1. Аналитические возможности и области применения хроматографии: газовой, высокоэффективной жидкостной и ионной

1. Аналитические возможности и области применения хроматографии: газовой, высокоэффективной жидкостной и ионной

Область применения газовой хроматографии (ГХ) довольно велика – от анализа простых газов до определения комплексов веществ в сложных матрицах.

С помощью газового хроматографа можно проводить анализ летучих веществ, а также полулетучих или даже нелетучих веществ, если придать им свойства летучести. Ограничение здесь составляют термолабильные вещества, которые в условиях высоких температур деградируют с образованием неспецифичных продуктов распада.

Применения газовой хроматографии: Производственный анализ: переработка нефти и газа, пластмассы, фармацевтика, химический синтез, парфюмерия, продукты питания.

Экологический мониторинг: пестициды, гербециды, полихлорированные бифенилы и диоксины, полиароматические углеводороды

Судебно-медицинская экспертиза: наркотики и сильно-действующие вещества, взрывчатые вещества

Научные исследования и лабораторный анализ

Метод ВЭЖХ - один из эффективных методов разделения сложных смесей веществ. Он находит широкое применение в таких областях, как химия, нефтехимия, биология, биотехнология, медицина, пищевая промышленность, охрана окружающей среды, производство лекарственных препаратов и во многих других.

Ионообменная хроматография является более частным вариантом ионной хроматографии. Этот вариант хроматографии позволяет разделять ионы и полярные молекулы, на основании зарядов разделяемых молекул.

Данный вид хроматографии позволяет разделить практически любые заряженные молекулы, в том числе: крупные — белки, малые—молекулы нуклеотидов и аминокислот. Часто ионообменную хроматографию используют как первый этап очистки белков.

2. Высокоэффективная жидкостная хроматография

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, англ. HPLC, High performance liquid chromatography) — один из эффективных методов разделения сложных смесей веществ, широко применяемый как в аналитической химии, так и в химической технологии. Основой хроматографического разделения является участие компонентов разделяемой смеси в сложной системе Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий (преимущественно межмолекулярных) на границе раздела фаз.

Принцип жидкостной хроматографии состоит в разделении компонентов смеси, основанном на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна (элюент).

Отличительной особенностью ВЭЖХ является использование высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (обычно 3—5 мкм, сейчас до 1,8 мкм). Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа от 3 до 30 мин).

Особенностью этой хроматографии является детектирование. Основные детекторы газовой хроматографии здесь неприменимы.

В этом методе хроматографии применяют два вида детекторов. Основной (на 99%) – это УФ –детектор, второй – это рефрактометрический детектор, измеряющий показатель преломления элюата.

Приборы обычно укомплектованы УФ-детектором. Его достоинства заключаются в высокой чувствительности фотометрического измерения концентраций – 10-7 моль/л. Этот детектор применяется для анализа веществ, поглощающих УФ-излучение

Метод ВЭЖХ находит широкое применение в таких областях, как химия, нефтехимия, биология, биотехнология, медицина, пищевая промышленность, охрана окружающей среды, производство лекарственных препаратов и во многих других.

3. Ионная одно- и двухколоночная хроматография

В ионной хроматографии сочетаются достоинства ВЭЖХ и классической ионообменной хроматографии. Ионообменные материалы, используемые в этом методе, отличаются не только малыми размерами зерен (20 микрон), но и тем, что ионообменные группы расположены не в глубине зерен, а на их поверхности, в районе 1 микрона. Эти материалы обладают малой обменной емкостью.

Давление, применяемое в этих системах, составляет 400 атм, обменная емкость ионита от 0.02 до 0.1 мг-экв /г, в 100 раз меньше, чем у обычного (2-10 мг-экв /г).

Главное достоинство ионной хроматографии – это уникальное детектирование по электропроводности. Именно детектирование по электропроводности (кондуктометрическое детектирование) и обеспечивает широкое распространение этого метода.

Кроме этого детектора в ионной хроматографии может применяться и оптический детектор. Он применяется для окрашенных ионов, но в основном в одноколоночной хроматографии.

В ионной хроматографии используются ионообменные материалы – катиониты и аниониты, содержащие на своей поверхности ионогенные активные группы.

В ионной хроматографии особое значение имеет оригинальный двухколоночный вариант. Этот вариант основан на помещении в цепь динамики элюата дополнительно к разделительной колонке еще и регенеративной колонки.

В одноколоночном варианте хроматографии регенеративная колонка отсутствует. Разделенная смесь сразу детектируется. Для того, чтобы усилить полезный сигнал в одноколоночном варианте хроматографии в качестве элюентов используют вещества, обладающие низкой эквивалентной электропроводностью. В этом случае отмечается простая зависимость: чем больше молекулярная масса катиона и аниона в элюенте, тем ниже будет его удельная электропроводность.

