Тема: Микробиологическая диагностика инфекций, вызываемых спорообразующими анаэробными бактериями.

Протокол №

Тема: Микробиологическая диагностика инфекций, вызываемых спорообразующими анаэробными бактериями.

Цель

Метод и его содержание

Полученные результаты

Выводы

1. Провести выделение и идентификацию исследуемой культуры из глубины раны с подозрением на анаэробную газовую гангрену

Посев исследуемого материала в среду Вильсона-Блера и молоко

Ориентировочный ответ о наличии C. perfringens – через 2-4 ч культивирования. На среде Вильсона-Блера отмечают почернение среды ввиду восстановления сульфата натрия и образования сульфида железа, на среде с молоком образуется губкообразный сгусток, пронизанный пузырьками газа.

Бактериологическое исследование по выделению и идентификации предполагаемого возбудителя с целью установления этиологии заболевания.

1 этап. Посев исследуемого материала на среду для контроля стерильности (СКС) или какую-либо среду для выделения анаэробов (анаэробный кровяной агар, среда Китта-Тароцци и т. д.).

2 этап. Оценка посева исследуемого материала на СКС визуально и микроскопией препаратов, окрашенных по Граму.

Отсев характерных колоний на плотную питательную среду с целью получения изолированных колоний. Чашки инкубируют в анаэробных условиях.

3 этап. Характерные колонии отсевают на соответствующие питательные среды для выделения и накопления чистой культуры.

4 этап. Полученная чистая культура подлежит идентификации.

5 этап. Оценка посева культуры на «пестрый ряд»;

Оценка результата реакции нейтрализации на белых мышах с центрифугатом культуральной жидкости и противогангренозными антитоксическими сыворотками.

Для определения токсигенности культуры путем постановки РН смесь центрифугата исследуемой культуры с антитоксическими сыворотками вводят подкожно белым мышам. В случае нейтрализации токсина животные остаются живыми; при отрицательной РН – животные погибают.

Методы, среды и приборы для создания анаэробиоза

Метод Фортнера. Посевы проводят на чашку Петри с толстым слоем среды, разделённым пополам узкой канавкой, вырезанной в агаре. На одну половину засевают культуру аэроб­ных бактерий, на другую — анаэробных. Края чашки заливают парафином и инкубируют в термостате. Первоначально наблюдают рост аэробов, а затем (после поглощения кислоро­да) — рост анаэробов.

Метод Биттнера. К крышке чашки Петри с посевом исследуемого материала или выделенной культуры анаэробов прикрепляют пакет из фильтровальной бумаги, содержащей пирогаллол, К₂ СО₃ и тальк. Чашку герметизируют при помощи парафина или скотча. Содержимое пакета увлажняется за счет образующегося конденсата и ингредиенты вступают в реакцию, которая сопровождается поглощением О₂ и выделением СО₂.

Газ-пак (Generbag anaer). Система Generbag anaer состоит из воздухонепроницаемых пакетов, изготовленных из прозрачной пластмассы и генераторов, содержащих смесь веществ, поглощающих кислород.

Последовательность работы: вынуть генератор из пакета, поместить в нижнюю часть воздухонепроницаемого пакета, затем поместить чашки (или пробирки) с посевами и с помощью специальной скрепки закрыть пакет. Инкубация при 37⁰.

Среда Китта-Тароцци. Содержит мясо-пептонный бульон (МПБ), 0,5% глюкозы и 0,15% агара. На дно пробирки для адсорбции О₂ помещают кусочки вареной печени или фарша слоем 1-1,5 см и заливают 6-7 мл среды. Среду перед посевом регенерируют (прогревают 15-20 мин на водяной бане для удаления воздуха, а затем быстро охлаждают). После посева среду заливают вазелиновым маслом и помещают в термостат.

Полужидкий сахарный агар (высокий столбик). В пробирку с 6-7 мл расплавленного и охлажденного до 40-45⁰ полужидкого питательного агара, содержащего 0,5-1% глюкозы, вносят исследуемый материал и перемешивают. Посевы помещают в термостат.

Среда для контроля стерильности (СКС). Рост многих анаэробных микроорганизмов возможен только на средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом. Поэтому в среды добавляют восстановители, например, тиогликолевую кислоту или ее натриевую соль, цистеин, аскорбиновую кислоту. Функции восстановителей выполняют и другие компоненты среды: глюкоза, пептон. СКС содержит питательный бульон, витаминный препарат ЭКД, NaCl, Na₂CO_3, глюкозу, тиогликолят натрия, цистеин, агар (0,75%). Среду разливают в пробирки по 6-7 мл.

Посевы культивируют в термостате.

I. Микробиологическое исследование кусочков ткани из глубины раны больного с подозрением на анаэробную газовую гангрену

1.1. Учёт результатов посева исследуемого материала в среду Вильсона-Блера и молоко.

На среде Вильсона-Блера отмечено почернение среды ввиду восстановления сульфата натрия и образования сульфида железа,

Опыт Контроль

На среде с лакумусовым молоком - губкообразный сгусток, пронизанный пузырьками газа:.

C. perfringers С. tetani

Опыт Контроль

1.2. Микроскопирование препарата из исследуемого материала, окрашенного по Граму.

В мазке обнаружены крупные (0,4-1,2х3-10 мкм) грамположительные палочки.

1.3. Бактериологическое исследование по выделению и идентификации предполагаемого возбудителя с целью установления этиологии заболевания (этапы):

1. –

2. На среде СКС - помутнение и газообразование. При микроскопии выявлены крупные грамположительные палочки, образующие споры, превышающие диаметр клетки и занимающие субтерминальное или центральное расположение (споры не окрашены).

