Молекулярно-генетические аспекты в создании и использовании трансгенных сельскохозяйственных животных

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ В СОЗДАНИИ И ИСПОЛЬЗОВАНИИ ТРАНСГЕННЫХ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ Трансгенные животные – это индивидуумы, в геном которых искусственно введена дополнительная генетическая информация (трансген). Такая информация представляет собой либо отдельный участок ДНК с собственными (гомологичными) регуляторными последовательностями (эукариотическая транскрипционная единица), либо сконструированный из различных молекул ДНК гибридный (рекомбинантный) ген. Таким образом, трансген – это искусственно введенный и интегрировавшийся в ДНК животных чужеродный ген. Еще один термин, который также будет часто использоваться в данной лекции – это трансгенез. Под трансгенезом понимают процесс переноса и интеграции чужеродной генетической информации в геном животных. Генетическое совершенствование животных базируется, главным образом, на мутационной изменчивости, а также комбинационной изменчивости, реализуемой при скрещивании различных пород и популяций животных. Развитие молекулярной биологии, молекулярной генетики и генной инженерии сделало возможным генетическую модификацию животных посредством внедрения в их геном новых генов (трансгенные животные). Несмотря на то, что первые трансгенные сельскохозяйственные животные были получены в 1985 г., до настоящего времени не было разработано эффективного метода, который бы мог быть использован для создания генетически модифицированных индивидуумов независимо от вида животных и от целей эксперимента. Создание новых эффективных методов переноса генов в эмбриональные и соматические клетки животных, а также совершенствование существующих подходов и сегодня остается актуальной задачей мировой биологической науки. Среди большого разнообразия способов внедрения экзогенной ДНК в геном индивидуумов можно выделить следующие, которые нашли широкое применение в практике трансгенеза: · метод микроинъекции · опосредованный ретровирусами перенос генов · перенос трансформированных ядер генеративных и соматических клеток · использование спермиев и сперматогониев как переносчиков ДНК. Наиболее широко используемым методом трансгенеза в животноводстве является метод микроинъекции, суть которого заключается во введении раствора генных конструкций в мужской пронуклеус зигот. Степень интеграции, то есть число трансгенных животных от общего числа родившихся животных, при использовании метода микроинъекции в зависимости от вида животных колеблется в незначительных пределах. Так, у мышей этот показатель в среднем составляет 15%, у свиней - 10-15%, у кроликов - 10%, у овец, коз и коров - 5-10%. Наиболее важным, с точки зрения затрат, требующихся для получения одного трансгенного животного, является показатель общей эффективности трансгенеза, который рассчитывается как отношение числа полученных трансгенных животных к общему числу пересаженных эмбрионов, выраженное в процентах. Величина этого показателя также относительно постоянна и составляет в среднем у мышей - 2%, у кроликов - 1%, у овец и коз - 0,5-1%, у свиней и коров - 0,5%. Следует отметить, что на частоту интеграции при использовании метода микроинъекции оказывают влияние такие факторы, как степень очистки инъекционного раствора, форма и концентрация ДНК, состав буферного раствора для микроинъекции, качество эмбрионов, а также способ пересадки эмбрионов реципиентам (нехирургический, хирургический, лапароскопический). Результативным способом переноса ДНК в эмбриональные линии животных является применение так называемых ретровирусных векторов. Ретровирусы - семейство эукариотических вирусов, генетический материал которых представлен одноцепочечной РНК. Наиболее часто используемыми ретровирусными векторами являются векторы на основе ретровирусов мыши типа С (вирус лейкемии мыши). Такие векторные системы состоят из двух компонентов: векторной конструкции и линии клеток-упаковщиц. В векторной конструкции (провирусная ДНК) гены, кодирующие структурные белки ретровируса (gag, pol, env), замещают другими интересующими генами (например, генами b-галактозидазы b-gal и устойчивости к неомицину – neo). Источником структурных белков, необходимых для формирования новых инфекционных вирусных частиц, является клеточная линия, содержащая интегрированный в геном провирус. Впервые присутствие вирусной ДНК в клетках взрослых мышей после инъекции ДНК вируса SV40 было установлено в 1974 году. Несколько позже была доказана интеграция провирусной ДНК M-MuLV и показана ее передача по наследству. Недавние успехи в получении трансгенного крупного рогатого скота с помощью ретровирусных показали, что ретровирусные векторы могут служить хорошей альтернативой для эффективного транспорта генов у сельскохозяйственных животных. Преимуществом использования ретровирусных векторов для получения трансгенных животных является то, что до 100% обработанных эмбрионов могут быть успешно инфицированы ретровирусами. Недостатком применения ретровирусных векторов является их ограниченная емкость (размер вставки не должен превышать 8 тысяч п.