4. Обработка хроматограмм. Методы определения концентрации в хроматографии.

Выходящие из колонки определяемые вещества анализируются, или, как принято говорить в газовой хроматографии, детектируются, а результаты детектирования регистрируются самопишущим прибором. Прибор измеряет зависимость концентрации выходящих веществ от времени выхода или от объема выходящей из колонки газовой фазы. Информация по результатам анализа, которую рисует самописец, называется хроматограммой.

Хроматограмма в явном виде не содержит никакой аналитической информации. Но аналитик может получить из такой хроматограммы не только число веществ, которое равно числу пиков, но и вид этих веществ и их концентрацию в анализируемой смеси, т.е. можно получить следующую информацию:

1) число веществ равно или больше числа пиков;

2) вид вещества определяется временем удерживания;

3) концентрация пропорциональна площади пика, коэффициент пропорциональности можно установить заранее. Эти величины можно определить экспериментально.

Площадь пика известна, однако, это не концентрация. Для определения концентрации существуют два основных приема:
1. метод нормировки,
2. метод внутреннего стандарта.

По первому варианту концентрация веществ находится как отношение площади пика к сумме площадей всех пиков на хроматограмме.

Сумма площадей всех пиков приравнивается к 100 % вещества.

В этом методе считается, что для всех веществ один и тот же коэффициент пропорциональности в уравнении:

C_i = K S_{i (2)}

Таким образом, предполагают, что все вещества, которые вышли из хроматографической колонки, дают пики пропорциональные их концентрациям. Но это грубое допущение, справедливо лишь для детекторов по теплопроводности лишь для полностью летучих веществ при использовании водорода или гелия.
Второй вариант метода нормировки более строгий. В этом методе идет расчет по сумме площадей пиков, но с учетом коэффициентов пропорциональности.

Площадь каждого пика умножается на коэффициент пропорциональности, связанный с различной чувствительностью детектора к веществам. Заранее находят по стандартной хроматограмме К_i, приняв для одного К_i= 1.

метод внутреннего стандарта. Он основан на том, что готовят стандартную смесь, в которую вносят известное количество стандартного вещества и всех определяемых веществ. Выбирается стандартное вещество, имеющее время удерживания или объем удерживания отличные от этих же параметров веществ в смеси. Снимают стандартную хроматограмму и определяют коэффициенты пропорциональности определяемых веществ по отношению к стандарту. Далее в анализируемую смесь вносят известное количество стандартного вещества и снимают хроматограмму. Концентрация вещества находится по уравнению:

5. Капиллярная газовая хроматография.

В методе капиллярной хроматографии используют капиллярные колонки, в которые очень плотно набивается активная зона в виде зерен. Часто используют медные колонки, длина их достигает 300 метров. Совершенно очевидно, что набить эту колонку зернами невозможно. Активная зона наносится на внутренние стенки медной колонки, диаметр которой от 0,2 до 0,3 мм. Толщина слоя неподвижной фазы составляет от 0,1 до 0,3 микрометра.

Колонки чаще всего выполняются из металлов, иногда из благородных. Наибольшие успехи достигнуты при применении капиллярных стеклянных колонок, они имеют длину 50-100 м. Цена их составляет около 500 долларов.

Главное достоинство капиллярной хроматографии – очень высокое число теоретических тарелок, оно может достигать миллиона. Никакие другие колонки этого числа не дают.

В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы различают газовую, жидкостную и флюидную капиллярную хроматографию.

При исследовании неизвестного вещества можно получить хроматограмму, состоящую из большого числа пиков. Но идентифицировать удается лишь половину или треть веществ. Причина этого в отсутствии стандартов, необходимых для их идентификации. Надо отметить, что нет другого вида хроматографии, обладающего такими высокими разделительными способностями.

6. Разделяющая способность хроматографических колонок и её связь с условиями проведения процесса. Тарелочная теория в хроматографии.

1. Хроматографическая колонка разделена на ряд равных по высоте слоев, в каждом из которых устанавливается равновесие вещества между п.ф. н.ф.

2. Каждый слой принимают за теоретическую тарелку.

3. При перемещении п.ф. происходит перенос вещества на последующую тарелку, где устанавливается новое равновесие. Вещество распределяется на нескольких тарелках, причем концентрация его на средней тарелке максимальна.

7. Методы получения летучих соединений в хроматографии

Остановимся на одном из наиболее важных вопросов хроматографии – получение летучих соединений из нелетучих. Можно выделить три основных подхода:

а) вакуумная хроматография,

б) термодеструктивная хроматография,

в) химические реакции.

В вакуумной хроматографии газ-носитель поступает в колонки не из-за того, что его подают под давлением, а потому что на выходе колонки создают вакуум. Глубина вакуума не очень большая –5-10 мм ртутного столба. Это обеспечивает снижение температуры кипения веществ, примерно, на 100С, и таким образом расширяет возможности газохроматографического метода анализа.

