1. Методы титрования вирусов

1. Методы титрования вирусов

1.1 Титрование вирусов гриппа в реакции гемагглютинации

Как и многие другие вирусы животных, вирусы гриппа агглютинируют эритроциты. В основе агллютинации лежит взаимодействие гемагглютинина, одного из поверхностных вирусных белков, с рецепторами, расположенными на поверхности эритроцитов. Поскольку каждая вирусная частица содержит не одну молекулу гемагглютинина, образующего шиловидные выступы, при достаточно высокой концентрации вируса формируются крупные агрегаты эритроцитов со структурой типа сети.

Образование таких агрегатов легко наблюдать в лунке или пробирке с U-образным дном; в этом случае нормальные эритроциты образуют компактный осадок на дне пробирки, а агглютинированные оседают равномерно. Эта реакция исключительно удобна для количественного определения вируса.

Для постановки гемагглютинации определенное количество эритроцитов смешивают в лунках планшета с равным объемом исследуемой суспензии вируса в разных разведениях. Планшет затем инкубируют 30—45 мин при комнатной температуре без перемешивания. По результатам реакции можно определить, при каком разведении вирусного препарата утрачивается гемагглютинирующая активность. Количество вируса, агглютинирующее 50% эритроцитов, определяется как 1 гемагглютинирующая единица.

Таким образом, зная, какое разведение вируса соответствует одной ГАЕ, можно вычислить титр вируса в ГАЕ/мл. Значение ГАЕ зависит от условий анализа, в частности от объема реакционной смеси и концентрации эритроцитов; кроме того, постановка реакции в разных лабораториях может иметь свои особенности. Ниже приведена методика, постоянно используемая в лаборатории авторов.

ГАЕ — удобная единица для сравнения разных препаратов вируса, однако она не определяет ни общего количества вируса в препарате, ни количества инфекционных частиц. Тем не менее для любого конкретного штамма вируса соотношение между ГАЕ и другими единицами измерения количества вируса может быть определено эмпирически; затем, если вирус не претерпел генетических изменений, титр в ГАЕ можно использовать для расчета других параметров. Для большинства лабораторных штаммов вируса гриппа выполняется следующее приблизительное соотношение:

1 ГАЕ = 2-10 единиц инфекционности для куриных эмбрионов =2 10 БОЕ = 10 физических единиц.

Подготовка эритроцитов.

В реакции можно использовать эритроциты различного происхождения, например человека или морской свинки, но чаще всего используют куриные эритроциты. 1%-ную суспензию готовят следующим образом.

1. Кровь фильтруют через два слоя муслина.

2. Фильтрат центрифугируют 5 мин в настольной центрифуге при 1500 об/мин.

3. Супернатант и верхний слой осадка, состоящий из лейкоцитов, удаляют с помощью пастеровской пипетки, присоединенной к водоструйному насосу. Клетки 3 раза промывают физиологическим раствором, суспензируя осадок и повторно осаждая эритроциты при 1500 об/мин.

4. Эритроциты ресуспендируют в физиологическом растворе и получают плотный осадок центрифугированием при 2500 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывают, а осадок эритроцитов суспендируют в 100-кратном объеме физиологического раствора. Суспензию тщательно перемешивают и хранят при 4°С.

Постановка реакции.

1. В лунках планшета готовят последовательные двукратные разведения вирусной суспензии с неизвестным титром на физиологическом растворе; объем суспензии в каждой лунке должен быть равен 0,25 мл. В опыт включают также и контрольную лунку с физиологическим раствором.

2. 1%-ную суспензию эритроцитов интенсивно встряхивают и вносят в каждую лунку в количестве 0,25 мл. Смесь в лунках перемешивают, поворачивая планшет, и инкубируют планшет 45 мин без дальнейшего перемешивания на листе белой бумаги.

В предельном разведении, обладающем гемагглютинирующей активностью, наблюдается один из трех типов агглютинации, что можно использовать для приблизительного расчета титра вируса.

Более экономным методом определения титра является микровариант этой реакции, в котором используется по 0,05 мл суспензии вируса и эритроцитов; реакцию можно ставить в микропланшете для титрования. Следует, однако, иметь в виду, что в этом случае одна ГАЕ определяется как количество вируса в объеме 0,05 мл, агглютинирующее 50% эритроцитов в 0,05 мл 1%-ной суспензии.

