2. 6. Биологические испытания

2.6. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ

2.6.1. СТЕРИЛЬНОСТЬ

Испытание применяется для субстанций, ле­карственных средств или изделий, которые, в со­ответствии с Фармакопеей, должны быть сте­рильны. Однако, удовлетворительный резуль­тат показывает лишь то, что в условиях испы­тания в тестируемом образце не обнаружено микроорганизмов. Руководство по использованию испытания на стерильность приводится в кон­це раздела.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРОТИВ МИКРОБНОЙ КОНТАМИНАЦИИ

Испытание на стерильность выполняют в асеп­тических условиях. Для достижения таких условий обстановка, в которой выполняется испытание, должна быть адаптирована к способу его проведе­ния. Меры предосторожности, принимаемые про­тив контаминации, не должны влиять ни на один из микроорганизмов, обнаруживаемых в ходе ис­пытания. Рабочие условия, в которых выполняет­ся испытание, регулярно контролируются путем отбора проб воздуха и поверхностей рабочей зоны, а также проведением соответствующих конт­рольных испытаний.

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И ТЕМПЕРАТУРЫ ИНКУБАЦИИ

Среды для проведения испытаний могут быть приготовлены в соответствии с приведен­ными ниже указаниями; также могут использо­ваться эквивалентные коммерчески доступные среды при условии, что они выдерживают испы­тания на питательные свойства.

Показано, что следующие питательные сре­ды являются подходящими для испытания на сте­рильность. Жидкая тиогликолевая среда предназ­начена в первую очередь для культивирования анаэробных бактерий, но также обнаруживает и аэробные, бактерии. Среда на основе гидролиза-тов соевых бобов и казеина # и среда Сабуро под­ходит для культивирования как грибов, так и аэроб­ных бактерий.

Могут быть использованы также и другие сре­ды при условии их соответствия требованиям ис­пытаний на пригодность.

Жидкая тиогликолевая среда.

Смешивают L-цистин, агар, натрия хлорид, глюкозу, водорастворимый дрожжевой экстракт и панкреатический гидролизат казеина с 1 000 мл воды и нагревают до получения раствора. Натрия тиогликолят или тиогликолевую кислоту растворя­ют в полученной смеси и, при необходимости, до­бавляют 1 М раствор гидроксида натрия так, что­бы после стерилизации значение рН раствора со­ставляло 7,1 ±0,2. Если необходима фильтрация, раствор снова нагревают, не доводя до кипения, и фильтруют в горячем виде через увлажненную фильтровальную бумагу. Добавляют раствор реза­зурина натриевой соли, перемешивают и помеща­ют среду в подходящие сосуды, которые обеспе­чивают такое отношение поверхности к глубине среды, чтобы изменению окраски, указывающему на поглощение кислорода в конце периода инку­бирования, был подвержен только верхний слой, составляющий не более трети от общего объема среды. Стерилизуют с использованием процесса с подтвержденной эффективностью. Среду хранят при температуре 2-25°С в стерильном герметич­ном контейнере. Если верхний слой, составляю­щий не более трети от общего объема среды, при­обретает розовую окраску, среду можно однократ­но регенерировать путем нагрева контейнеров на водяной бане или в струе пара до исчезновения розовой окраски с последующим быстрым охлаж­дением; при этом должны быть приняты меры предосторожности против попадания в контейнер нестерильного воздуха. Среду не используют по ис­течении валидированных сроков хранения.

Жидкую тиогликолевую среду инкубируют при температуре 30-35°С.