н.). Кроме того, в результате сплайсинга из ретровирусов вырезаются интронные последовательности, которые наряду с дистальными и проксимальными регионами играют важную роль в эффективной экспрессии генов у трансгенноых животных. К недостаткам использования ретровирусных векторов следует также отнести подавление экспрессии трансгенов in vivo вследствие инактивации вирусных промоторов в клетках, например, посредством α- и γ-интерферонов, действующих на вирусные LTR. Однако данная проблема может быть решена посредством включения в ретровирусную конструкцию внутренних промоторов или использованием нового поколения ретровирусов, содержащих модифицированные участки контроля экспрессии, такие как внутренний рибосомный сайт IRES и тетрациклиновая регуляторная система. Еще одним ограничением использования ретровирусных векторов для получения трансгенных животных является их низкий титр. Обычные ретровирусные векторы имеют титр 1 х 105-6 колониеобразующих единиц (cfu) в мл. Низкий титр ретровирусов ограничивает способы их введения в эмбрионы. Для успешной инфекции необходимо культивировать лишенные зоны эмбрионы в содержащих ретровирусы средах или микроинъецировать производящие вирусы клетки в перивителиновое пространство. В обоих случаях полученные трансгенные животные характеризуются высокой степенью мозаицизма и множественной инсерцией. Проблема низкого титра была недавно решена посредством разработки нового вектора на основе вируса везикулярного стоматита (псевдотип VSV-G). Включение белка вируса везикулярного стоматита G в вектор на основе Mo-MLV позволило сделать его более стабильным при ультрацентрифугировании. Данный вектор может быть сконцентрирован до титра 1х109-10 КОЕ/мл и имеет очень широкий спектр клеток-хозяев. С его использованием были получены трансгенные линии клеток насекомых, млекопитающих, амфибий, рыб, а также созданы трансгенные животные. Высокий титр ретровируса сделал возможным получение трансгенных животных посредством инъекции содержащей вирусы среды в перивителиновое пространство. В ооцитах крупного рогатого скота объем перивителинового пространства составляет 200-300 пкл. При использовании вируса с титром 1х109-10 cfu/мл, инъекция 10 пкл приводит к проникновению в перивителиновое пространство от 10 до 100 инфекционных вирусных частиц. Если титр вируса равен 1х105-6 cfu/мл, то для введения в эмбрион хотя бы одной вирусной частицы необходимо инъецировать не менее 1 нл раствора. К недостаткам использования ретровирусов относится также возможность активации клеточных онкогенов посредством вирусных транскрипционных последовательностей. Даже при применении ретровирусов, которые не могут существовать как инфекционные вирусные частицы, существует хотя и очень небольшой, но риск, что при рекомбинации с присутствующими в эмбрионах эндогенными ретровирусными последовательностями могут образовываться новые активные формы ретровирусов. Еще одним способом получения трансгенных млекопитающих является использование трансформированных генными конструкциями клеточных линий. С этой целью могут быть использованы как полипотентные стволовые клеточные линии, так и соматические клетки, культивируемые in vitro. Преимуществом получения трансгенных животных с помощью трансформированных стволовых клеток является возможность тестирования интеграции трансгена в культуре клеток. Это означает, что каждый эмбрион, развившийся в культуре после пересадки ядер, будет трансгенным и последующая селекция трансгенных эмбрионов не требуется. Кроме того, пересадка таких эмбрионов реципиентам приведет к рождению только трансгенного потомства. Использование для получения трансгенных животных трансформированных ЭСК делает возможным в ряде случаев проводить оценку экспрессии трансгенов, что имеет немаловажное значение. При микроинъекции трансгены наугад интегрируются в любую часть генома. Это означает, что они могут разрушать весьма существенные гены (инсерционные мутации) или размещаться в тех частях хромосомы, которые недоступны для транскрипции. Тестирование экспрессии в культуре сделает возможным использование для пересадки ядер, а следовательно и для получения трансгенных животных только тех клеточных линий, в которых трансгены являются транскрипционно и трансляционно активными. Кроме того, в отличие от метода пронуклеарной инъекции использование ЭСК позволяет целенаправленно воздействовать на геном посредством генного таргетинга. К сожалению, несмотря на успехи в области выделения и культивирования ЭСК сельскохозяйственных животных, пока не удается получить ЭСК, способные принять участие в формировании эмбриональных химер. Сенсационное сообщение было опубликовано в 1996 году в Nature. Была продемонстрирована возможность получения жизнеспособных овец посредством пересадки ядер соматических клеток, культивируемых in vitro. Несколько позже та же рабочая группа сообщила о получении трансгенных овец посредством пересадки ядер стабильно трансформированных первичных фетальных фибробластов. Степень