Факторы, влияющие на результат реакции гемагглютинации.

Результаты реакции гемагглютинации могут искажаться лод действием ряда факторов.

1. Существенно, чтобы перед использованием кровь не хранилась слишком долго. Через 5—7 дней в ней начинается гемолиз, что делает исследование гемагглютинации сначала неточным, а затем вообще невозможным.

2. Поскольку при низкой концентрации эритроцитов получают завышенные значения титра вируса, суспензию эритроцитов перед использованием необходимо тщательно перемешать.

3. Учет результатов реакции не следует откладывать надолго. Помимо гемагглютинина на поверхности вирионов вируса гриппа локализован фермент нейраминидаза, отщепляющий •от олигосахаридов концевые остатки сиаловой кислоты. Поскольку гемагглютинин присоединяется к поверхности эритроцитов именно через остатки сиаловой кислоты, действие нейраминидазы нарушает связи между вирионами и клетками. Поэтому через некоторое время слой агглютинированных эритроцитов начинает разрушаться. Некоторые штаммы вируса гриппа имеют столь высокую нейраминидазную активность, что быстрое удаление клеточных рецепторов препятствует агглютинации при комнатной температуре. В этом случае рекомендуется ставить реакцию гемагглютинации при 4°С.

4. Результат реакции может быть искажен, если используемые планшеты недостаточно хорошо вымыты. Сразу же после окончания работы планшеты следует замочить на 1 ч в 4%-ном растворе NaOH, а затем тщательно промыть дистиллированной водой.

5. Вирусная суспензия может содержать вещества, специфически или неспецифически ингибирующие гемагглютинацию. Эта проблема особенно серьезна при титровании вируса в культуральной жидкости, поскольку входящая в состав питательных сред сыворотка крови содержит подобные ингибиторы. Многие из них могут быть инактивированы прогреванием сыворотки при 56 °С 30 мин; подробнее этот вопрос обсуждается в работе Хойла. В некоторых случаях, однако, возникает противоположная ситуация: некоторые препараты сывороток содержат факторы, вызывающие гемагглютинацию в отсутствие вируса. Поэтому необходимо одновременно с вирусом титровать образец среды от незараженных клеток.

6. Следует помнить, что и вирусы других семейств агглютинируют эритроциты и могут препятствовать проведению специфической реакции. Природу исследуемого вируса можно, разумеется, установить в реакции торможения гемагглютинации с использованием специфической антисыворотки против интересующего исследователя вируса.

Реакция торможения гемагтлютинации.

Способность вируса гриппа связывать и агглютинировать эритроциты можно использовать и для определения концентрации противовирусных антител в образцах сыворотки. Для этого проводят реакцию между последовательными разведениями сыворотки и известным количеством вируса, а затем добавляют суспензию эритроцитов; концентрацию антител определяют, исходя из последнего разведения сыворотки, еще способного тормозить гемагглютинацию.

1. Готовят последовательные двукратные разведения исследуемой сыворотки на физиологическом растворе. В зависимости от того, выполняется анализ в стандартных планшетах или в микропланшетах, объем каждого разведения должен составлять соответственно 0,25 или 0,05 мл.

2. В каждую лунку вносят по 4 ГАЕ стандартного вируса '. Антитела инкубируют с вирусом 30 мин при комнатной температуре.

3. В каждую лунку вносят нужное количество 1%-ной суспензии эритроцитов, перемешивают и продолжают инкубацию еще 30 мин.

4. Учитывают результаты и определяют концентрацию антител, исходя из последнего разведения сыворотки, еще способного тормозить гемагглютинацию.

Примечание. Следует включать в опыт соответствующие контроли, чтобы убедиться в правильности определения концентрации вируса, в том, что сыворотка сама по себе не вызывает гемагглютинации и что в отсутствие вируса эритроциты нормально оседают.