Среда на основе гидролизатов соевых бобов и казеина

Панкреатический гидролизат казеина	17,0 г
Папаиновый гидролизат сои	3,0 г
Натрия хлорид	5,0 г
Калия гидрофосфат	2,5 г
Глюкозы моногидрат / Безводная	2,5 г/2,3 г
глюкоза
Вода	1000 мл

рН среды после стерилизации 7,3±0,2

Твердые компоненты растворяют в воде, слегка нагревая для получения раствора. Раствор охлаж­дают до комнатной температуры. При необходимо­сти добавляют 1 М раствор гидроксида натрия так, чтобы после стерилизации значение рН раствора составляло 7,3±0,2. При необходимости устране­ния мутности раствор фильтруют, разливают по подходящим сосудам и стерилизуют с использо­ванием процесса с подтвержденной эффективно­стью. Если среда не подлежит немедленному ис­пользованию, ее хранят при температуре 2-25°С в стерильном герметичном контейнере. Среду не используют по истечении валидированных сроков хранения.

Среду на основе гидролизатов соевых бобов и казеина инкубируют при температуре 20-25°С.

# Допускается использование среды Сабуро.

Пептон ферментативный	10,0 г
Глюкоза	40,0 г
Вода	до 1000 мл

рН после стерилизации 5,6±0,2

Среду Сабуро инкубируют при температуре 20-25°С

Используемая среда должна выдерживать следующие испытания, проводимые для каждой партии до или одновременно с испытанием тести­руемой продукции.

Стерильность. Порции среды инкубируют в течение 14 дней. Роста микроорганизмов наблю­даться не должно.

Питательные свойства в отношении аэро­бов, анаэробов и грибов. Проверке подвергают каждую партию готовой среды и каждую партию среды, приготовленной из обезвоженных составов или из ингредиентов. Подходящие штаммы микро­организмов приведены в таблице 2.6.1.-1.

Порции жидкой тиогликолевой среды засева­ют небольшим количеством (не более 100 колоние­образующих единиц) следующих микроорганизмов: Clostridium sporogenes, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. Для каждого из штаммов ис­пользуют отдельную порцию среды. Порции среды на основе гидролизатов соевых бобов и казеина (# или среды Сабуро) засевают небольшим коли­чеством (не более 100 колониеобразующих единиц) следующих микроорганизмов: Aspergillus niger, Bacillus subtilis, Candida albicans. Для каждого из штаммов используют отдельную порцию среды. Инкубируют в течение не более 3 дней в случае бактерий и не более 5 дней в случае грибов.

При получении рабочей культуры, используе­мой при проведении испытания, число пересевов, произведенных от исходного штамма, не должно превышать пяти.

Среды являются пригодными при условии на­личия четкого визуально наблюдаемого роста мик­роорганизмов.

Таблица 2.6.1.-1 Штаммы тест-микроорганизмов, пригодные для испытаний питательных сред

Аэробные бактерии
Staphylococcus aureus	ATCC 6538, CIP 4. 83, NCTC 10788, NCIMB 9518, #TCC 6538-P
Bacillus subtilis	ATCC 6633, CIP 52. 62, NCIMB 8054
Pseudomonas aeruginosa	ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82. 118
Анаэробные бактерии
Clostridium sporogenes	ATCC 19404, CIP 79. 3, NCTC 532, ATCC 11437, #ГИСК 272
Грибы
Candida albicans	ATCC 10231, IP 48. 72, NCPF3179, # ATCC 885-653
Aspergillus niger	ATCC 16404, IP 1431. 83, IMI 149007, # BKM F-1119

ПРОВЕРКА ПРИГОДНОСТИ МЕТОДИКИ ИСПЫТАНИЯ

Проверку методики испытания выполняют в соответствии с нижеприведенным описанием тес­та на стерильность испытуемого продукта с исполь­зованием в точности аналогичного метода со сле­дующими модификациями.

Мембранная фильтрация. После переноса содержимого испытуемого контейнера или контей­неров на мембрану заключительную порцию сте­рильного растворителя, используемого для про­мывки фильтра, инокулируют небольшим количе­ством жизнеспособных микроорганизмов (не более 100 колониеобразующих единиц).

Прямая инокуляция. После внесения в пита­тельную среду содержимого испытуемого контейне­ра или контейнеров ту же среду инокулируют не­большим количеством жизнеспособных микроорга­низмов (не более 100 колониеобразующих единиц).