трансгенности при использовании данного метода составляла 100%, в то время как применение метода микроинъекции в той же лаборатории позволяло получить лишь 4,35% трансгенных потомков от числа родившихся животных. Как и при использовании ЭСК, данный метод позволяет проводить анализ интеграции в культуре клеток, а также осуществлять целенаправленное встраивание генных конструкций в желаемые участки генома. Кроме того, используемые клеточные линии могут быть кариотипизированы в культуре, что позволит заранее предопределять пол трансгенных животных. Если, например, требуется получить животных, синтезирующих рекомбинантные белки в молочной железе, то целесообразно рождение первичных трансгенных особей женского пола, что делает возможным их непосредственное тестирование на наличие экспрессии. После получения трансгенных животных из различных клеточных линий и определения уровня экспрессии может быть произведен отбор желательных клонов для их дальнейшего использования в пересадках ядер. В качестве природного вектора, доставляющего ДНК в клетки, могут быть использованы сперматозоиды. Уже в 1971 году была показана возможность переноса ДНК SV40 в яйцеклетки кроликов после искусственного осеменения спермой, предварительно инкубируемой с ДНК. В опытах Lavitrano с соавторами 30% мышей, полученных после оплодотворения обработанной ДНК спермой, оказались трансгенными и передавали трансген по наследству. Последовавшие за этим многочисленные попытки в других лабораториях во всем мире оказались неуспешными. Анализ 1300 мышей, родившихся после оплодотворения in vitro обработанной ДНК спермой, не выявил наличия трансгена ни у одной из исследованных особей. Недавние исследования показали, что при применении метода переноса ДНК посредством сперматозоидов в одной и той же лаборатории даже при использовании одинаковой схемы исследований могут быть получены противоречивые результаты. Это позволяет предположить, что встраивание ДНК происходит только на определенной стадии клеточного цикла. Однако до настоящего времени не установлен механизм интеграции экзогенной ДНК в геном сперматозоидов. Huguet и Esponda исследовали способность сперматозоидов поглощать линейную ДНК in vitro и in vivo. Присутствие чужеродной ДНК было показано у 60-70% сперматозоидов после обработки in vitro и in vivo. Положительный сигнал был выявлен в ядре спермиев и не исчезал при обработке ДНКазой. Таким образом, было показано, что сперматозоиды как in vitro, так и in vivo способны поглощать ДНК и аккумулировать ее в ядре, а также то, что секреты придатков и семенных канальцев не блокируют этот процесс. Для повышения эффективности связывания ДНК со сперматозоидами используют различные методы: ДНК-липосомные комплексы, инъекцию в семенники, непосредственную инъекцию в семенные канальцы и придатки, инъекцию в семенные канальцы с последующей электропорацией, ко-инъекцию головок спермиев и ДНК в ооциты. Большое внимание в последнее время привлекают манипуляции со стволовыми клетками семенников – сперматогониями. Была продемонстрирована возможность переноса сперматогониев от одного самца другому как у животных одного вида (мышь), так и между двумя различными видами животных (мышь – крыса). Кроме того, была показана возможность успешного протекания сперматогенеза после пересадки криоконсервированных клеток семенников мышей, а также после их длительного культивирования (более 3 месяцев). Успешное длительное культивирование половых клеток животных in vitro делает возможным проведение трансформации сперматогониев экзогенной ДНК с последующей селекцией. Nagano с соавторами сообщили об успешном введении экзогенной ДНК в сперматогонии in vitro и in vivo посредством ретровирусной системы доставки. Экспрессия ретровирусной генной конструкции, включающей lacZ, наблюдалась в семенниках более 6 месяцев. Анализ показал, что по крайней мере 1 из 300 стволовых клеток семенников содержали трансген. В сочетании с пересадкой трансформированных половых клеток в семенники реципиентов и успешным протеканием сперматогенеза данный подход может быть использован для получения трансгенного потомства. Другой способ был предложен Kim с соавторами: после временного выключения сперматогенеза посредством бусульфана в семявыводящие канальцы вводили ДНК-липосомный комплекс. Экспрессия трансгена наблюдалась у 7-13% придатковых сперматозоидов мышей и 15,3-25,1% свиней. Таким образом, не исключена возможность успешного использования данного метода для получения трансгенных сельскохозяйственных животных. Несмотря на хорошие результаты в использовании сперматозоидов для получения трансгенных мышей, а также отдельные успешные попытки получения трансгенных свиней и КРС, каких-либо значительных успехов в получении трансгенных сельскохозяйственных животных с помощью трансформированных сперматогониев и спермиев до настоящего времени достигнуто не было. Наиболее важные теоретические и экспериментальные достижения мировой науки в создании генетически модифицированных животных суммированы в таблице 1. Таблица 1. Достижения в использовании трансгенных технологий.