1.2 Титрование путем определения инфекционности для куриных эмбрионов

Количество инфекционного вируса в препарате можно определить по максимальному разведению, вызывающему инфекционный процесс в куриных эмбрионах. Минимальное количество вируса, заражающее 50% эмбрионов, называют единицей инфекционности для эмбрионов. Этот метод наиболее чувствителен и позволяет титровать небольшие количества инфекционного вируса, поскольку для многих штаммов 10 ЕИЭ₅о приблизительно соответствуют 1 БОЕ. По данным электронной микроскопии, 1 ЕИЭ₅₀ соответствует примерно 5—10 вирусным частицам.

Постановка титрования

1. Готовят последовательные 10-кратные разведения исследуемой суспензии вируса на растворе Хэнкса и вводят 0,1 мл каждого разведения в аллантоисную полость нескольких 11-дневных куриных эмбрионов. Количество эмбрионов, используемых для заражения каждым разведением, определяется требуемой точностью титрования, но, как правило, составляет не менее 10. Эмбрионы инкубируют в течение необходимого для размножения вируса времени.

2. Из каждого яйца отбирают аллантоисную жидкость и проводят реакцию гемагглютинации. При этом нет необходимости для каждого образца аллантоисной жидкости готовить последовательные разведения. В этом случае достаточно определить, размножался ли вирус в данном эмбрионе или нет. Для этого 25 мкл исследуемого образца разводят в 0,25 мл физиологического раствора в лунке планшета или в пробирке и добавляют 0,25 мл суспензии эритроцитов.

Расчет титра вируса

Имеется много способов расчета титра вируса в ЕИЭ50. Один из самых удобных методов описан Томпсоном. В примере, приведенном в табл. 1, по 0,1 мл каждого из последовательных 10-кратных разведений вируса вводили в 10 эмбрионов. Для каждого разведения в реакции гемагглютинации определяли количество эмбрионов, в которых размножался вирус, и вычисляли долю, которую они составляли от общего числа зараженных эмбрионов. Для каждого разведения рассчитывали «среднюю удельную инфекционность», представляющую собой среднее арифметическое удельной инфекционности данного и двух соседних разведений. Как правило, «подвижные средние» значения инфекционности образуют монотонно возрастающий ряд. Полученные средние значения используются для расчета дозы вируса со средней удельной инфекционно-стью 0,5. По определению эта доза содержит 1 ЕИЭ50. Точность результатов, полученных этим методом, можно оценить с помощью статистического анализа, описанного Томпсоном.

Таблица 1. Расчет титра вируса)

Разведение	Доза	log	Количество зараженных эмбрионов	«Удельная инфекциои-ность»	«Средняя удельная инфекционное™^
	Y-10-	—11+logY	0/10
ю-»	Y.10-	—10+logY	0/10		0,33
Ю-	Y-10-	-9 + logY	1/10	0,1	0,266
ю-	Y-10-	-8+logY	7/10	0,7	0,600
ю-	Y-10-	-7 + IogY	10/10	1.0	0,900
Ю-	Y-10-	-6+logY •	10/10	1,0

0,600-0,266 ⁼ 0,334 ⁼ ' я далее

—9+log Y+0,7—8,3+log Y-1 ЕИЭ50. Отсюда logY=8,3; Y-1,9910".

1.3 Титрование вирусов с использованием фрагментов эмбрионов

Использование фрагментов эмбрионов, т. е. кусочков скорлупы 11-дневных оплодотворенных яиц с присоединенной к ним хорионаллантоисной оболочкой, вместо целых эмбрионов лежит в основе весьма экономичного способа определения инфекционное™ препаратов, содержащих вирус гриппа. Данный метод, предложенный для титрования вируса гриппа еще до введения в практику культур клеток, и теперь весьма полезен для титрования штаммов вирусов, не размножающихся в культуре клеток или при отсутствии подходящей культуры.

Использование фрагментов хорионаллантоисной оболочки вместе со скорлупой существенно, поскольку скорлупа помогает сохранить ткань неповрежденной и действует как мощная буферная система, поддерживающая рН 7,5.

Получение фрагментов эмбрионов

1. Острые концы оплодотворенных 11-дневных яиц вскрывают ножницами и извлекают эмбрион. Если вместе с эмбрионом извлекается хорионаллантоисная оболочка, такое яйцо следует отбросить.

2. Скорлупу с оболочкой 2 раза промывают стандартной средой, и нарезают на продольные полоски шириной около 0,6 см. Эти полоски в свою очередь разрезают на квадратные кусочки.