4. Свойства и методы, позволяющие определить видовую принадлежность. Идентификацию чистых культур (до вида микроор­ганизма) проводят с учётом морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимичес­ких, токсигенных и антигенных свойств микроорганизма. Методы идентификации: культуральная диагностика, РИФ, ПЦР, биохимический метод («пестрый ряд»), биологический (РН) и др.

5. Оценка посева культуры на «пестрый ряд».

Углеводы +, пептонизация молока +, H2S +, индол -, разжижение желатина +

Обнаружение токсина. Лецитиназная активность +

Верхний сектор - опыт

Реакция нейтрализации (РН) на белых мышах:

№	Введено животным	Результат
культуральная жидкость	антитоксическая сыворотка
1.	+	противоперфрингенс	Мыши живы
2.	+	противонови	Мыши пали
3.	+	противосептикум	Мыши пали
4.	+	противогистолитикум	Мыши пали
5.	+	противосорделлии	Мыши пали
6.	+	--	Мыши пали

II. Препарат из культуры, выделенной при подозрении на столбняк, окрашенный по Граму

В препарате обнаружены крупные (0,3-0,8х4-8 мкм) грамположительные палочки. Характерно образование терминальной споры шаровидной формы, что придает возбудителю столбняка вид «барабанной палочки».

III. Препарат из биоптата флегмоны шеи, окрашенный по Граму

В препарате обнаружены грамотрицательные мелкие палочки, имеют удлиненную веретенообразную форму с заостренными концами.

IV. Биопрепараты

Наименование	Что содержит	Для чего применяется	Как применяется
Противогангренозные сыворотки диагностические и лечебно-профилактические	представляет собой содержащую специфические иммуноглобулины белковую фракцию сыворотки крови лошадей, гипериммунизированных анатоксинами (токсинами) трех основных возбудителей газовой анаэробной инфекции (кл. перфрингенс типа А, кл. Новии (эдематиенс), кл. септикум)	Профилактика и лечение гангрены	Профилактическая доза противогангренозной сыворотки составляет 30 000 МЕ (включает по 10 000 МЕ сыворотки активной в отношении токсинов Cl. perfringens, Cl. novyi, Cl. septicum). Лечебная доза суммарно составляет 150 000 МЕ (включает по 50 000 МЕ сыворотки активной в отношении токсинов Cl. perfringens, Cl. novyi, Cl. septicum). Сыворотку вводят медленно в/м, желательно в смеси со стерильным, подогретым до температуры тела физиологическим раствором из расчета 100-400 мл на 100 мл сыворотки. Перед введением основной дозы следует обязательно провести внутрикожную пробу.
Противостолбнячная сыворотка	представляет собой содержащую специфические иммуноглобулины белковую фракцию сыворотки крови гипериммунизированных столбнячным анатоксином и токсином лошадей. Содержит анатоксины, нейтрализующие столбнячный токсин	Профилактика и лечение столбняка
АКДС (адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина)	убитые клетки возбудителя коклюша, дифтерийный и столбнячный анатоксины	Профилактика коклюша, дифтерии и столбняка	вводят внутримышечно в верхний внешний квадрант ягодицы или передне-внешнюю область бедра в дозе 0,5 мл (разовая доза). Перед прививкой ампулу необходимо тщательно встряхнуть до получения гомогенной суспензии.
АДС, АДС-М. (Адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин)	Препарат содержит в 1 мл 60 флокулирующих единиц (ЛФ) дифтерийного и 20 антитоксинсвязующих единиц (ЕС) столбнячного анатоксинов.	Профилактика дифтерии и столбняка у детей.

Приложение №2

Медицинская документация

Форма № 204/у

Утв. МЗ СССР 04.10.80 № 1030

НАПРАВЛЕНИЕ №____

на микробиологическое исследование

«_____»____________________2008 г. ____________час.__________мин.

дата и время взятия материала

В ______________________________________________________лабораторию

Вид исследования____________________________________________________

Ф. И. О. ____________________________________________________Возраст__________________

Отделение ___________________________________________________________________________

Диагноз, дата заболевания______________________________________________________________

Показания к обследованию: больной, переболевший, реконвалесцент, бактерионоситель, контактный, профобследование (нужное подчеркнуть)

Материал: кровь, мокрота, кал, дуоденальное содержимое, пунктат, спинномозговая жидкость, раневое отделяемое, гной, выпот, секционный материал, мазок (подчеркнуть, вписать) ____________

Должность, фамилия, подпись лица, направляющего материал _______________________________

____________________________________________________________________________________

Медицинская документация

Форма № 239/у

Утв. МЗ СССР 04.10.80 № 1030

РЕЗУЛЬТАТ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ №______

«_____»____________________2008 г.

дата взятия биоматериала

Ф. И. О. ____________________________________________________Возраст__________________

Отделение ___________________________________________________________________________

При исследовании_____________________________________________________________________

указать материал и результат

АНТИБИОГРАММА

Ристомицин 1 2 3 Канамицин 1 2 3

Гентамицин 1 2 3 Бензилпенициллин 1 2 3

Доксициклин 1 2 3 Ампициллин 1 2 3

Эритромицин 1 2 3 Карбенициллин 1 2 3

Линкомицин 1 2 3 Ципрофлоксацин 1 2 3

Левомицетин 1 2 3 Оксациллин 1 2 3

Рифампицин 1 2 3 Цефалекцин 1 2 3

Фузидин 1 2 3 Олеандомицин 1 2 3

Условные обозначения: 1 - культура устойчива; 2 - умеренно устойчива; 3 – чувствительна

«_____»____________________2008г. Подпись________________________

Дата выдачи результа

Дата добавления: 2015-10-21