В основе термодеструктивной хроматографии лежит разрушение нелетучих и малолетучих веществ в системе ввода пробы под действием высоких температур до более простых летучих соединений. Это возможно не во всех случаях, а лишь в тех, когда термодеструкция идет по какому-то определенному пути, т.е. когда получаются определенные вещества, или хотя бы одно вещество. Тогда по этому веществу можно хроматографировать.

Метод химических реакций является более аккуратным и употребимым методом получения летучих соединений и заключается в переводе анализируемого вещества в другое, более летучее соединение.

8. Качественный хроматографический анализ. Время и объём удерживания.

Качественный хроматографический анализ, т.е. индетификация вещества по его хроматограмме, может быть выполнен сравнением хроматограических характеристик, чаще всего удерживаемого объема (т.е. объема подвижной фазы, пропущенной через колонку от начала ввода смеси до появления данного компонента на выходе из колонки), найденных при определенных условиях для компонентов анализируемой смеси и для эталона.

При газохроматографическом исследовании непосредственно измеряемой ве-личиной является время удерживания данного компонента t, т.е. время, протекающее от момента ввода пробы в колонку до момента ее выхода из колонки, фиксируемого детектором. Если пик размывается, то обычно время удерживания отсчитывается до выхода максимума пика.

Время удерживания зависит и от объемной скорости газа-носителя (w), поэтому обычно в качестве хроматографической характеристики компонента смеси вводят понятие удерживаемы объем (VR). Удерживаемый объем данного компонента (VR) представляет объем газа-носителя, прошедший через колонку и детектор за время, необходимое для выхода этого компонента.

Вместо времени удерживания tR можно применять объем удерживания VR, пропорциональный времени удерживания:

VR = tR ∙ w

где w - объемная скорость газа-носителя.

Величины удерживаемых объемов используются для идентификации компонентов смеси при газохроматографическом анализе.

9. Детектирование и детекторы в хроматографии.

Важнейшим узлом газового хроматографа является детектор. Наиболее распространенным детектором, применяющимся в газовой хроматографии, является детектор по теплопроводности. Иногда его еще называют катарометр

Кроме катарометра разработано много других детекторов, основанных на целом ряде приемов и свойств. Среди них второй по значимости - детектор по ионизации пламени (ДИП).

ДИП-детектор обладает повышенной чувствительностью и позволяет анализировать органические вещества при их содержании в пробе 10-5 - 10-6 %

Третий по значимости - детектор по электронному захвату (ДЭЗ). Кроме этого применяют масс-спектрометрическое детектирование, оптическое детектирование для поглощающих газов и некоторые другие, но значительно реже Детектор по электронному захвату (ДЭЗ-детектор) не обязателен по комплектации прибора, но при желании прибор может быть им укомплектован. В ДЭЗ - детекторе имеется радиоактивный источник, и поэтому приобрести его можно только по специальному разрешению.

Достоинства ДЭЗ-детектора – очень высокая чувствительность к галоидопроизводным, что очень важно при определении многих хлорорганических пестицидов в окружающей среде и целого ряда других веществ

10. Схема газохроматографической установки, принцип её действия.

1-баллон с газом-носителем, чаще с азотом, гелием или аргоном,

2-система ввода пробы и испаритель,

3- термостат (в него помещена колонка), поддерживающий определенную температуру, выбранную для выполнения хроматографического процесса,

4- хроматографическая колонка,

5- детектор - важнейший узел, обычно совмещен с системой ввода пробы и помещен в термостат для поддержания постоянной температуры (для испарения пробы, или для того, чтобы она не сконденсировалась, выходя из хроматографической колонки на детектор),

6- делитель напряжения,

7- регистрирующая система, чаще всего это самопишущий прибор, выдающий хроматограмму на специальной хроматографической бумаге.

В хроматографическую колонку вносят анализируемую смесь. Далее колонка промывается газом носителем. Определяемые вещества, внесенные в хроматографическую колонку, могут распределяться между газовой и неподвижной фазами. Поскольку газовая фаза непрерывно движется, то вместе с ней движутся и определяемые вещества. Причем, чем больше времени молекулы данного вещества находятся в газовой фазе, тем быстрее это вещество выйдет из хроматографической колонки. И наоборот, чем меньше времени определяемое вещество находится в газовой фазе и больше в неподвижной фазе, тем медленнее это вещество будет выходить из колонки.

Время нахождения определяемого вещества в той или иной фазе зависит от коэффициента распределения его между газовой фазой и неподвижной фазой, который в свою очередь зависит от природы вещества и природы неподвижной фазы.

11. Подвижные и неподвижные фазы в хроматографии. Хроматографические материалы.