год	Событие	Автор
	Доставка чужеродной ДНК в ооциты кролика сперматозоидами	Bracket et al., 1971
	Получение трансгенных сельскохозяйственных животных методом микроинъекции	Brem et al., 1985 Hammer et al., 1985
	Эмбриональные химеры c использованием ЭСК Получение овец посредством пересадки ядер	Gossler et al., 1986 Willadsen, 1986
	Получение КРС методом пересадки ядер	Prather et al., 1987
	Получение кроликов методом пересадки ядер	Stice и Robl, 1988
	Получение трансгенных мышей и свиней с помощью спермиев в качестве векторов Получение трансгенного КРС методом микроинъекции Получение свиней методом пересадки ядер	Lavitrano et al., 1989 Gandolfi et al., 1989 Roschlau et al., 1989 Prather et al., 1989
	Получение трансгенного КРС с помощью спермиев	Schelander et al., 1995
	Получение овец методом пересадки ядер культивируемых эмбриональных клеток Получение ЭСК приматов	Campbell et al., 1996 Thomson et al., 1996
	Получение овец методом пересадки ядер фетальных и соматических клеток Трансгенные овцы методом пересадки ядер трансформированных культивируемых клеток Химерные трансгенные свиньи с использованием ПЗК	Wilmut et al., 1997 Schnieke et al., 1997 Piedrahita et al., 1997
	Получение трансгенного КРС посредством - пересадки ядер фетальных фибробластов - псевдотипных ретровирусных векторов - пересадки ядер дифференцированных клеток	Cibelli et al., 1998 Chan et al., 1998 Kato et al., 1998
	Получение свиней методом пересадки ядер соматических клеток (клетки гранулезы)	Polejaeva et al., 2000
Среди других способов доставки экзогенной ДНК в организм животных можно отметить использование липосом, аденовирусных векторов, а также метода высокоскоростной инъекции. Однако эти методы не нашли широкого применения вследствие их не достаточной стабильности, а также отсутствия интеграции трансгена в геном. Несмотря на то, что основные результаты по созданию трансгенных сельскохозяйственных животных были получены зарубежными учеными, подобные исследования, правда, в несколько меньших масштабах, проводятся и в России. Первые трансгенные сельскохозяйственные животные были получены в России в 1987 году: Эрнст Л.К. с соавторами сообщили о создании трансгенных кроликов, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В человека. Год спустя были созданы кролики с интеграцией генов соматотропина человека, антисмысловой РНК против аденовируса. Следует отметить, что в России работы по получению трансгенных сельскохозяйственных животных проводятся, главным образом, на кроликах. Кролики являются удобным биологическим объектом вследствие короткого репродуктивного цикла и высокой плодовитости. Кроме того, затраты на получение трансгенных кроликов в несколько раз ниже по сравнению с затратами на получение крупных сельскохозяйственных животных. Среди других достижений российских ученых, следует отметить получение трансгенных кроликов с интеграцией генов антисмысловой РНК против вируса лейкоза КРС, фибробластного интерферона человека, релизинг-фактора гормона роста человека, гамма-интерферона человека. На других видах сельскохозяйственных животных исследования проводятся менее интенсивно: созданы трансгенные овцы с интеграцией генов инсулиноподобного фактора роста человека и прохимозина крпуного рогатого скота, свиньи с интеграцией генов поверхностного антигена вируса гепатита В, релизинг-фактора гормона роста. Лимитирующим фактором создания трансгенных крупных сельскохозяйственных животных (овцы, козы, свиньи, КРС) в России являются значительные материальные затраты на проведение экспериментов, обусловленные, с одной стороны, низкой эффективностью интеграции трансгенов в геном, с другой стороны, высокой стоимостью эмбрионов сельскохозяйственных животных. Анализируя достижения российских ученых в области получения трансгенных сельскохозяйственных животных, можно заключить, что создание генетически модифицированных индивидуумов проводится, главным образом, с прикладной целью. Исследования сконцентрированы в следующих областях: изменение обмена веществ с целью улучшения качества сельскохозяйственной продукции, производство рекомбинантных белков с молоком, получение животных, генетически устойчивых к инфекционным заболеваниям. Исследования проводятся российскими учеными в двух основных направлениях: разработка и совершенствование способов и приемов введения экзогенной ДНК в эмбриональные и соматические клетки сельскохозяйственных животных и использование существующих технологий для создания трансгенных сельскохозяйственных животных для медицины, ветеринарии и других потребностей человека. Ниже мы остановимся на нескольких важных, с нашей точки зрения, примерах. Как известно, основным недостатком метода микроинъекции является его низкая результативность. С целью повышения эффективности метода Зиновьевой с соавторами была исследована возможность использования биологического буфера MSOF (синтетическая среда яйцеводов на основе МОПС) в качестве основы микроинъекционного раствора и показано, что по сравнению со стандартным инъекционным раствором ТЕ выживаемость инъецированных эмбрионов повысилось в 1,7 раза (p<0,001), что при приблизительно равной степени интеграции (9,0% и 9,8%) позволило добиться повышения эффективности трансгенеза в 1,6 раза (от 0,9% до 1,4%). С целью повышения эффективности метода микроинъекции Попова Е.