации гена-супрессора p53 приводят к довольно редкому синдрому Ли-Фраумени, при котором типичными являются опухоли мозга, мягкотканные саркомы различной локализации, остеосаркомы, лейкемия и карциномы молочной железы. Выявлена кластеризация мутаций в районе 14 кодонов (245-258). В то же время различные повреждения гена выявляют практически во всех типах опухолей. Частота миссенс-мутаций гена составляет 74%, сдвига рамки считывания - 11%, нонсенс-мутаций - 7%, мутаций сайта сплайсинга - 4%. Определено 7 “горячих” точек, повреждаемых мутациями: кодоны 130-142, 151-164, 171-181, 193-200, 213-223, 234-258 и 270-286, причем все они локализованы в эволюционно консервативном ДНК-связывающем домене, кодируемом экзонами 5-8. Мутации кодонов 157 и 179 наиболее часто выявляются при раке легкого, кодона 175 - при раке толстого кишечника, кодона 248 - при сквамозных карциномах головы и шеи, кодона 249 - при гепатокарциноме и кодона 278 - при опухолях кожи [3].

Этот ген, играющий чрезвычайно важную роль хранителя генома, нарушения которого идентифицированы не менее чем в половине случаев рака человека, не содержит в своей промоторной части СрС-островка. Следовательно, феномен MAGI на него не распространяется. Тем не менее, вклад метилирования в инактивацию р53 велик, но обусловлен он в этой ситуации не эпигенетическим (как в большинстве случаев), а генетическим механизмом. Одиночные и метилированные динук-леотиды CpG, в значительном числе присутствующие в теле гена, в силу своей гипермутабильности способствуют возникновению замен пары G-C на А-Т (примерно треть из более, чем 300 мутаций, зарегистрированных в гене р53, принадлежит к этому типу).

Ген р73, содержащий в промоторной части большой и типичный CpG-островок, редко обнаруживает мутации, столь типичные для р53. Гиперметилирование этого гена обнаружено при остром лимфобластном лейкозе и лимфомах.

Дата добавления: 2015-12-08