Первый тип фаз – это подвижные фазы. К ним относятся газы-носители. Наибольшее распространение получили водород, гелий и аргон. Основное требование к газам: они должны быть инертны к определяемым веществам и не должны неподвижно связываться неподвижной фазой. Неподвижные фазы представляют собой либо различные адсорбенты: уголь, полимеры различных неорганических материалов, которые работают по механизму адсорбции определяемых веществ на поверхности. В этом случае мы имеем дело с газо-адсорбционной газовой хроматографией.

Второй тип фаз – жидкие неподвижные фазы. Это различные вещества, жидкие даже при обычной температуре, и тем более при повышенной, нанесенные на поверхность инертных носителей. Носителями в данном случае служат, чаще всего, адсорбенты. Это различные природные карбонаты кальция, остатки водорослей, молотый кирпич, но наиболее распространены силикагель и полимеры, на поверхность которых наносится жидкая неподвижная фаза. Жидкая неподвижная фаза обычно представляет собой высококипящее органическое вещество, вязкое, малолетучее. Наиболее распространены среди этих веществ динонилфталат или высшие эфиры ортофталевой кислоты: динонил-, диоктил-, дидецилфталаты. Это жидкости, которые кипят при температуре 300–4000 С. Кроме этого, применяют полимерное вещество – полиэтиленгликоль (это жидкость) и различные силиконовые масла, например, полисилаксаны.

12. Ион-парная хроматография

В методе ионпарной хроматографии используются неподвижные фазы, которые чаще всего применяются для высокоэффективной жидкостной хроматографии. Это, как правило, твердый полимерный носитель либо неорганический носитель с привитой неподвижной фазой.

Ионпарная хроматография применяется, когда разделяемые вещества гидрофильны. Это обычно электролиты, например, алкилсульфаты либо четвертичные аммониевые соли, соли металлов, т.е. вещества, содержащие различные катионные и анионные группировки. Такого рода соединения не распределяются в неподвижную фазу. Для этой цели используют реагенты, которые образуют с разделяемыми веществами ионные пары. Например, это имеет место в золотопромышленности, где надо разделить цианидные комплексы серебра, меди, цинка, никеля, кобальта. В качестве реагента используют катион тетрабутиламмония, который в водной фазе соединений с цианидными комплексами металлов не образует. Однако, на границе вода - неподвижная фаза образуется ионный ассоциат, который переходит в неподвижную фазу. Процесс описывается константой экстракции ионного ассоциата, которая строго в согласии с законом действия масс равна отношению равновесной концентрации ионного ассоциата к произведению концентраций ионов в водной фазе.

Детектирование осуществляют методом электропроводности либо оптическим методом, если разделяемые вещества поглощают излучение в какой-либо области. Иногда при работе с оптическим детектором в качестве реагента вводят оптическую метку – краситель.

13. Эксклюзионная хроматография

Особым видом хроматографии является эксклюзионная хроматография, которая основана на распределении разделяемых веществ между растворителем, находящимся в порах неподвижной фазы и тем же растворителем, выступающим в качестве подвижной фазы. На первый взгляд это не имеет смысла, но это не так. Дело в том, что молекулы, диаметр которых меньше диаметра пор неподвижной фазы попадают в эти поры и задерживаются в них. Молекулы большего размера не могут попасть в эти поры и проходят вместе с растворителем, т.е. не задерживаются.

Эксклюзионная хроматография условно подразделяется на два вида.

Первый вид эксклюзионной хроматографии - это гель-проникающая хроматография, основанная на использовании полимеров, набухающих в органических растворителях. Подвижной фазой, в этом случае тоже является органический растворитель.

Другой разновидностью является гель-фильтрационная хромаграфия. В гель-фильтрационной хроматографии в качестве неподвижной фазы используются полимеры, набухающие в воде. Вода используется и в качестве подвижной фазы. Особенностью этого варианта хроматографии является то, что коэффициенты распределения всех веществ строго укладываются в диапазон от 0 до 1. Коэффициент распределения выше 1 быть не может.

Для малых молекул D = 1, и формула V R = Vm + D Vs примет следующий вид:

V R = Vm + Vs (13)

Здесь максимальное увеличение объема удерживания для этих молекул может составлять лишь Vs, т.е. объем растворителя в порах. Вещества при этом вышли не разделившись.

Для больших молекул коэффициент распределения D = 0, при этом VR = Vm, т.е. вещества тоже вышли не разделившись. Разделятся те вещества, для которых D i лежит в диапазоне от 0,1- 0,2 до 0,5-0,8, т.е. довольно узкий диапазон для разделения.

Наиболее часто эксклюзиввная хроматография или гель-хроматография применяются для разделения полимеров и олигомеров. Причем, для разделения белковых веществ применяют гель-фильтрационную хроматографию, для разделения водонерастворимых полимеров – гельпроникающую.

Дата добавления: 2015-09-30