3. Кусочки скорлупы хранят в чашках Петри со стандартной средой, Из каждого яйца можно получить до 100 квадратных кусочков площадью 6 мм.

Заражение фрагментов эмбрионов

1. Титрование можно проводить в небольших реакционных пробирках или, что более удобно, в планшетах для гемагглютинации.

2. Планшеты стерилизуют 95%-ным этанолом. Избыток этанола удаляют и заворачивают каждый планшет отдельно в стерильную бумагу. Планшеты выдерживают в термостате в течение ночи для полного испарения этанола. После этого планшеты готовы к использованию.

3. Фрагменты эмбрионов помещают в планшеты и добавляют в каждую лунку по 0,3 мл стандартной культуральной среды. Инкубация фрагментов эмбрионов при комнатной температуре в течение нескольких часов или при 37°С в течение 24 ч при перемешивании не влияет на последующее размножение вируса.

4. Готовят последовательные 10-кратные разведения исследуемого вируса и вносят в лунки по 0,025 мл каждого разведения.

Инкубация образцов

1. При исследовании большого числа вирусных образцов планшеты ставят стопкой один на другой, сделав между ними прокладки толщиной 0,3 см, для обеспечения эффективной аэрации.

2. Стопку планшетов помещают на подходящую подставку и окружают влажной ватой.

3. Всю конструкцию фиксируют клейкой пленкой или алюминиевой фольгой, помещают в термальную комнату и интенсивно встряхивают 2—3 сут в зависимости от исследуемого штамма вируса. Рекомендуется использовать горизонтальный шейкер. Интенсивное встряхивание позволяет избежать накопления токсичных метаболитов и обеспечить эффективную аэрацию клеток.

Учет результатов

По окончании инкубации из лунок планшета пинцетом с тонкими концами удаляют фрагменты эмбрионов и вносят в каждую лунку по 0,25 мл стандартной 1%-ной суспензии эритроцитов. Планшеты быстро встряхивают и оставляют на 30 мин на белом фоне. Гемагглютинация свидетельствует о размножении вируса. Титр вируса определяют так же, как и при использовании целых эмбрионов.

Приготовление стандартной среды

Готовят следующие навески: NaCl —8,0 г КС1 — 0,6 г СаСЬ —0,8 г MgCl₂ — 0,05 г Глюкоза — 0,3 г

Желатин —2,0 г

Хлорамфеникол — 0,1 г К навескам добавляют нейтральный красный и воду — до 1 л. рН доводят приблизительно до 7,0, добавляя несколько капель 1 Н NaOH. Нейтральный красный действует как индикатор; при рН 7,0 раствор должен иметь желто-оранжевую окраску. Раствор стерилизуют автоклавированием 30 мин при 115°С.

1.4 Титрование вирусов гриппа методом бляшек

При работе данным методом последовательные 10-кратные разведения вируса готовят на PBS, содержащем 0,5% желатина. Культуру для титрования можно выращивать в любом культуральном сосуде подходящего объема, но удобнее всего использовать шестилуночные планшеты. Это позволяет провести все титрование в одном термостате и избежать ошибок из-за неправильной нумерации чашек. В тех случаях, когда необходимо строго контролировать температуру, например в опытах с температурно-чувствительными мутантами при неразрешающей температуре, планшеты можно соединить в стопку, запечатать в пластиковом мешке и поместить в термостатированную водяную баню. При этом резко снижается вероятность искажения результатов из-за падения температуры при открывании дверцы термостата.

Заражение монослойных культур

Существенно, чтобы перед началом титрования монослой клеток был плотным.

1. С культуры сливают среду и промывают монослой теплым PBS для удаления остатков сыворотки. Чтобы полностью покрыть монослой в чашке диаметром 4—5 см, вирус вносят в объеме 0,2 мл.

2. Вирус, начиная с максимального разведения, наносят в центр чашки по каплям и распределяют по поверхности монослоя. Если вирус наносят на периферию чашки, силы поверхностного натяжения не дают ему распределиться по поверхности, и образующиеся бляшки скапливаются на периферии.