В обоих случаях используют штаммы микро­организмов, приведенные выше, в описании испы­тания питательных свойств в отношении аэробов, анаэробов и грибов. За положительный контроль принимают результаты испытания питательных свойств используемых сред. Все контейнеры, со­держащие среду, инкубируют не более 5 дней.

Если после периода инкубации ясно наблю­дается рост микроорганизмов, визуально сравни­мый с ростом в контрольном сосуде, не содержа­щим испытуемого продукта, делают вывод, что либо продукт в условиях испытания не обладает антимикробной активностью, либо такая актив­ность была в достаточной степени исключена. В таком случае испытание на стерильность может проводиться без дальнейших модификаций.

Если после периода инкубации не наблюда­ется роста микроорганизмов, визуально сравнимо­го с ростом в контрольном сосуде, не содержащим испытуемого продукта, делают вывод, что продукт обладает антимикробной активностью, которая в условиях испытания не была в достаточной степе­ни исключена. Условия подвергают модификаци­ям с целью исключения антимикробной активнос­ти и повторяют испытание на пригодность.

Это испытание следует проводить в следую­щих случаях:

а) когда проводится испытание на стериль-
ность новой продукции;

б) при внесении любых изменений в экспери-
ментальные условия испытания.

Проверка пригодности может выполняться одновременно с контролем стерильности испыту­емой продукции.

# Частные фармакопейные статьи должны со­держать сведения о наличии антимикробного дей­ствия продукта и рекомендации по его устранению.

ИСПЫТАНИЕ НА СТЕРИЛЬНОСТЬ ТЕСТИРУЕМОГО ПРОДУКТА

Испытание может быть выполнено с исполь­зованием метода мембранной фильтрации или путем прямой инокуляции питательной среды ис­пытуемым продуктом. Должны проводиться соот­ветствующие отрицательные контрольные опыты. В тех случаях, когда позволяет природа продукта (фильтруемые водные препараты, спиртовые или масляные препараты, а также препараты, смеши­ваемые или растворимые в водных или масляных растворителях, не обладающих антимикробным эффектом в условиях испытания), следует пред­почесть метод мембранной фильтрации.

Мембранная фильтрация. Используют мем­бранные фильтры с номинальным размером пор, не превышающим 0,45 мкм, с установленной спо­собностью к удерживанию бактерий. Например, фильтры на основе нитрата целлюлозы использу­ют для водных, масляных и разбавленных спирто­вых растворов, а фильтры на основе ацетата цел­люлозы - в частности, для растворов с высоким содержанием спирта. Для некоторых видов продук­ции, например, для антибиотиков, могут потребо­ваться специально подготовленные фильтры.

В нижеописанном методе предполагается ис­пользование мембран диаметром около 50 мм. При использовании фильтров других диаметров объемы разведений и промывок должны быть изменены со­ответствующим образом. Аппарат для фильтрации и мембрану стерилизуют подходящим способом. Кон­струкция аппарата должна обеспечивать введение и фильтрацию испытуемого раствора в асептических условиях, извлечение мембраны для ее переноса в питательную среду или проведение инкубации пос­ле помещения питательной среды в аппарат.

Водные растворы. Небольшое количество подходящего стерильного растворителя, не подав­ляющего рост микроорганизмов, например, нейт­рального раствора мясного или казеинового пеп­тона концентрацией 1 г/л (рН 7,1 ±0,2), помещают на мембрану аппарата и фильтруют. Растворитель может содержать подходящие нейтрализующие и/или инактивирующие вещества, например, в слу­чае антибиотиков.