А. с соавторами исследовали влияние времени инъекции на степень трансгенности эмбрионов и потомства и установили, что наивысшая степень интеграции достигается при проведении инъекции генной конструкции в зиготы, находящиеся в начале или середине фазы G1 первого клеточного цикла. Этот факт может быть использован в качестве одного из приемов повышения эффективности получения трансгенных животных методом микроинъекции. Российскими учеными разрабатывается новая технология так называемого соматического переноса генов с использованием ретровирусных векторов. Используемый ретровирусный вектор содержал геномную последовательность эритропоэтина человека (hEpo) под контролем промотора aS1-казеина КРС. Клетки-упаковщицы вводили в молочную железу свиней и коров на различных стадиях беременности. Наличие провирусов pLNa в соматических клетках молока свиней было доказано в течение всего периода лактации. Было показано, что инфекция молочной железы не носит локального характера, как это первоначально предполагалось. Последовательности провируса помимо опытных долей вымени были выявлены в контрольных долях молочной железы, в слюнной железе, селезенке, поджелудочной железе, спинном мозге, надпочечниках. Иммуно-ферментный анализ молока свиней выявил наличие рекомбинантного продукта в количестве от 30 до 600 нг/мл. Аналогичные исследования были выполнены на крупном рогатом скоте. Максимальные концентрации эритропоэтина в молоке первотелок (700 и 800 нг/мл) наблюдались на 8-ой и 26-ой дни лактации, после чего начинали снижаться. Экспрессия эритропоэтина в молоке сохранялась в течение 3-х месяцев и, начиная, соответственно, с 90-го и 104-го дней лактации, не выявлялась. Следует отметить, что основными недостатками метода непосредственной инфекции отдельных органов животных является необходимость использования большой дозы ретровирусов с тем, чтобы инфицировать достаточное число клеток, а также невозможность передачи трансгена по наследству следующему поколению животных. Однако в отличие от введения трансгенов в эмбриональные линии, данный подход позволит синтезировать рекомбинантные продукты в молоко уже через несколько месяцев после начала экспериментов. Особенно актуальным это является для животных с большим генерационным интервалом (крупный рогатый скот, козы, овцы). Так, например, для крупного рогатого скота по сравнению с традиционным методом микроинъекции затраты времени от начала эксперимента и до получения первых результатов об уровне экспрессии в молоке сокращаются, соответственно, с 4-5 лет до 4-5 месяцев. Среди других достижений российских ученых следует отметить успехи в рецептор-опосредованном переносе генов, высокоскоростной инъекции, опосредованном сперматозоидами переносе генов. Оценивая степень влияния российских ученых на прогресс в области трансгенеза сельскохозяйственных животных, следует признать, что исследования, проводимые в России, оказывают лишь незначительное влияние на решение задач, стоящих перед мировой наукой. Основными причинами такого отставания является недостаточная обеспеченность отраслевых научно-исследовательских институтов современным высокоточным оборудованием. Несмотря на отток квалифицированных научных кадров за рубеж, в российских институтах работает достаточно высоко образованных специалистов, прошедших обучение в зарубежных лабораториях и способных проводить исследования на мировом уровне. Среди научно-исследовательских институтов и научных центров можно выделить следующие, которые, являются ведущими центрами в области трансгенеза сельскохозяйственных животных: Всероссийский государственный НИИ животноводства РАСХН, Научно-производственный биотехнологический центр по животноводству ВИЛАР, Всероссийский НИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, Всероссийский НИИ физиологии и биохимии питания РАСХН, Институт биологии гена РАН, Институт молекулярной генетики РАН, Институт биоорганической химии РАН.

Дата добавления: 2015-10-21