3. Адсорбцию вируса проводят 30 мин при комнатной температуре. Полезно один или два раза во время адсорбции покачать чашки, чтобы обеспечить равномерное распределение вируса по монослою.

Нанесение покрытия

По окончании адсорбции вирус удаляют и наносят на монослой 2 мл покрытия, состоящего из культуральной среды с 0,7—1,25% агара. Необходимо следить, чтобы температура покрытия при заливке не была слишком высокой, в противном случае клетки погибнут. Однако не менее важно, чтобы агар не был и слишком холодным и не застыл в пипетке. Для клеток ФЭК оптимальная температура покрытия составляет 45 °С. Для приготовления покрытия смешивают равные объемы двукратного концентрата среды, нагретого до 45 °С, и двукратного концентрата агара, охлажденного до 60 °С. Готовое покрытие охлаждают до 45 °С.

Для быстрого плавления агара очень удобно использовать микроволновую печь. Важно избегать образования пузырей, поскольку они могут исказить конечные результаты, имитируя бляшки или, наоборот, маскируя их. Если титрование проводят на клетках, менее устойчивых к высокой температуре, чем ФЭК, вместо агара рекомендуется использовать агарозу с низкой температурой гелеобразования, застывающую при температуре ниже 37 °С. Можно использовать в качестве покрытия и среду с карбоксиметилцеллюлозой. При этом нет необходимости строго выдерживать температурный интервал, как при работе с агаром, однако использование КМЦ может приводить к искажению формы бляшек, если во время титрования чашки сдвигаются или наклоняются.

Окрашивание бляшек

Обычно через 2—3 дня после заражения бляшки достигают такого размера, что их можно обнаружить при окрашивании. Если инкубацию клеток проводят под агаровым покрытием, для окрашивания можно использовать нейтральный красный.

1. Содержащую агар среду для покрытия готовят, как описано выше, и добавляют нейтральный красный до конечной концентрации 0,1%.

2. На каждую чашку диаметром 4 см наносят 2 мл этой среды, как описано выше.

3. Чашки вновь помещают в термостат на 3—4 ч; за это время бляшки становятся видимыми.

Если нет возможности подсчитать бляшки сразу же после окрашивания, следует иметь в виду, что они остаются видимыми по крайней мере в течение 48 ч, причем их размер не увеличивается при помещении в герметически закрытый контейнер в атмосфере 5%-ного СОг при 4°С. Если необходимо получить более стабильный препарат, применяют альтернативный метод окрашивания. В этом случае агаровое покрытие удаляют и фиксируют клеточный монослой буфером с формальдегидом.

Содержание

Введение

1. Методы титрования вирусов

1.1 Титрование вирусов гриппа в реакции гемагглютинации

1.2 Титрование путем определения инфекционности для куриных эмбрионов

1.3 Титрование вирусов с использованием фрагментов эмбрионов

1.4 Титрование вирусов гриппа методом бляшек

Введение

Вирусы гриппа — это содержащие однонитевую РНК оболочечные вирусы, вызывающие серьезные эпидемические заболевания человека и многих видов животных, в частности лошадей, свиней, тюленей и домашней птицы. Известны три типа данных вирусов, выделенные на основании различий между нуклеокапсидами в реакции связывания комплемента; они отличаются также по биохимическим и биологическим свойствам. Вирусы типа А, способные к быстрым и резким изменениям антигенных свойств, являются главной причиной пандемий гриппа человека; поэтому они исследованы наиболее подробно. Большинство методов выращивания, очистки и титрования вирусов гриппа разработаны именно для вирусов этого типа. Вирусы типа В, хотя и не способны к антигенному дрейфу, по всем остальным биохимическим и биологическим свойствам очень близки к вирусам типа А; поэтому их, как правило, можно выращивать и титровать, пользуясь теми же методами. С другой стороны, вирусы типа С по своим биохимическим свойствам весьма далеки от вирусов типов А и В; соответственно они имеют и другие ростовые свойства.

Министерство сельского хозяйства РФ

ФГОУ ВПО «Уральская государственная сельскохозяйственная академия»

Факультет ветеринарной медицины

Реферат

На тему:

Репликация

Выполнила:

Студентка ФВМ 3курса 4 п/группа

Винокурова Вера

Екатеринбург 2012г

Дата добавления: 2015-11-04