Содержимое контейнера или контейнеров, подлежащих испытанию, переносят на мембрану (мембраны), при необходимости после разбавле­ния до объема, используемого в испытании на при­годность, избранным стерильным растворителем; в любом случае, используют количество испытуемого продукта не менее указанного в таблице 2.6.1.-2. Не­медленно фильтруют. Если испытуемый раствор обладает антимикробными свойствами, мембрану не менее трех раз промывают путем пропускания через нее каждый раз объема выбранного стериль­ного растворителя, указанного в испытании на при­годность. В процессе промывки объем не должен превышать 5*200 мл, даже если при проверке при­годности было показано, что такая промывка не полностью исключает антимикробную активность. Мембрану целиком переносят в питательную сре­ду или в асептических условиях делят ее на две равные части, каждую из которых помещают в две подходящие среды. Используют такие же объемы питательных сред, как и в испытании на пригод­ность. Кроме того, среда может быть нанесена на мембрану в аппарате. Среды инкубируют в тече­ние не менее 14 дней.

Твердые растворимые препараты. Для каждой среды используют количество продукта, растворенного в подходящем растворителе, например, растворе на­трия хлорида 0,9% или нейтральном растворе мясно­го или казеинового пептона концентрацией 1 г/л, не менее указанного в таблице 2.6.1.-2, и продолжают испытание по методике, описанной выше для вод­ных растворов, с использованием мембраны, соот­ветствующей выбранному растворителю.

Масла и масляные растворы. Для каждой сре­ды используют количество продукта не менее ука­занного в таблице 2.6.1.-2. Масла и масляные раство­ры, обладающие достаточно низкой вязкостью, мо­гут быть подвергнуты фильтрованию через сухую мембрану без разбавления. Вязкие масла могут быть при необходимости разбавлены подходящим стерильным растворителем, для которого показано отсутствие антимикробной активности в условиях испытания, например, изопропилмиристатом. Дают маслу проникнуть в мембрану под действием соб­ственной тяжести, затем фильтруют, постепенно увеличивая давление или вакуум. Мембрану про­мывают путем фильтрования не менее трех порций по 100 мл подходящего стерильного растворителя, например, нейтрального раствора мясного или ка­зеинового пептона концентрацией 1 г/л, содержа­щего подходящий эмульгатор в концентрации, при­емлемость которой была подтверждена в ходе ис­пытания на пригодность, например, 10 г/л полисор-бата 80. Мембрану или мембраны переносят в пи­тательную среду или среды (или наоборот) в соот­ветствии с указаниями, приведенными выше для водных растворов, и инкубируют при таких же тем­пературах в течение тех же промежутков времени.

Мази и кремы. Для каждой среды используют количество продукта не менее указанного в табли­це 2.6.1.-2. Мази на жирной основе и водно-масля­ные эмульсии могут быть разбавлены до содержа­ния 1% изопропилмиристатом, как описано выше, при необходимости при нагревании до температу­ры, не превышающей 40°С. В исключительных слу­чаях может оказаться необходимым нагрев до тем­пературы, не превышающей 44°С. Фильтруют на­сколько возможно быстро и продолжают испыта­ние в соответствии с указаниями, приведенными выше для масел и масляных растворов.

Прямая инокуляция питательной среды.

Количество испытуемого препарата, предписанное в таблице 2.6.1.-2, помещают непосредственно в питательную среду. При этом объем продукта дол­жен составлять не более 10% объема среды, если не предписано иное.

Если испытуемый продукт обладает антимик­робной активностью, испытания выполняют после нейтрализации подходящим нейтрализующим агентом или путем разбавления в достаточном ко­личестве питательной среды. При необходимости использования большого объема продукта пред­почтительнее использовать концентрированную питательную среду, приготовленную с учетом пос­ледующего разбавления. Если это удобно, концен

трированная среда может быть добавлена непос­редственно к продукту в контейнере.

Масляные жидкости. Используют среды с добавкой подходящего эмульгатора в концентра­ции, приемлемость которой была подтверждена в ходе испытания на пригодность, например, 10 г/л полисорбата 80.

Мази и кремы. Готовят разбавлением в соот­ношении около 1:10 путем эмульгирования с ис­пользованием избранного эмульгатора в подходя­щем стерильном растворителе, например, раство­ре мясного или казеинового пептона концентраци­ей 1 г/л. Разбавленный продукт переносят в среду, не содержащую эмульгатора.

Инокулированную среду инкубируют в течение не менее 14 дней. Состояние культур оценивают несколько раз в течение инкубационного периода. Инокулированные среды, содержащие масляные продукты, ежедневно осторожно встряхивают. Од­нако при использовании тиогликолевой или другой аналогичной среды для определения анаэробных микроорганизмов встряхивание или перемешива­ние сводят к минимуму для поддержания анаэроб­ных условий.

НАБЛЮДЕНИЕ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Время от времени в течение периода инкуба­ции, а также по его завершении оценивают наличие макроскопических признаков микробного роста в средах. Если внесение испытуемого материала при­водит к помутнению питательной среды, вследствие чего наличие или отсутствие микробного роста не может быть легко определено визуально, следует через 14 дней после начала инкубации перенести порции среды (каждая объемом не менее 1 мл) в другие сосуды, содержащие свежую аналогичную среду, и инкубировать исходные сосуды и сосуды с перенесенными порциями в течение 4 дней.

Если признаков микробного роста не обнару­живается, то продукт признают выдерживающим ис­пытание на стерильность. При наличии признаков микробного роста продукт не выдерживает испыта­ние на стерильность, если не может быть показано путем повторного испытания или другим способом, что результаты испытания не являются достовер­ными по причинам, не связанным с испытуемым про­дуктом. Результаты испытания могут быть призна­ны недостоверными лишь при выполнении не ме­нее одного из нижеперечисленных условий:

а) данные микробиологического мониторинга
зоны проверки стерильности указывают на произо-
шедшие сбои;

б) проверка методики, используемой в данном
испытании, привела к обнаружению недочетов;

в) в отрицательном контроле был обнаружен
микробный рост;

г) после установления типа микроорганизмов,
выделенных в ходе испытания, рост этого штамма
(этих штаммов) может быть однозначно приписан
ошибкам, вносимым материалами и/или методи-
ками, используемыми при проведении испытания.

Если результаты испытания признаны недосто­верными, испытание повторяют, используя то же ко­личество образцов, что и в первоначальном тесте.

Если признаков микробного роста в ходе по­вторного испытания не обнаруживается, то продукт признают выдерживающим испытание на стериль­ность. Если в ходе повторного испытания обнару­живается рост, то продукт не выдерживает испы­тание на стерильность.

ПРИМЕНЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ К ПАРЕНТЕРАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ, ОФТАЛЬМОЛОГИЧЕСКИМ И ДРУГИМ НЕИНЪЕКЦИОННЫМ ПРЕПАРАТАМ, ДЛЯ КОТОРЫХ ТРЕБУЕТСЯ ВЫПОЛНЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ НА СТЕРИЛЬНОСТЬ

При использовании метода мембранной филь­трации используют, где это возможно, все содер­жимое контейнера, но не менее чем в количестве, указанном в таблице 2.6.1.-2, при необходимости разбавляя приблизительно до 100 мл подходящим стерильным раствором, например, нейтральным раствором мясного или казеинового пептона кон­центрацией 1 г/л.

При использовании метода прямой инокуля­ции питательной среды используют количества, указанные в таблице 2.6.1.-2, если не оправдано и не разрешено применение других количеств. Ис­пытания на стерильность в отношении бактерий и

грибов выполняют на одном и том же образце ис­пытуемого продукта. В случаях, когда объем или количество, содержащиеся в контейнере, являют­ся недостаточными для проведения испытаний, для инокуляции различных сред используют содержи­мое двух или более контейнеров.

УКАЗАНИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ИСПЫТАНИЯ НА СТЕРИЛЬНОСТЬ

Цель испытания на стерильность, как и всех фармакопейных испытаний, заключается в предо­ставлении независимым аналитикам средств провер­ки соответствия данного материала требованиям Фармакопеи. Производителю не вменяется в обязан­ность проводить такие испытания и не запрещается использовать модификации установленного мето­да или альтернативные методы при условии, что данная продукция будет соответствовать требова­ниям Фармакопеи при проведении испытания с ис­пользованием официального метода.

Условия проведения испытаний. Асептичес­кие условия проведения испытания могут быть достигнуты, например, использованием камеры с ламинарным потоком воздуха класса А, располо­женной в чистом помещении класса В, или с помо­щью изолятора.

Руководство для производителей. Уровень достоверности, подтверждаемый удовлетворитель­ным результатом испытания на стерильность (от­сутствие загрязняющих единиц в образце), в отно­шении к качеству партии зависит от ее однородно­сти, условий производства и эффективности при­нятого плана отбора проб. Для целей данного опи­сания партия определяется как однородный набор запечатанных контейнеров, приготовленных таким образом, чтобы риск микробного загрязнения был одинаковым для каждой единицы.

Для продукции, стерилизуемой на последней стадии производства, биологически обоснованные и автоматически документированные фактические доказательства правильного протекания процесса стерилизации для всей партии дают большую га­рантию по сравнению с испытанием на стериль­ность. Обстоятельства, при которых допустим па­раметрический выпуск серии, описаны в разделе «Методы приготовления стерильной продукции» (5.1.1). Для подтверждения асептических условий производства может применяться метод наполне­ния питательными средами. За исключением этих ситуаций, испытание на стерильность является единственным аналитическим методом для продук­ции, производство которой осуществляется в асеп­тических условиях.

Вероятность определения наличия микроор­ганизмов в ходе испытания на стерильность воз­растает с увеличением их количества в испытуе­мом образце и варьируется в зависимости от спо­собности к росту имеющихся микроорганизмов. Вероятность обнаружения очень низких уровней микробного загрязнения, даже если оно в преде­лах партии является однородным, весьма мала. Интерпретация результатов испытания на стериль­ность основывается на предположении, что содер­жимое любого контейнера в партии, если он будет подвергнут испытанию, даст одинаковый резуль­тат. Поскольку очевидно, что каждый контейнер не может быть подвергнут испытанию, следует исполь­зовать соответствующий план отбора проб. В слу­чае асептического производства рекомендуется отбирать образцы в начале и в конце выпущенной партии, а также после существенного вмешатель­ства в технологический процесс

Руководство, касающееся минимального реко­мендуемого количества образцов, отбираемых для проведения испытания, в зависимости.от размера партии, приведено в таблице 2.1.6.-3. При исполь­зовании этих рекомендаций следует учитывать объем препарата в контейнере, валидацию метода стерилизации и любые другие особые условия, ка­сающиеся планируемой стерильности продукции.

Наблюдение и интерпретация результатов

Общепринятые микробиологические и биохимичес­кие методы в общем случае являются удовлетвори­тельными для идентификации микроорганизмов, выделяемых в ходе испытания на стерильность. Однако, если производитель желает использовать лишь критерий (d) для признания результатов испы­тания на стерильность недостоверными, может ока­заться необходимым использование чувствительных методов классификации для демонстрации идентич­ности микроорганизма, выделенного при испытании продукции, микроорганизму, выделенному из мате­риалов и окружающей обстановки. Хотя с помощью рутинных микробиологических и биохимических ме­тодов может быть показано, что два изолированных штамма не являются идентичными, эти методы мо­гут быть недостаточно чувствительными и надежны­ми для получения однозначного доказательства того, что два штамма имеют один и тот же источник. Для определения того, что микроорганизмы имеют общее происхождение и клонально связаны, может оказать­ся необходимым использование более чувствитель­ных тестов, например, молекулярной классификации по гомологии РНК/ДНК.

Дата добавления: 2015-10-21